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La fabrication de tissus biologiques a été largement étudiée pour ses applications dans la recherche, la transplantation d'organes et le dépistage de drogues. Bien que des tissus minces ou avasculaires aient été fabriqués avec succès auparavant, le maintien de la viabilité des tissus épais nécessite la présence d'un réseau capillaire tout au long de la construction pour permettre l'apport de nutriments et l'élimination des déchets cellulaires par le sang. En plus des cellules endothéliales, l'incorporation de types de cellules de soutien dans le réseau capillaire est nécessaire pour favoriser la survie et la maturation. Comparée à d'autres méthodes de biofabrication, la bioimpression est une technologie prometteuse qui permet la fabrication précise de motifs 3D complexes à haute résolution spatiale. Nous avons conçu de nouveau notre procédé technique de bio-impression laser nommé LIST (de l'anglais \textit{laser-induced side transfer}) dans laquelle la bioencre de la suspension cellulaire passe à travers un capillaire horizontal avec un orifice face à l'échafaudage. Lorsque le laser frappe la bioencre, une bulle se forme qui propulse une gouttelette à travers l'orifice. Nous avons mené une étude détaillée pour caractériser cette bio-impression technique et validé sa cytocompatibilité par l'évaluation de la viabilité de HUVECs imprimés grâce à LIST. Nous avons incorporé des fibroblastes et des péricytes dans nos échantillons et observé le recrutement progressif de ces cellules par les structures de type capillaire HUVEC imprimées sur Matrigel. Des images fluorescentes ont été analysées pour quantifier le recrutement de fibroblastes/péricytes au fil du temps., The fabrication of biological tissues in laboratory settings has been widely investigated for its applications in research, organ transplantation, and drug screening. Although several previous attempts to generate avascular or thin tissues have been successful, there remains the challenge to create thick functional tissues. Maintaining the viability of thick tissues requires the presence of a capillary network throughout the construct to allow the intake of nutrients and the discard of cellular waste through blood. In addition to endothelial cells, the incorporation of supporting cell types is necessary to promote survival, maturation, and acquire in vivo-like functionality. Compared to other biofabrication methods, bioprinting is a promising technology that enables the precise fabrication of complex 3D patterns at high spatial resolution. We have come up with a new configuration of our in-house laser-based bioprinting technique called laser-induced side transfer (LIST) in which the bioink passes through a horizontal glass capillary with an orifice facing the receiving substrate. When the laser beam causes bubble formation in the bioink, a liquid jet exits through the orifice that will eventually form a droplet. We have conducted a detailed study to characterize this bioprinting technique and validated its cytocompatibility through viability assessment of LIST-printed human umbilical vein endothelial cells (HUVECs). In an effort to generate physiological blood vessels, we incorporated fibroblasts and pericytes in our samples and observed the gradual recruitment of these cells by the printed HUVEC capillary-like structures on Matrigel. Fluorescent images were taken and analyzed to quantify the fibroblast/pericyte recruitment over time.

Endothelial cells (ECs) lining the inner surfaces of blood vessels sense and respond to the numerous mechanical forces present in the microvascular environment. Although the influence of wall shear stress, stiffness and curvature has been thoroughly investigated, the role of strain and wall tension remains less clear, most notably in the case of confluent monolayers. In vitro platforms such as organ-on-chips are ideal systems to investigate EC mechanobiology as they offer a controllable and well defined set of mechanical stimuli.I started by developing a hydrogel-based microvessel-on-chip that encompasses both shear stress and circumferential strain in a pulsatile manner based on luminal flow actuation. The concept is the following: by imposing a given flow rate inside the channel, the luminal pressure is increased due to the channel's hydraulic resistance, which dilates the vessel. I then performed an extensive characterization of the mechanical behavior of the system and demonstrated that the shear and strain span the physiological ranges. Because both stresses derive from the luminal pressure, shear and strain are tightly coupled. To enable independent control of each stress, I explored three strategies: (1) adding a hydraulic resistance of variable length at the channel output, (2) changing the width of the hydrogel, and (3) tuning the hydrogel concentration. I also demonstrated the endothelial monolayer has an effect of flow shielding which explains the higher deformation obtained in endothelialized channels relative to cell-free channels.The luminal flow actuation in the microvessel-on-chip can also be viewed as a hydraulic compression assay. The second part of my Ph.D. was devoted to the study of the dynamics of the poroelastic gel in this novel assay. Three major responses were investigated: the dynamics of the channel dilation after a pressure step, the strain distribution in the hydrogel and wave propagation. Each of these responses leads to complex dynamic behavior that can be exploited to derive the important poroelastic parameters of the hydrogel, most notably the Young's modulus and the permeability.The final part of my Ph.D. was the investigation of the response of EC monolayers to static tensile stresses where I discovered a new behavior. ECs showed a strong reorganization, aligning their overall shape, cytoskeleton and nuclei in the stretch direction, and the effect was magnitude dependent. Associated with this overall reorientation, adherens junctions (AJs) remodeled into focal AJs (FAJs), a specialized structure that forms under tension. The cortical network of actin filaments also remodeled into thick bundles of central stress fibers. The association of the stress fibers and FAJs enabled the formation of circumferential transendothelial actin cables. In parallel, I proposed a hypothetical framework for the long term monolayer mechanics observed in this assay.In summary, during my Ph.D. I developed a microvessel-on-chip that can subject cells to wall tension, characterized its mechanical behavior in detail, and investigated the response of the cells to the tensile stresses in this system, revealing a novel collective behavior., Les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins sont capables de détecter et de répondre aux nombreuses forces mécaniques présentes dans le système microvasculaire. Bien que l'influence de forces dues au cisaillement, à la rigidité et à la courbure soit bien étudiée, le rôle de l'étirement et de la tension de la paroi vasculaire demeure