Search

Recherche Page web : https://www.college-de-france.fr/evolution-and-development-of-germ-cells. Publications Rubin T., Macaisne N. et Huynh J.-R., « Mixing and matching chromosomes during female meiosis », Cells, vol. 9, no 3, 2020, art. 696, https://doi.org/10.3390/cells9030696. Vallés A.M. et Huynh J.-R., « Isolation of stage-specific germ cells using FACS in Drosophila germarium », Methods in Cell Biology, vol. 158, 2020, p. 11-24, https://doi.org/10.1016/bs.mcb.2020.02.003. Hatkevich T., B...

In recent decades, the incidence of reproductive function abnormalities has increased. These defects are believed to be due to the exposure of organisms to a wide range of environmental contaminants such as bisphenol A (BPA). Experimental studies have shown that fetal development is a highly sensitive window to the exposure to these substances. Indeed, it is during this period that the germ line is set up and differentiated. Thus, complex and highly regulated molecular mechanisms come into play in order to transform a non-functional precursor cell into a germ cell that differentiates into a highly specialized haploid gamete. In females, one of the first illustrations of this germline differentiation is the initiation of the first division of meiosis (meiosis I) during fetal life leading to the production of a haploid and fertilizable oocyte in adulthood. Prophase I of meiosis (initiation and progression) is a period of extreme sensitivity to environmental contaminants such as bisphenol A (BPA) leading to irreversible defects in adulthood. Regarding the reprotoxicity of BPA, it has recently been banned from food containers. However, we remain exposed to other structural analogues whose germ cell is unknown. Thus, the purpose of this work is to explore the effects of fetal exposure to two bisphenols, BADGE and BPAF, on mammalian germ cells, particularly on oocytes and their precursors, but also to understand the mechanisms involved in the response to exposure. To do this, we exposed pregnant mice to bisphenols in drinking water during the second half of gestation. Ovarian analysis shows that exposure to bisphenols induces oocyte depletion, formation of multiovocyte follicles and increases aneuploid oocyte and chiasmas levels. Like BPA, BADGE and BPAF cause meiotic defects such as delayed initiation and progression to meiosis. This is also observed in the human fetal ovary studied using the human fetal gonad xenograft model developed by our laboratory, which allows long-term exposure to bisphenols. Male germ cells also have a differentiation time delay characterized by a delay in entering the quiescence phase.These delays appear to be correlated with the alteration of expression and/or mRNA splicing of meiotic genes at the beginning of the meiotic program. These defects seem to be the consequence of oxidative DNA damage induced by bisphenols in precursor germ cells. Similarly, we have observed that in the absence of OGG1, a DNA glycosylase involved in the repair of 8-oxoguanine, the differentiation phase is delayed regardless of gender.All in all, these results provide further proof that fetal exposure to bisphenols impairs reproductive functions at adulthood, probably as a consequence of oxidative stress generation in germ cells., Au cours de ces dernières décennies, les anomalies liées à la fonction de reproduction ont vu leur incidence augmenter. Ces défauts seraient dus à l’exposition des organismes à une large panoplie de contaminants environnementaux tels que le bisphénol A (BPA). Les études expérimentales ont montré que le développement fœtal constitue une fenêtre d’exposition extrêmement sensible à ces substances. En effet, c’est au cours de cette période que s’effectue la mise en place de la lignée germinale ainsi que sa différenciation. Ainsi, des mécanismes moléculaires complexes et hautement régulés entrent en jeu afin de faire d’une cellule précurseur non fonctionnelle une cellule germinale qui se différencie pour former un gamète haploïde hautement spécialisé. Chez la femelle, une des premières illustrations de cette différenciation germinale est l’initiation de la première division de méiose (méiose I) pendant la vie fœtale conduisant à l’obtention d’un ovocyte haploïde et fécondable à l’âge adulte. La prophase I de méiose (initiation et progression) est une période d’extrême sensibilité aux contaminants environnementaux tels que le bisphénol A (BPA) induisant des défauts irréversibles à l’âge adulte. Au regard de sa reprotoxicité, l’utilisation du BPA a été récemment interdite dans les contenants alimentaires. Toutefois, nous restons exposés à d’autres analogues structuraux dont on ignore tout de leur toxicité sur les cellules germinales. Ainsi, le but de ce travail est d’explorer les effets d’une exposition fœtale à deux bisphénols, le BADGE et le BPAF sur les cellules germinales de mammifères, en particulier sur les ovocytes et leurs précurseurs, mais également de comprendre les mécanismes mis en jeu.Pour cela, nous avons exposé des souris gestantes aux bisphénols dans l’eau de boisson pendant la seconde moitié de la gestation. L’analyse des ovaires montre que l'exposition aux bisphénols induit une déplétion ovocytaire, une formation de follicules multiovocytaires et augmente les taux d'ovocytes aneuploïdes et de chiasmas. Comme le BPA, le BADGE et le BPAF provoquent des défauts méiotiques tels qu'un retard de l'initiation et la progression en méiose. Ceci est également observé dans l'ovaire fœtal humain, étudié grâce au modèle de xénogreffe de gonades fœtales humaines développé par notre laboratoire et qui permet une exposition à long terme aux bisphénols. Les cellules germinales mâles présentent de même un délai de différenciation caractérisé par un retard d’entrée en phase de quiescence.Ces retards semblent être corrélés à l'altération de l'expression et/ou de l'épissage d’ARNm de gènes méiotiques au début du programme méiotique. Ces défauts semblent être dus à des dommages oxydatifs de l'ADN induits par les bisphénols dans les cellules précurseurs. De même, nous avons observé qu'en l'absence d'OGG1, une ADN glycosylase impliquée dans la réparation de la 8-oxoguanine, la phase de différenciation est retardée quel que soit le sexe.Dans l'ensemble, ces résultats montrent que l'exposition fœtale aux bisphénols altère les fonctions reproductrices à l'âge adulte, probablement en raison de la génération de stress oxydant dans les cellules germinales.