peu compris, en particulier dans le cas des monocouches jointives. Les plateformes in vitro telles que les organes sur puce sont idéales pour l'étude de ces phénomènes, puisqu'elles offrent une panoplie de stimuli mécaniques contrôlables et caractérisables .Le premier étape de ma thèse a été le développment d'un microvaisseau-sur-puce, constitué d'un hydrogel, permettant de générer à la fois le cisaillement et l'étirement circonférentiel de manière pulsatile, par l'actionnement par flux. Le concept est le suivant: en imposant un certain débit dans le microcanal, la pression luminale augmente à cause de la résistance hydraulique du canal, ce qui dilate le vaisseau. J'ai ensuite réalisé une caractérisation exhaustive du comportement mécanique du système et démontré que le cisaillement et l'étirement couvrent les plages de valeurs physiologiques. Puisque les deux contraintes découlent de la pression luminale, le cisaillement et l'étirement sont intrinséquement couplés. Pour contrôler chaque contraintes indépendemment, j'ai exploré trois stratégies: (1) l'ajout d'une résistance hydraulique de longueur variable à la sortie du microcanal, (2) le changement de la largeur de l'hydrogel, et (3) la variation de la concentration de l'hydrogel. J'ai également démontré que la monocouche endothéliales agit comme une barrière contre le flux, ce qui explique les déformations plus importantes obtenues dans les canaux endothélialisés par rapport aux canaux sans monocouche cellulaire.L'actionnement par flux luminal peut également être vu comme un essai de compression hydraulique. La deuxième partie de ma thèse a été consacrée à l'étude de la dynamique du gel poroélastique dans ce nouvel essai. Trois réponses majeures ont été analysées : la dynamique de la dilatation du canal après une marche de pression, le champ de déformation et la propagation d'ondes dans le gel. Chacune de ces réponses conduit à des comportements dynamiques complexes, qui peuvent être exploités afin de calculer les paramètres poroélastiques de l'hydrogel, notamment le module d'Young et la permeabilité.La dernière partie de ma thèse a consisté en l'étude de la réponse des monocouches endothéliales à des forces de tractions statiques, où j'ai mis en évidence un nouveau comportement. Les cellules endothéliales ont été fortement remodelées, alignant leur forme globale, leur cytosquelette et leur noyau dans la direction de l'étirement, et cet effet était dépendant de la magnitude de la tension. Les jonctions adhérentes se sont remodelées en jonctions adhérentes focales, une structure spécialisée qui se forme sous tension. Le réseau d'actine corticale s'est également réorganisé en fibres de stress et les jonctions adhérentes focales ont permis la formation de câbles d'actine transcellulaires circonférentiels. En parallèle, j'ai proposé un cadre hypothétique pour la mécanique au long terme des monocouches observées dans cette expérience.En résumé, pendant ma thèse j'ai développé un microvaisseau-sur-puce qui peut soumettre les cellules à des forces de tension, caractérisé son comportement mécanique en détail, et étudié la réponse des cellules aux forces de tractions dans ce système, révélant un nouveau comportement collectif.

Peroxisome proliferator- activated receptors (PPARs) are nuclear receptors and function as transcriptional factors involved in some chronic diseases such as lipid metabolism disorder and cancer, which include PPAR alpha, PPAR beta/delta, PPAR gamma. Among them, PPAR beta/delta has exhibited explicitly proangiogenic effects on physiological and pathological angiogenesis. Angiogenesis has been known as a hallmark of cancer. PPAR beta/delta has been suggested to be involved in the regulation of the angiogenic switch in tumor progression. However, until now, it is still unclear to what extent the expression of PPAR beta/delta in tumor endothelium influences tumor progression and metastasis formation. Thus, we addressed this question using transgenic mice with conditional inducible vascular-endothelium specific PPAR beta/delta overexpression. We also induced syngenic tumors following specific PPAR beta/delta overexpression in endothelial cells. We observed higher tumor neovascularization and enhanced tumor growth and metastasis formation in tumors of animals with vascular-specific PPAR beta/delta overexpression. In order to identify potential downstream molecular targets of PPAR beta/delta in tumor endothelium, we sorted endothelial cells from the tumors and performed RNA sequencing. We identified platelet- derived growth factor B (PDGFB), platelet- derived growth factor receptor beta (PDGFR beta) and the receptor tyrosine kinase KIT (c-KIT) as new PPAR beta/delta dependent molecules by ChIP assay. Thus, we demonstrated that PPAR beta/delta activation, regardless of its action on different cancer cell types, promotes tumor progression and metastasis formation through enhancement of tumor angiogenesis.; Les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARs) sont des récepteurs nucléaires et fonctionnent comme des facteurs de transcription impliqués dans certaines maladies chroniques telles que le trouble du métabolisme lipidique et le cancer, qui incluent PPAR alpha, PPAR beta/delta, PPAR gamma. Parmi eux, PPAR beta/delta a montré des effets explicitement proangiogéniques sur l'angiogenèse physiologique et pathologique. L'angiogenèse est connue pour être une caractéristique du cancer. Il a été suggéré que PPAR beta/delta était impliqué dans la régulation du commutateur angiogénique dans la progression tumorale. Cependant, jusqu'à présent, on ne sait toujours pas dans quelle mesure l'expression de PPAR beta/delta dans l'endothélium tumoral influence la progression tumorale et la formation de métastases. Ainsi, nous avons abordé cette question en utilisant des souris transgéniques avec une surexpression PPAR beta/delta spécifique de l'endothélium conditionnel inductible. Nous avons également induit des tumeurs syngéniques suite à une surexpression spécifique PPAR beta/delta dans les cellules endothéliales. Nous avons observé une néovascularisation tumorale plus élevée et une augmentation de la croissance tumorale et de la formation de métastases dans les tumeurs d'animaux avec une surexpression PPAR beta/delta spécifique vasculaire. Afin d'identifier des cibles moléculaires potentielles en aval de PPAR beta /delta dans l'endothélium tumoral, nous avons trié les cellules endothéliales des tumeurs et effectué le séquençage de l’ARN. Nous avons identifié le facteur de croissance dérivé des plaquettes B (PDGFB), le récepteur beta du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR beta) et le récepteur tyrosine kinase KIT (c-KIT) en tant que nouvelles molécules dépendantes de PPAR beta/delta par l’essai de ChIP. Ainsi, nous avons démontré que l'activation de PPAR beta/delta, quelle que soit son action sur différents types de cellules cancéreuses, favorise la progression tumorale et la formation de métastases grâce à l'amélioration de l'angiogenèse tumorale.

Peroxisome proliferator- activated receptors (PPARs) are nuclear receptors and function as transcriptional factors involved in some chronic diseases such as lipid metabolism disorder and cancer, which include PPAR alpha, PPAR beta/delta, PPAR gamma. Among them, PPAR beta/delta has exhibited explicitly proangiogenic effects on physiological and pathological angiogenesis. Angiogenesis has been known as a hallmark of cancer. PPAR beta/delta has been suggested to be involved in the regulation of the angiogenic switch in tumor progression. However, until now, it is still unclear to what extent the expression of PPAR beta/delta in tumor endothelium influences tumor progression and metastasis formation. Thus, we addressed this question using transgenic mice with conditional inducible vascular-endothelium specific PPAR beta/delta overexpression. We also induced syngenic tumors following specific PPAR beta/delta overexpression in endothelial cells. We observed higher tumor neovascularization and enhanced tumor growth and metastasis formation in tumors of animals with vascular-specific PPAR beta/delta overexpression. In order to identify potential downstream molecular targets of PPAR beta/delta in tumor endothelium, we sorted endothelial cells from the tumors and performed RNA sequencing. We identified platelet- derived growth factor B (PDGFB), platelet- derived growth factor receptor beta (PDGFR beta) and the receptor tyrosine kinase KIT (c-KIT) as new PPAR beta/delta dependent molecules by ChIP assay. Thus, we demonstrated that PPAR beta/delta activation, regardless of its action on different cancer cell types, promotes tumor progression and metastasis formation through enhancement of tumor angiogenesis., Les récepteurs activés par les proliférateurs de peroxysomes (PPARs) sont des récepteurs nucléaires et fonctionnent comme des facteurs de transcription impliqués dans certaines maladies chroniques telles que le trouble du métabolisme lipidique et le cancer, qui incluent PPAR alpha, PPAR beta/delta, PPAR gamma. Parmi eux, PPAR beta/delta a montré des effets explicitement proangiogéniques sur l'angiogenèse physiologique et pathologique. L'angiogenèse est connue pour être une caractéristique du cancer. Il a été suggéré que PPAR beta/delta était impliqué dans la régulation du commutateur angiogénique dans la progression tumorale. Cependant, jusqu'à présent, on ne sait toujours pas dans quelle mesure l'expression de PPAR beta/delta dans l'endothélium tumoral influence la progression tumorale et la formation de métastases. Ainsi, nous avons abordé cette question en utilisant des souris transgéniques avec une surexpression PPAR beta/delta spécifique de l'endothélium conditionnel inductible. Nous avons également induit des tumeurs syngéniques suite à une surexpression spécifique PPAR beta/delta dans les cellules endothéliales. Nous avons observé une néovascularisation tumorale plus élevée et une augmentation de la croissance tumorale et de la formation de métastases dans les tumeurs d'animaux avec une surexpression PPAR beta/delta spécifique vasculaire. Afin d'identifier des cibles moléculaires potentielles en aval de PPAR beta /delta dans l'endothélium tumoral, nous avons trié les cellules endothéliales des tumeurs et effectué le séquençage de l’ARN. Nous avons identifié le facteur de croissance dérivé des plaquettes B (PDGFB), le récepteur beta du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR beta) et le récepteur tyrosine kinase KIT (c-KIT) en tant que nouvelles molécules dépendantes de PPAR beta/delta par l’essai de ChIP. Ainsi, nous avons démontré que l'activation de PPAR beta/delta, quelle que soit son action sur différents types de cellules cancéreuses, favorise la progression tumorale et la formation de métastases grâce à l'amélioration de l'angiogenèse tumorale.