For species survival, the germline must faithfully transmit genetic information to the progeny. Transposable elements (TEs) constitute a significant threat to genome stability due to their capacity to move. In higher eukaryotes, TEs make up a large fraction of the genome, accounting for 20% of the Drosophila genome and more than 45% of the Human genome. In the metazoan gonads, their expression and so their mobilization is limited by a class of small RNAs called PIWI-interacting RNAs (piRNAs) produced by dedicated genomic loci called piRNA clusters that are expressed in a tissue-specific manner. piRNA clusters are composed of a multitude of TEs either full length or truncated that represent the repertoire of TEs that the cell must repress to maintain the stability of its genome. However, a reactivation of endogenous retroviruses, a particular class of TEs, in somatic tissue adjacent to germ cells, promotes its infection and invasion of the germ line as a virus would do. Although the piRNA pathway is an efficient genomic immunity system, it remains unclear how the germline gains protection against a new transposon invasion. The objective of my thesis was to follow the impact of a TE neo-invasion from an adjacent somatic tissue towards the germ line. For this study, I used the ZAM endogenous retrovirus from Drosophila melanogaster as a model. I investigated i) the strategies developed by ZAM to invade the germ cells ii) the consequences of an endogenous retrovirus reactivation and iii) the defense mechanisms developed by germ cells to counteract ZAM invasion and to protect the germline genome from a massive transposition that could endanger the survival of the species. My results revealed for the first time that piRNAs produced locally, in germ cells, act at the tissue scale and thus protect the germ line from an external attack.; Pour la survie des espèces, la lignée germinale doit transmettre fidèlement l'information génétique à la descendance. Les éléments transposables (ETs) sont des séquences d’ADN mobiles qui constituent une menace importante pour la stabilité des génomes. Les ETs constituent une fraction importante du génome des eucaryotes supérieurs, ils représentent 20% du génome de la drosophile et plus de 45% du génome humain. Dans les gonades des métazoaires, la mobilisation des ETs est contrôlée par une classe spécifique de petits ARNs, appelés piARNs, qui interagissant avec les protéines de la famille PIWI. Les piARNs sont produits à partir de loci génomiques dédiés, appelés clusters de piARNs, exprimés de manière tissu-spécifique. Les clusters de piARNs sont composés d'une multitude d’ETs, pleine longueur ou bien tronqués, qui représentent le répertoire des ETs que la cellule peut réprimer afin de maintenir la stabilité de son génome. Cependant, il existe au sein des génomes une classe particulière d’ETs, les rétrovirus endogènes, qui lorsqu’ils sont réactivés dans les tissus somatiques adjacents aux cellules germinales, peuvent envahir les cellules germinales, comme le ferait un virus. Bien que la voie des piARNs soit un système immunitaire génomique efficace pour contrôler la transposition des ETs exprimés dans les cellules germinales, les mécanismes développés par la lignée germinale pour se protéger face à une nouvelle invasion d’ET restent mal connus. Pour lever ce verrou scientifique, durant ma thèse j’ai étudié l’invasion des cellules germinales par un rétrovirus endogène présent dans le génome de Drosophila melanogaster : ZAM. L’objectif du projet visait à étudier i) les stratégies mises en place par ZAM pour envahir les cellules germinales ii) les conséquences d’une réactivation d’un rétrovirus endogène et iii) les mécanismes de défense mis en place par les cellules germinales pour contrer cette invasion et ainsi protéger le génome germinal d’une transposition massive qui pourrait mettre en danger la survie même des espèces. Mes résultats ont permis de révéler pour la première fois que les piRNAs produits localement, dans les cellules germinales, peuvent agir à l'échelle tissulaire.