Pseudomonas aeruginosa is one of the most common multidrug-resistant bacteria. The role of its virulence factor LecB, a fucose-binding protein, in the attachment to host cells has been shown. Its interaction with the immune system, however, is still to be elucidated. Here, we show that LecB targets endothelial cells within the draining lymph nodes (LNs) after cutaneous injection in mice. Twenty-four hours after injection, LecB causes an accumulation of lymphocytes within the skin-draining LNs. While injection of traceable lymphocytes revealed that LecB does not enhance the recruitment of lymphocytes into the LN, we show instead in lymphocyte entry-blocking experiments that LecB impedes lymphocyte egress. We demonstrate that LecB modifies endothelial cells in vivo and in vitro, suggesting a reinforced endothelial barrier function and a possible role for LecB in disturbing lymphocyte circulation between the blood and the LN, which is essential for immunosurveillance and the establishment of protective adaptive immune responses.; Pseudomonas aeruginosa est l'une des bactéries multirésistantes les plus répandues. Bien que le rôle du facteur de virulence LecB, une protéine se liant au fucose, ait été montré comme important pour la fixation aux cellules hôtes, son interaction avec le système immunitaire reste à élucider. Nous montrons ici que LecB cible les cellules endothéliales (CE) dans les ganglions lymphatiques (GL) drainant après injection cutanée chez la souris. Vingt-quatre heures après l'injection, LecB provoque une accumulation de lymphocytes dans les GL drainant la peau. Bien que l'injection de lymphocytes traçables ait révélé que LecB n'accélère pas le recrutement des lymphocytes dans le GL, nous montrons plutôt dans les expériences de blocage de l'entrée des lymphocytes que LecB empêche la sortie de ces derniers. Nous démontrons que LecB modifie les CE in vivo et in vitro, ce qui suggère une fonction de barrière endothéliale renforcée et un rôle possible pour LecB dans la perturbation de la circulation des lymphocytes entre le sang et le GL ce qui est essentiel pour l’immunosurveillance et l’établissement des réponses immunitaires adaptatives protectrices.

Pseudomonas aeruginosa is one of the most common multidrug-resistant bacteria. The role of its virulence factor LecB, a fucose-binding protein, in the attachment to host cells has been shown. Its interaction with the immune system, however, is still to be elucidated. Here, we show that LecB targets endothelial cells within the draining lymph nodes (LNs) after cutaneous injection in mice. Twenty-four hours after injection, LecB causes an accumulation of lymphocytes within the skin-draining LNs. While injection of traceable lymphocytes revealed that LecB does not enhance the recruitment of lymphocytes into the LN, we show instead in lymphocyte entry-blocking experiments that LecB impedes lymphocyte egress. We demonstrate that LecB modifies endothelial cells in vivo and in vitro, suggesting a reinforced endothelial barrier function and a possible role for LecB in disturbing lymphocyte circulation between the blood and the LN, which is essential for immunosurveillance and the establishment of protective adaptive immune responses.; Pseudomonas aeruginosa est l'une des bactéries multirésistantes les plus répandues. Bien que le rôle du facteur de virulence LecB, une protéine se liant au fucose, ait été montré comme important pour la fixation aux cellules hôtes, son interaction avec le système immunitaire reste à élucider. Nous montrons ici que LecB cible les cellules endothéliales (CE) dans les ganglions lymphatiques (GL) drainant après injection cutanée chez la souris. Vingt-quatre heures après l'injection, LecB provoque une accumulation de lymphocytes dans les GL drainant la peau. Bien que l'injection de lymphocytes traçables ait révélé que LecB n'accélère pas le recrutement des lymphocytes dans le GL, nous montrons plutôt dans les expériences de blocage de l'entrée des lymphocytes que LecB empêche la sortie de ces derniers. Nous démontrons que LecB modifie les CE in vivo et in vitro, ce qui suggère une fonction de barrière endothéliale renforcée et un rôle possible pour LecB dans la perturbation de la circulation des lymphocytes entre le sang et le GL ce qui est essentiel pour l’immunosurveillance et l’établissement des réponses immunitaires adaptatives protectrices.

This study was performed to investigate the effects of BMP4 and TGFβ1 on ovine thecal endothelial cell gene and protein expression. Ovine ovaries were obtained from adult ewes irrespective of stage of estrous cycle, and thecal endothelial cells were isolated using pluriSelect technology, and cultured. Following exposition to BMP4 and TGFβ1 for 24h, total ribonucleic acid (RNA) was isolated for quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) analysis of genes with well-validated roles in endothelial cell proliferation, vascular formation and/or permeability. Proteomic analysis was also undertaken using mass spectrometry following exposure of ovine thecal endothelial cells to BMP4 for 48h. The results show that BMP4 and TGFβ1 regulated genes related to endothelial function, including fibroblast growth factor 18 and endothelin-1. Mass spectrometry analysis identified 1488 proteins in total, with significant up-regulation (>2- fold) of 28 proteins and down-regulation (, Cette étude a été réalisée afin d'étudier les effets de BMP4 et de TGFβ1 sur l'expression de gènes et de protéine des cellules endothéliales de la thèque chez l'ovin. Les ovaires ovins ont été obtenus à partir de brebis adultes, quel que soit le stade du cycle oestral, et les cellules endothéliales de la thèque ont été isolées à l'aide de la technologie pluriSelect et cultivées. Après exposition à BMP4 et à TGFβ1 pendant 24 heures, les acides ribonucléiques totaux (ARN) ont été isolés pour une analyse quantitative de la réaction en chaîne de la polymérase en temps réel (qRT-PCR) de gènes de rôles bien connus dans la prolifération des cellules endothéliales, la formation et/ou la perméabilité vasculaire. Une analyse protéomique a également été réalisée à l'aide de la spectrométrie de masse après exposition de cellules endothéliales de la thèque à BMP4 pendant 48h. Les résultats montrent que BMP4 et TGFβ1 régulent les gènes liés à la fonction endothéliale, incluant le facteur de croissance des fibroblastes 18 et l’endothéline-1. L'analyse par spectrométrie de masse a identifié 1488 protéines totales dont 28 protéines sont significativement régulées positivement (> 2 fois) et 29 protéines régulées négativement (

Sodium-glucose cotransporter (SGLT)2 inhibitors have shown remarkable cardiovascular protective effects with reduced risk of cardiovascular mortality and hospitalization for heart failure in T2DM patients with a high cardiovascular risk and that this effect is independent of glucose control. The possibility that SGLT1 and 2 inhibitors protect the cardiovascular system by targeting the pivotal protective endothelial function remains unclear. The first in vitro study indicates that angiotensin II and circulating microparticles from patients with coronary artery disease via the activation of the local angiotensin system are potent inducers of SGLT1 and 2 expression to promote endothelial senescence and dysfunction. The second in vivo study indicates that the selective SGLT2 inhibitor empagliflozin protects the heart and the vascular system, and that the treatment is particularly effective to delay premature vascular senescence known to promote the development of cardiovascular diseases at arterial sites at risk of atherogenesis. Altogether, these studies suggest that inhibition of SGLT2 and/or SGLT1 might be an attractive therapeutic strategy to protect the endothelial function, and the subsequent development of cardiovascular diseases.; Les inhibiteurs du cotransporteur sodium-glucose SGLT2 ont montré des effets protecteurs cardiovasculaires remarquables avec une réduction du risque de mortalité cardiovasculaire et d’hospitalisation pour insuffisance cardiaque chez des patients atteints de DT2 avec un risque cardiovasculaire élevé, un effet indépendant du contrôle de la glycémie. La possibilité que les inhibiteurs de SGLT1 et 2 protègent le système cardiovasculaire en ciblant la fonction endothéliale protectrice reste incertaine. La première étude in vitro indique que l'angiotensine II et les microparticules circulantes provenant de patients atteints de coronaropathie sont de puissants inducteurs de l'expression de SGLT1 et 2 via l'activation du système angiotensine local afin de promouvoir la sénescence et la dysfonction endothéliale. La deuxième étude in vivo indique que l'empagliflozine, un inhibiteur sélectif de SGLT2, protège le cœur et le système vasculaire, et que le traitement est particulièrement efficace pour retarder la sénescence vasculaire prématurée connue pour favoriser le développement de maladies cardiovasculaires au niveau des sites artériels présentant un risque athérogène. Dans l’ensemble, ces études suggèrent que l'inhibition de SGLT2 et/ou de SGLT1 pourrait constituer une stratégie thérapeutique attrayante pour la protection de la fonction endothéliale et le développement ultérieur de maladies cardiovasculaires.

L'encéphalopathie hépatique (HE) est un syndrome neuropsychiatrique complexe, une complication majeure de la maladie du foie. L'œdème cytotoxique est une complication grave de l'encéphalopathie hépatique, connu comme étant le résultat d'un gonflement des astrocytes. Les facteurs pathogéniques dérivés du sang tels que l'ammoniaque (NH4+) et le stress oxydatif (SO) sont connus pour être synergiquement impliqués. Les cellules endothéliales (CE) de la barrière hémato-encéphalique (BHE), régulant le passage vers le cerveau, sont les premières cellules à entrer en contact avec les molécules circulantes. L'effet de l'ammoniaque et du SO sur le transport et le métabolisme des CE n'a jamais été complètement exploré. Par conséquent, notre objectif était d'évaluer les effets de NH4+ et des espèces réactives de l'oxygène (ROS) sur les CE de la BHE en utilisant des systèmes de modèles in vivo et in vitro. Il a été démontré que le cotransporteur Na-K-2Cl (NKCC1) était impliqué dans la pathogenèse de l'œdème cérébral dans de nombreuses affections neurologiques. Le NKCC1 peut transporter NH4+ vers le cerveau et est régulé par les ROS. Par conséquent, l'expression de NKCC1 a été évaluée dans des CE primaires soumises à différentes concentrations de ROS et de NH4+ ainsi que dans des microvaisseaux cérébraux (MVC) isolés chez le rat BDL (bile-duct ligated), un modèle d'EH induit par une maladie hépatique chronique. Aucune régulation à la hausse de NKCC n'était présente chez les CE traitées ou les MVC. La glutamine synthétase (GS) est une enzyme qui joue un rôle compensatoire important dans la détoxification du NH4+ au cours de la maladie du foie. La GS est exprimée dans le muscle et le cerveau (astrocytes), mais n'a jamais été totalement explorée dans les CE de la BHE. L'expression et l'activité de la protéine GS ont été trouvées dans les CE de la BHE in vitro (CE primaires) et in vivo (MVC isolés de rats naïfs). Dans le modèle BDL, l'expression de GS dans les MVC n'était pas significativement différente des témoins (SHAM). Par ailleurs, nous avons traité des CE avec du milieu conditionné à partir de plasma de rats BDL et avons trouvé une diminution de l’expression de la protéine GS et de l'activité par rapport aux SHAM. De