Most of transgender people plan to have a family but their fertility may be affected by gender affirmation. Hormone therapy can permanently affect gamete production, especially in trans women. Sex reassignment surgery leads to permanent sterility. In France, networks of health professionals have been organized and recommend access to fertility preservation for trans people. However, gamete collection is often difficult due to hormonal incongruence for trans women or to the invasive nature of the procedure for trans men. Future studies are required to assess the use of self-preserved gametes by trans people.Préservation de la fertilité chez les personnes transgenres.La majorité des personnes transgenres envisage de fonder une famille, mais leur fertilité peut être altérée par l’affirmation du genre. L’hormonothérapie peut affecter durablement la production de gamètes, notamment chez les femmes trans. La chirurgie de réassignation sexuelle entraîne une stérilité définitive. En France, des réseaux de professionnels de santé se sont organisés. Ils recommandent l’accès à la préservation de la fertilité dans le cadre de la transidentité. Cependant, le recueil de gamètes reste souvent difficile en raison de l’incongruence hormonale pour les femmes trans, ou du caractère invasif de la procédure pour les hommes trans. De futures études permettront de statuer sur l’utilisation des gamètes autoconservés.

Inter-species chimeras are both fantastic and monstrous creatures from Greek or Egyptian mythology, and a long-established research tool. Recent advances in the field of pluripotent stem cells have made it possible to extend the repertoire of inter-species chimeras to "systemic" chimeras, in which the mixing of cells from both species involves all organs including the germline. These chimeric embryos and fetuses open up new research avenues and potential medical applications. We will review the latest advances in the field. We will discuss the concepts of developmental complementation and developmental equivalence. We will discuss the methodological hurdles to be unlocked, as well as the biological and ethical limits of these new technologies.Les chimères « systémiques » homme/animal.Les chimères inter-espèces sont à la fois les créatures fantastiques et monstrueuses des mythologies grecque ou égyptienne, et un outil de recherche établi de longue date. Des avancées récentes dans le domaine des cellules souches pluripotentes ont permis d’élargir le répertoire des chimères inter-espèces aux chimères « systémiques » dans lesquelles le mélange des cellules des deux espèces concerne tous les organes, y compris la lignée germinale. Ces embryons et fœtus chimériques ouvrent de nouvelles voies de recherches et des applications médicales potentielles. Dans cette revue, nous ferons le point sur les dernières avancées dans ce domaine. Nous discuterons les concepts de complémentation et d’équivalence développementale. Nous évoquerons également les verrous méthodologiques à débloquer, ainsi que les limites biologiques et éthiques de ces nouvelles techniques.

Since the last decennials, fertility is decreasing in industrial countries, and nowadays, infertility reaches a prevalence of 9 to 18% of the general population, with a significant proportion of cases being due to defective gametogenesis. Accordingly, fertility preservation raises a growing concern. Nowadays, a growing number of couples undergo Assisted Reproductive Technology with little success due to the lack of knowledge on mechanisms orchestrating germ cell differentiation. Little is known about how primordial germ cells become gametogenesis-competent cells (gonocytes), because of the lack of suitable physiological models. Primordial germ cells give rise to the next generation by differentiating from pluripotent progenitors into highly specialized cells, the gametes, which in turn generate a totipotent zygote after fertilization. After specification in the early embryo, primordial germ cells colonize the gonad, lose pluripotency and gain their capacity for irreversible sexual differentiation. Gonocytes then become either female (oogonia) or male (spermatogonia), and eventually progress into meiotic divisions. So far, the mechanisms of germ cell changes in potency remain largely elusive.My host laboratory has demonstrated that activation of the canonical WNT/β-catenin signalling is required for ovarian development. Thus, absence of WNT/β-catenin activation eventually triggers defects in germ cell proliferation and sexual differentiation. However, genetic models of cell-specific ablation of Ctnnb1 (encoding β-catenin) were still missing to assess the contribution of WNT/β-catenin in the germ cells. We decided to analyse the role of this signalling pathway by generating specific mouse models for β-catenin loss or gain of function and by investigating the consequences of WNT/β-catenin deregulation in either the somatic or the germ cells of the developing gonad. We first demonstrated that WNT/β-catenin regulates spermatogonial stem cell proliferation and differentiation in the post-natal testis, demonstrating that this signalling activity must be finely tuned over time to ensure spermatogenesis.Secondly, we showed that genetic elimination of Ctnnb1 in mouse primordial germ cells in vivo leads to a precocious loss of pluripotency and to premature germ cell differentiation into gonocytes. We demonstrated, for the first time in vivo, that while ovarian development is getting forward, β-catenin forms proteic complexes containing POU5F1 and CDH1 that transit from the nucleus of the germ cells to their membrane, thus allowing primordial germ cells to exit pluripotency and eventually differentiate. Our results also reveal that the ZNRF3 E3-ubiquitine ligase negatively regulates germ cell exit from pluripotency through a negative feedback loop.Collectively, our results show that the WNT/β-catenin signalling is necessary for determining the proper window of differentiation in both somatic and germ cells. Moreover, WNT/β-catenin controls the germ cell exit from pluripotency through β-catenin non-transcriptional activity, eventually coordinating the development of the different cell types of the fetal ovary. In the future, our results might help to recapitulate gametogenesis in vitro.; La préservation de la fertilité suscite une inquiétude croissante. Depuis les dernières décennies, la fertilité a diminué dans les pays industrialisés. En conséquence, un nombre croissant de couples a recours à la procréation médicalement assistée, sans grand succès par manque de connaissances sur les cellules reproductrices (cellules germinales). L’étude de ces cellules constitue un socle essentiel pour des applications médicales, mais jusqu’à présent, les mécanismes moléculaires qui régissent leur développement restent peu compris en raison de l’absence de modèles d'étude physiologiques.Les cellules germinales sont produites au cours du développement embryonnaire, se multiplient pour constituer un stock suffisant, se différencient dans la gonade en fonction du sexe de l'embryon, puis entrent en méiose pour devenir des gamètes fertiles, les ovocytes (femelles) et les spermatozoïdes (mâles). Mon laboratoire d’accueil a démontré que la voie de signalisation canonique WNT/β-catenin est nécessaire au développement de l'ovaire in vivo et qu'en absence d'activation de cette voie dans l'ovaire embryonnaire de souris, la prolifération et la différenciation des cellules germinales primordiales sont perturbées.Tirant partie de notre expertise dans l'analyse de modèles de différenciation gonadique, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'action de la voie WNT/β-catenin dans la différenciation des cellules germinales, en analysant au moyen de modèles murins de perte et gain de fonction de β-catenin les conséquences de la modification de son expression dans les cellules de la gonade.Dans un premier temps, nous avons démontré que le maintien, après la naissance, de l'activité de la voie WNT/β-catenin dans les cellules souches spermatogoniales du testicule de souris stimule leur prolifération de manière massive, provoquant un défaut de différenciation en spermatozoïdes. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l'ablation génétique du gène Ctnnb1 (codant pour β-catenin) dans les cellules germinales primordiales in vivo entraîne une perte précoce de leur pluripotence et une différenciation prématurée en ovogonies. Nous avons démontré, pour la première fois in vivo, que tandis que le développement ovarien progresse, β-catenin forme des complexes protéiques avec POU5F1 et CDH1 qui transitent du noyau des cellules germinales à leur membrane, permettant ainsi leur sortie de pluripotence et leur différenciation. Nos résultats indiquent que l'E3-ubiquitine ligase ZNRF3 régule la pluripotence des cellules germinales par une boucle de rétroaction négative.Ces données indiquent que dans l'ovaire comme dans le testicule, une régulation fine de l'activité de la voie de signalisation WNT/β-catenin est requise pour déterminer la fenêtre de différenciation des cellules germinales primordiales in vivo. De plus, la voie WNT/β-catenin contrôle la sortie de pluripotence des cellules germinales primordiales via une activité non-transcriptionnelle de β-catenin, permettant à terme de coordonner le développement des cellules somatiques et germinales de la gonade. Dans les années à venir, nos travaux pourraient aider à la génération des gamètes in vitro.