plus, les CE traitées avec NH4+ augmentaient en activité de GS tandis que les traitements avec SO avec et sans NH4+ diminuent l'activité de GS. Globalement, ces résultats démontrent pour la première fois que la GS est présente dans les CE, à la fois in vivo et in vitro. La GS est régulée à la baisse dans les CE traitées avec du plasma de BDL (mais pas dans les MVC de BDL). Il est intéressant de noter que le NH4+ stimule l'activité de GS dans les CE, alors que le SO inhibe l'activité de GS, ce qui justifie possiblement les résultats de nos études avec les milieux conditionnés. Nous supposons que le SO empêche la régulation à la hausse de GS de la BHE, en diminuant la capacité des CE à détoxifier l'ammoniaque et à limiter l'entrée d'ammoniaque dans le cerveau. Nous envisageons qu'une régulation à la hausse de GS dans les CE de la BHE pourrait devenir une nouvelle cible thérapeutique de l'EH., Hepatic encephalopathy (HE) is a complex neuropsychiatric syndrome, which is a major complication of liver disease. Cytotoxic edema is a serious complication of HE, known to be the result of astrocyte swelling. Blood derived pathogenic factors such as ammonia (NH4+) and oxidative stress’ (OS) are known to be synergistically implicated. Endothelial cells (EC) of the blood brain barrier (BBB) are the first cells regulating passage into the brain and to contact blood-derived molecules. The effect of ammonia and oxidative stress on EC transport and metabolism has never been thoroughly explored. Therefore, our aim was to evaluate the effects of NH4+ and reactive oxygen species (ROS) on EC of the BBB using in vivo and in vitro models systems. The Na–K–2Cl cotransporter (NKCC1) has been demonstrated to be involved in the pathogenesis of brain edema in numerous neurological conditions. NKCC1 can transport NH4+ into the brain and is regulated by ROS. Therefore, the expression of NKCC1 was evaluated in primary EC submitted to different concentrations of ROS and NH4+ as well as in cerebral microvessels (CMV) isolated from the bile-duct ligated (BDL) rat, a model HE induced by chronic liver disease. No upregulation of NKCC1 was present in either the treated EC or CMV. Glutamine synthetase (GS) is an enzyme with an important compensatory role in NH4+ detoxification during liver disease. GS is expressed in muscle and brain (astrocytes) but has never been thoroughly explored in ECs of the BBB. GS protein expression and activity was found in EC of the BBB in vitro (primary EC) and in vivo (CMV isolated from naive rats). In the BDL model, GS expression in CMVs was not significantly different from SHAM-operated controls. In addition, we treated ECs with conditioned medium from plasma of BDL rats and found a decrease in GS protein and activity when compared to SHAM. Furthermore, EC treated with NH4+ increased GS activity while treatments with ROS with and without NH4+ decreased GS activity. Overall these results demonstrate for the first time that GS is present in EC both in vivo and in vitro. GS is downregulated in EC treated with BDL plasma (but not in BDL CMV). Interestingly, NH4+ stimulates GS activity in ECs, while ROS inhibits GS activity, possibly justifying the results found from the conditioned medium studies. We speculate that ROS prevents the upregulation of GS in the BBB, decreasing the capacity of the EC to detoxify ammonia and to limit ammonia entry into the brain. We foresee that upregulating GS in ECs of the BBB could become a new therapeutic target for HE.

This scientific work has tackled the question of the pancreatic islets aging and the effect of endothelial senescence and microparticles (MPs) on islet function. We investigated the impact of aging on pancreas morphology, fate and on the function of the pancreatic islet by comparative analysis between pancreas in young and middle-aged rats, as well as the role of pro-senescent endothelial MPs on islet function and their premature senescence. Our in vivo data show that the pancreas is an early sensitive organ to oxidative stress accumulating with age and leading to overexpression of the procoagulant and senescence markers without appearance of apoptosis. In vitro, MPs of senescent endothelial cells have a pro-senescent effect on pancreatic islets isolated from young rats with characteristic SA-β-galactosidase activity, overexpression of p53, p21 and p16 markers and reducing the ability of insulin secretion in response to glucose. Altogether, our in vivo and in vitro data indicate the contribution of endothelial senescence as a possible contributor to graft dysfunction.; Ce travail scientifique a abordé la problématique du vieillissement des îlots pancréatiques et l’effet de la senescence endothéliale et des microparticules (MPs) sur la fonction des îlots. Nous avons exploré l’impact du vieillissement du pancréas sur la morphologie, le devenir et la fonction de l’îlot pancréatique par analyse comparative entre pancréas de rats jeunes et d’âge moyen et le rôle des MPs endothéliales pro-sénescentes sur la fonction des îlots et leur sénescence prématurée. Nos résultats in vivo montrent que le pancréas est un organe précocement sensible au stress oxydant s’accumulant avec l’âge. Il conduit à la surexpression des marqueurs procoagulants et de senescence sans apparition d’apoptose. In vitro, les MPs de cellules endothéliales sénescentes ont un effet pro-sénescent sur les îlots pancréatiques isolés de rats jeunes avec une activité SA-β-galactosidase caractéristique, la surexpression des marqueurs p53, p21 et p16 et la réduction de la capacité de la sécrétion d’insuline en réponse au glucose. L’ensemble de nos résultats in vivo et in vitro désigne la contribution de la sénescence endothéliale comme une cause probable à la dysfonction de greffon.