Since the last decennials, fertility is decreasing in industrial countries, and nowadays, infertility reaches a prevalence of 9 to 18% of the general population, with a significant proportion of cases being due to defective gametogenesis. Accordingly, fertility preservation raises a growing concern. Nowadays, a growing number of couples undergo Assisted Reproductive Technology with little success due to the lack of knowledge on mechanisms orchestrating germ cell differentiation. Little is known about how primordial germ cells become gametogenesis-competent cells (gonocytes), because of the lack of suitable physiological models. Primordial germ cells give rise to the next generation by differentiating from pluripotent progenitors into highly specialized cells, the gametes, which in turn generate a totipotent zygote after fertilization. After specification in the early embryo, primordial germ cells colonize the gonad, lose pluripotency and gain their capacity for irreversible sexual differentiation. Gonocytes then become either female (oogonia) or male (spermatogonia), and eventually progress into meiotic divisions. So far, the mechanisms of germ cell changes in potency remain largely elusive.My host laboratory has demonstrated that activation of the canonical WNT/β-catenin signalling is required for ovarian development. Thus, absence of WNT/β-catenin activation eventually triggers defects in germ cell proliferation and sexual differentiation. However, genetic models of cell-specific ablation of Ctnnb1 (encoding β-catenin) were still missing to assess the contribution of WNT/β-catenin in the germ cells. We decided to analyse the role of this signalling pathway by generating specific mouse models for β-catenin loss or gain of function and by investigating the consequences of WNT/β-catenin deregulation in either the somatic or the germ cells of the developing gonad. We first demonstrated that WNT/β-catenin regulates spermatogonial stem cell proliferation and differentiation in the post-natal testis, demonstrating that this signalling activity must be finely tuned over time to ensure spermatogenesis.Secondly, we showed that genetic elimination of Ctnnb1 in mouse primordial germ cells in vivo leads to a precocious loss of pluripotency and to premature germ cell differentiation into gonocytes. We demonstrated, for the first time in vivo, that while ovarian development is getting forward, β-catenin forms proteic complexes containing POU5F1 and CDH1 that transit from the nucleus of the germ cells to their membrane, thus allowing primordial germ cells to exit pluripotency and eventually differentiate. Our results also reveal that the ZNRF3 E3-ubiquitine ligase negatively regulates germ cell exit from pluripotency through a negative feedback loop.Collectively, our results show that the WNT/β-catenin signalling is necessary for determining the proper window of differentiation in both somatic and germ cells. Moreover, WNT/β-catenin controls the germ cell exit from pluripotency through β-catenin non-transcriptional activity, eventually coordinating the development of the different cell types of the fetal ovary. In the future, our results might help to recapitulate gametogenesis in vitro., La préservation de la fertilité suscite une inquiétude croissante. Depuis les dernières décennies, la fertilité a diminué dans les pays industrialisés. En conséquence, un nombre croissant de couples a recours à la procréation médicalement assistée, sans grand succès par manque de connaissances sur les cellules reproductrices (cellules germinales). L’étude de ces cellules constitue un socle essentiel pour des applications médicales, mais jusqu’à présent, les mécanismes moléculaires qui régissent leur développement restent peu compris en raison de l’absence de modèles d'étude physiologiques.Les cellules germinales sont produites au cours du développement embryonnaire, se multiplient pour constituer un stock suffisant, se différencient dans la gonade en fonction du sexe de l'embryon, puis entrent en méiose pour devenir des gamètes fertiles, les ovocytes (femelles) et les spermatozoïdes (mâles). Mon laboratoire d’accueil a démontré que la voie de signalisation canonique WNT/β-catenin est nécessaire au développement de l'ovaire in vivo et qu'en absence d'activation de cette voie dans l'ovaire embryonnaire de souris, la prolifération et la différenciation des cellules germinales primordiales sont perturbées.Tirant partie de notre expertise dans l'analyse de modèles de différenciation gonadique, nous nous sommes intéressés au mécanisme d'action de la voie WNT/β-catenin dans la différenciation des cellules germinales, en analysant au moyen de modèles murins de perte et gain de fonction de β-catenin les conséquences de la modification de son expression dans les cellules de la gonade.Dans un premier temps, nous avons démontré que le maintien, après la naissance, de l'activité de la voie WNT/β-catenin dans les cellules souches spermatogoniales du testicule de souris stimule leur prolifération de manière massive, provoquant un défaut de différenciation en spermatozoïdes. Dans un deuxième temps, nous avons montré que l'ablation génétique du gène Ctnnb1 (codant pour β-catenin) dans les cellules germinales primordiales in vivo entraîne une perte précoce de leur pluripotence et une différenciation prématurée en ovogonies. Nous avons démontré, pour la première fois in vivo, que tandis que le développement ovarien progresse, β-catenin forme des complexes protéiques avec POU5F1 et CDH1 qui transitent du noyau des cellules germinales à leur membrane, permettant ainsi leur sortie de pluripotence et leur différenciation. Nos résultats indiquent que l'E3-ubiquitine ligase ZNRF3 régule la pluripotence des cellules germinales par une boucle de rétroaction négative.Ces données indiquent que dans l'ovaire comme dans le testicule, une régulation fine de l'activité de la voie de signalisation WNT/β-catenin est requise pour déterminer la fenêtre de différenciation des cellules germinales primordiales in vivo. De plus, la voie WNT/β-catenin contrôle la sortie de pluripotence des cellules germinales primordiales via une activité non-transcriptionnelle de β-catenin, permettant à terme de coordonner le développement des cellules somatiques et germinales de la gonade. Dans les années à venir, nos travaux pourraient aider à la génération des gamètes in vitro.

Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation.; Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose.

Cryoconservation of gametes : how to perform ? The patients can preserve their gametes when they are exposed to potential gonadotoxic pathology or treatment. In this context, the French bioethical law clearly states the obligation to inform the patients about the risks for their fertility and the possibilities to cryopreserve their gametes. Regional platforms of fertility preservation allow notably for the coordination of the oncology teams and the CECOS. For the men, sperm freezing is achieved by a slow and controlled temperature protocol. For the women, the oocytes are usually vitrified after hormonal stimulation and ovarian punction. For both, the gametes are cryopreserved in straws and stored in liquid nitrogen until use in assisted reproductive treatment (ART). Each year, the CECOS keeping the gametes interrogates patients on their wish to continue, or not, the cryoconservation. The gametes can only be used in ART by the patients only during their lifetime and with their consent, without alterations related to the duration of storage.Conservation des gamètes : quelles modalités ? Les patient(e)s peuvent conserver leurs gamètes lorsqu’ils( ou elles) sont exposé(e)s à une pathologie ou un traitement potentiellement gonadotoxique. Dans ce contexte, la loi de bioéthique énonce très clairement l’obligation d’informer les patients des risques pour leur fertilité et des possibilités de conservation de leurs gamètes. Les plateformes régionales de préservation de la fertilité assurent la coordination entre les équipes d’oncologie et les centres d’étude et de conservation des oeufs et du sperme humains (CECOS) pour la mise en oeuvre de cette préservation. Pour les hommes, la congélation des spermatozoïdes est réalisée par une descente en température lente et contrôlée. Pour les femmes, la cryoconservation des ovocytes se fait par vitrification après stimulation hormonale et ponction ovarienne. Dans les deux cas, les gamètes sont conservés dans des paillettes qui sont stockées dans une cuve d’azote liquide jusqu’à utilisation en assistance médicale à la procréation (AMP). Le CECOS conservant les gamètes interroge chaque année par courrier les patients concernés sur leur souhait de poursuivre, ou non, la cryoconservation. Les gamètes pourront être utilisés en AMP par les patients de leur vivant et après leur consentement, sans altération liée à la durée de stockage.