Skeletal muscle is highly vascularised. Beyond oxygen and nutriment supply, new functions for vessels have been recently identified, through the interactions that vessel cells (endothelial cells) establish with muscle cells, particularly with muscle stem cells (satellite cells). These latter closely interact with endothelial cells for their expansion and their differentiation, then with periendothelial cells for their self-renewal and return to quiescence. During skeletal muscle regeneration endothelial cells reciprocally interact with myogenic cells by direct contact or by releasing soluble factors to promote both myogenesis and angiogenesis processes. Skeletal muscle regeneration typically occurs as a result of a trauma or disease, such as congenital or myopathies. To better understand the role of vessel plasticity in tissue remodeling, we took advantage of two muscular disorders that could be considered as paradigmatic situations of regenerating skeletal muscle in the child: Juvenile Dermatomyositis (JDM), the most frequent inflammatory myopathy and Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), the most common type of muscular dystrophy. Although these two muscular disorders share, at the tissue level, similar mechanisms of necrosis-inflammation, they differ regarding the vessel domain. In JDM patients, microvascular changes consist in a destruction of endothelial cells assessed by focal capillary loss. This capillary bed destruction is transient. The tissue remodeling is efficient and muscle may progressively recover its function. By contrast, in DMD, despite an increase of vessels density in an attempt to improve the muscle perfusion, the muscle function progressively alters with age. We identified clinical and pathological markers of severity and predictive factors for poor clinical outcome in JDM by computing a comprehensive initial and follow-up clinical data set with deltoid muscle biopsy alterations controlled by age-based analysis of the deltoid muscle capillarization. We demonstrated that JDM can be divided into two distinctive clinical subgroups. The severe clinical presentation and outcome are linked to vasculopathy. Furthermore, a set of simple predictors (CMAS34, atteinte gastrointestinale, fibrose endomysiale musculaire au diagnostic) ont été identifiés. Le volet cellulaire a permis l’identification in vitro des interactions cellulaires spécifiques et différentielles des myoblastes issues de patients DMD et DMJ sur les cellules endothéliales normales par l’analyse de leur rôle sur la prolifération, migration et différenciation des cellules vasculaires. Dans la DMD, les myoblastes entrainent une réponse angiogénique importante mais non efficace (néovascularisation anarchique). Dans la DMJ, les myoblastes participent efficacement à la reconstruction vasculaire notamment via la sécrétion de facteurs proangiogéniques. Ces résultats ont été renforcés par analyse transcriptomique effectuée à partir de cellules endothéliales et satellites isolées de muscles de patients confirmant le rôle central de la vasculopathie associée à un contexte inflammatoire spécifique lié à l’interféron dans la physiopathologie de la DMJ et montrant dans la DMD une dérégulation de l’homéostasie normale des interactions vaisseau-muscle avec mise en jeu d’un remodelage tissulaire non efficace. Ces données permettent d'identifier de nouvelles fonctions des cellules vasculaires dans le remodelage du muscle strié squelettique au cours des pathologies musculaires de l'enfant, et devraient ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

The aim of the present work was to evaluate both the potency of omega-3 formulations to induce the endothelial function and the effect of omega-3 on the platelet-induced coronary artery contraction.The endothelium-dependent relaxations induced by EPA:DHA formulations is dependent on both the ratio and the purity of the formulation, with the maximal effect obtained with a highly purified EPA:DHA 6:1 ratio through a redox-sensitive activation of PI3-kinase/Akt and/or MAPKs pathways and subsequent activation of eNOS. The EPA:DHA 6:1 formulation inhibits the platelet-induced serotonin-mediated contraction of porcine coronary rings and the 5HT-induced contraction in both porcine coronary artery and human internal mammary artery rings, mainly due to an increased endothelial formation of NO. Taken together, the present findings indicate that the optimized EPA:DHA 6:1 formulation is able to exert potent beneficial cardiovascular effects through the activation of the endothelial function., Le but du présent travail est d’évaluer le potentiel d’oméga-3 à induire la fonction endothélial, et à inhiber la contraction des artères coronaires en réponse aux plaquettes activées.L’induction des relaxations dépendantes de l’endothélium est affecté à la fois par le ratio et la pureté des formulations, avec un effet maximal obtenu pour la formulation EPA:DHA 6:1 à haut degré de pureté via une activation redox-sensible des voies de signalisation PI3-kinase/Akt et/ou MAPKs menant à l’activation de eNOS. La formulation EPA:DHA 6:1 inhibe les contractions induites par les plaquettes impliquant la sérotonine dans les artères coronaires de porc, et les contractions à la sérotonine dans les artères coronaires porcines et mammaires internes humaines, principalement par une augmentation de la formation endothéliale de NO. Ces résultats indiquent que la formulation optimisée EPA:DHA 6:1 exerce un effet bénéfique sur le système cardiovasculaire via l’activation de la fonction endothéliale.