National audience; Development of genetic testing direct-to-consumer (DTC) for recreational purposes, although prohibited in France, is a real challenge to the current practice of gamete donation. Indeed, anonymity is a fundamental principle contributing to the ethics of donation. This principle is weakened due to the availability to the general public of these tests on the Internet. Several thousands of people are conceived by gamete donation worldwide, some of whom do not know how they were conceived. Gamete donors should be informed that their anonymity is no longer guaranteed, as they can be found by homologies of their DNA, or that of a parent or a child, potentially available in databases. Thus, adults conceived by gamete donation but not informed by their parents can discover their way of conception. Recipients of gamete donation should also be informed that their child's DNA will establish the biological discrepancy and they should be encouraged to disclose the conception to their child. Several countries now allow children conceived by donation to obtain donor's identity. In France, the Bioethics Law is currently being finalized and will now allow access to donor's identity for people conceived by gamete donation.

Today many heterosexual couples, as well as single women and lesbian couples, use gamete donation in France or abroad in order to fulfil their desire for a child. The construction of parenthood in these conditions raises many questions and requires specific psychological work in order to reflect on issues surrounding genetic transmission, the establishment of the bond and the appropriation of parenthood. Furthermore, what is the future of the children conceived by donation?

The current conditions of gamete donation in france. Law of bioethics and assisted reproductive technology legislation control gamete donation in France. Candidates for the gamete donation are still too few to date, not allowing to meet the needs of couples receiving gametes on French territory. This shortage leads to significant waiting times for these couples. The information provided to the candidates of gamete donation (oocytes and spermatozoa) is channeled through general practitioners as foreseen by the law. A good knowledge of recruitment rules for candidates and of the attribution conditions of the gamete donations allows the practitioners to disseminate the information and to support the recruitment of new candidates.Conditions actuelles du don de gamètes en France. Le don de gamètes en France est réglementé par la loi de bioéthique ainsi que par le guide de bonne pratique en assistance médicale à la procréation. Les candidats au don de gamètes sont à ce jour encore trop peu nombreux, ne permettant pas de répondre aux besoins des couples receveurs de don de gamètes sur le territoire français. Cette pénurie entraîne des délais d’attente importants pour ces couples. L’information des candidats au don de gamètes (ovocytes et spermatozoïdes) passe par les médecins traitants comme le prévoit la loi. Une bonne connaissance des règles de sélection des candidats ainsi que des conditions d’attribution des dons de gamètes permet aux praticiens de diffuser l’information et d’aider au recrutement de nouveaux candidats.

Infertility represents a major public health problem and concerns 10 to 15% of couples in the general population. A male factor is responsible for the infertility of the couple in about half of all cases. In approximately 30% of them, the etiology remains unexplained.The first working axis concerned the molecular study of a cohort of infertile patients (nonobstructiveazoospermia/ cryptozoospermia and disorder of the sex development or DSD) for whom analyses of standard karyotype and/or microdeletions of AZF regions were not able to explain the phenotype. The impact of copy number variations of DNA (CNVs) detected by comparative genomic hybridization (CGH-array) is poorly documented. A custom design 400K micoarray, genome-wide and enriched on a wide panel of 445 genes linked with infertility and DSD has been achieved. This array allowed the identification of 171 CNVs of interest.These results underline the potential of this design for diagnosis of male infertility. The second objective of this work was the in vitro modelisation of male infertility in a context of genetic abnormality. For that purpose, human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were generated from erythroblasts by means of not integrative Sendaï virus, in two patients carrying genetic abnormalities (complex chromosomal rearrangement and 46,XX-SRY negative karyotype associated with AMH gene mutation). Secondly, functionality of hiPSCs generated was tested by germ cells in vitro differentiation. Primordial germ cell (PGC) stage was successfully obtained. Cells expressed key PGC markers such as SOX17. The perspectives of this work will be to continuethe germinal differentiation towards more mature stages and so to be able studying the meiotic process in a context of genetic abnormality.; L’infertilité représente un problème majeur de santé publique en concernant 10 à 15% des couples en âge de procréer. Un facteur masculin est responsable de l’infertilité du couple dans près de la moitié des cas. Pour environ 30% d'entre eux, l'étiologie reste inexpliquée. Le premier axe du travail a concerné l’étude moléculaire d’une cohorte de patients infertiles (azoospermie non-obstructive/cryptozoospermie ou désordre du développement sexuel ou DSD) pour lesquels les analyses du caryotype standard et/ou des microdélétions des régions AZF par PCR n’ont pas permis d’expliquer le phénotype. L'impact des variations de nombre de copies de l'ADN (CNV) détectées par l'hybridation génomique comparative sur puce à ADN est peu documenté. Un design personnalisé de puce à ADN de format 400K, pangénomique et enrichi sur un large panel de 445 gènes liés à l'infertilité et à un DSD a été développé. Cette puce a permis l’identification de 171 CNV d’intérêt. Ces résultats soulignent l’intérêt de ce design comme outil diagnostic dans le cadre du bilan de l’infertilité masculine. Le second axe du travail a été de modéliser l’infertilité masculine in vitro dans un contexte d’anomalie génétique. Des cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPS) ont été générées à partir d’érythroblastes de deux patients infertiles porteurs d’un remaniement chromosomique complexe ou d’un caryotype 46,XX-SRY négatif avec mutation du gène de l’AMH. Dans un deuxième temps, la fonctionnalité des lignées de cellules hiPS générées a été testée par différenciation in vitro en cellules germinales primordiales (CGP). Elles expriment les marqueurs clés du stade CGP dont SOX17, le déterminant germinal le plus précoce des CGP. Les perspectives de ce travail seront de poursuivre la différenciation germinale vers des stades plus matures et ainsi de pouvoir étudier le processus méiotique dans un contexte d’anomalie génétique.

The performance of the molecular tool using CRISPR-Cas9, which makes it possible to induce targeted modifications of the DNA, has found numerous applications in research and open promising prospects in human clinic. CRISPR-Cas9 has been widely used to generate transgenic animals after targeted modification of the genome at the zygotic stage. It was also tested on human embryos on an experimental basis. Although there are potential medical indications that may justify a targeted modification of the embryo or germ cell genome, the uncertainties regarding the efficacy and safety of the method do not allow us to consider implementing such germline gene therapy in the short-term. However, it is necessary to weigh the scientific and ethical issues involved in this approach.

French law lies down a principle of anonymity of donated gametes. This principle is ignored by English law. Moreover, English law has established, few years ago, the contrary principle: the one of transparency of the donor's identity. This study of English law reports this evolution and its consequences.

The anonymity of the donor of gametes is a principle required by the bioethics laws and confirmed by the judges, within the framework of medical help to procreation. It is disputed by the children born after a donation. The rule of the secrecy knows however already particular installations, it is consequently relevant to see to which extent a parallel could be considered for the newborns from such a donation. This principle of anonymity is not absolute and can be opposite to the person in identity search, several legal bases can be exploited for this purpose.

The summit organised in early December 2015 considered in depth the various issues (technical, scientific, societal and ethical) raised by the prospect of genome editing using the extremely effective CRISPR system. Germline editing (for therapeutic or "enhancement" purposes) was stated to be irresponsible under current conditions, but the possibility that this could be considered in the future was not excluded; a mechanism for monitoring progress and possibly revising recommendations was proposed.

Some transsexual persons wish to have their gametes frozen before gender transition, in order to preserve their fertility. This measure should be carried out, in strict compliance with the law, in case of orchidectomy, oophorectomy or hysterectomy However, as hormonal treatments do not irreversibly alter gonadal function, the reproductive capacity of trans-sexual persons can be maintained by avoiding surgical sterilization. There is therefore no obvious medical indication for cryopreserving gametes or germinal tissue in the absence of surgical sterilization. Moreover, the use of such cryopreserved gametes would, in principle, be considered mainly by a same-sex couple, something that French law currently prohibits. Regardless of these legal aspects, the issues surrounding the use of cryopreserved gametes, and its consequences, must not be ignored. If transsexual persons who are already parents may find ways of managing the change in both their personal and parental identity, the use of gametes stored prior to gender transition raises issues of identity whose consequences are difficult to assess, especially for the future child. Cryopreservation of gametes or germinal tissue cannot be undertaken without first considering whether their potential use is in keeping with what is, at present, medically and legally possible. In any case, it is up the physician to decide, on a case by case basis, whether or not to implement cryopreservation, taking into account the situation of the persons who request the procedure and their plans for parenthood.