L’implication des protéines tyrosines phosphatases (PTPs) dans la régulation de la signalisation et la médiation des fonctions cellulaires a été bien établie dans les dernières années. Cependant, les mécanismes moléculaires par lesquels les PTPs régulent les processus fondamentaux tels que l’angiogenèse demeurent méconnus. Il a été rapporté que l’expression de la PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) augmente avec la densité cellulaire et corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2. Cette déphosphorylation contribue à l’inhibition de contact dans les cellules endothéliales à confluence et diminue l’activité du VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement ses résidus catalytiques Y1054/1059. De plus, la plupart des voies de signalisation en aval du VEGFR2 sont diminuées sauf la voie Src-Gab1-AKT. DEP-1 déphosphoryle la Y529 de Src et contribue à la promotion de la survie dans les cellules endothéliales. L’objectif de cette thèse est de mieux définir le rôle de DEP-1 dans la régulation de l’activité de Src et les réponses biologiques dans les cellules endothéliales. Nous avons identifié les résidus Y1311 et Y1320 dans la queue C-terminale de DEP-1 comme sites majeurs de phosphorylation en réponse au VEGF. La phosphorylation de ces résidus est requise pour l’activation de Src et médie le remodelage des jonctions cellules-cellules dépendantes de Src. Ce remodelage induit la perméabilité, l’invasion et la formation de capillaires en réponse au VEGF. Nos résultats démontrent que la phosphorylation de DEP-1 sur résidu tyrosine est requise pour diriger la spécificité de DEP-1 vers son substrat Src. Les travaux révèlent pour la première fois un rôle positif de DEP-1 sur l’induction du programme angiogénique des cellules endothéliales. En plus de la phosphorylation sur tyrosine, DEP-1 est constitutivement phosphorylé sur la thréonine 1318 situé à proximité de la Y1320 en C-terminal. Cette localisation de la T1318 suggère que ce résidu pourrait être impliqué dans la régulation de la Y1320. En effet, nous avons observé que la T1318 de DEP-1 est phosphorylée potentiellement par CK2, et que cette phosphorylation régule la phosphorylation de DEP-1 sur tyrosine et sa capacité de lier et d’activer Src. En accord avec ces résultats, nos travaux révèlent que la surexpression du mutant DEP-1 T1318A diminue le remodelage des jonctions cellules-cellules et par conséquent la perméabilité. Nos résultats suggèrent donc que la T1318 de DEP-1 constitue un nouveau mécanisme de contrôle de la phosphorylation sur tyrosine et que ceci résulte en l’activation de Src et l’induction des fonctions biologiques des cellules endothéliales en réponse au VEGF. Suite à ces travaux dans les cellules endothéliales qui démontrent un rôle positif de DEP-1 dans la médiation des réponses angiogéniques, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur l’implication potentielle de DEP-1 dans les cellules cancéreuses où l’activité de Src est requise pour la progression tumorale. Malgré le rôle connu de DEP-1 comme suppresseur tumoral dans différents types de cancer, nous avons émis l’hypothèse que DEP-1 pourrait promouvoir les fonctions biologiques dépendantes de Src telles que la migration et l’invasion dans les cellules cancéreuses. Ainsi, nous avons observé que l’expression de DEP-1 est plus élevée dans les lignées basales de cancer du sein qui sont plus invasives comparativement aux lignées luminales peu invasives. Dans les lignées basales, DEP-1 active Src, médie la motilité cellulaire dépendante de Src et régule la localisation des protéines impliquées dans l’organisation du cytosquelette. L’analyse d’un micro-étalage de tissu a révélé que l’expression de DEP-1 est associée avec une réduction tendencielle de survie des patients. Nos résultats proposent donc, un rôle de promoteur tumoral pour DEP-1 dans la progression du cancer du sein. Les travaux présentés dans cette thèse démontrent pour la première fois que DEP-1 peut agir comme promoteur des réponses angiogéniques et du phénotype pro-invasif des lignées basales du cancer du sein probablement du à sa capacité d’activer Src. Nos résultats suggèrent ainsi que l’expression de DEP-1 pourrait contribuer à la progression tumorale et la formation de métastases. Ces découvertes laissent donc entrevoir que DEP-1 représente une nouvelle cible thérapeutique potentielle pour contrer l’angiogenèse et le développement du cancer., The implication of protein tyrosine phosphatases (PTPs) in the regulation of cell signalling events and the mediation of cellular functions in response to growth factors such as VEGF has been well-established in the last years. Nonetheless, molecular mechanisms by which PTPs regulate fundamental processes such as angiogenesis are not well-characterized. Expression of the PTP DEP-1 (Density-enhanced phosphatase 1) was reported to increase with cell density and was associated with VEGFR2 dephosphorylation contributing to cell contact inhibition in confluent endothelial cells. We previously demonstrated that DEP-1 attenuates VEGFR2 activity by dephosphorylation of its Y1054/1059 leading to decreased activation of major signalling pathways downstream of VEGFR2 with exception of the Src-Gab1-AKT pathway. Increasing Src activity due to DEP-1-mediated dephosphorylation of its Y529 promotes endothelial cell survival. The objective of this thesis was to gain a better understanding of the role of DEP-1 in the regulation of the Src activity and of biological responses in endothelial cells. We identified tyrosine Y1311 and Y1320 in the C-terminal tail of DEP-1 as major phosphorylation sites in response to VEGF. These residues are required for Src activation and mediate the Src-dependent remodelling of endothelial cell junctions inducing permeability, invasion and capillary formation upon VEGF stimulation. We showed that VEGF-induced DEP-1 tyrosine phosphorylation directs DEP-1 specificity towards its substrate Src. Our results thus highlighted for the first time the promoting role of DEP-1 on the angiogenic program in endothelial cells. In addition to tyrosine phosphorylation, DEP-1 is constitutively phosphorylated on a threonine residue (T1318) proximal to Y1320 in its C-terminal tail suggesting it might be involved in the regulation of Y1320. Indeed, we found that DEP-1 T1318 is phosphorylated, potentially by CK2, and regulates the tyrosine phosphorylation of DEP-1 and its ability to bind to and activate Src. Consistent with this, remodelling of endothelial cell junctions and permeability are impaired in endothelial cells expressing the DEP-1 T1318 mutant. Thus, DEP-1 phosphorylation on T1318 displays a regulatory control over DEP-1 tyrosine phosphorylation and subsequently Src activation and endothelial cell functions in response to VEGF. Our results demonstrating that DEP-1 promotes angiogenic cell responses in endothelial cells, prompted us to consider a possible involvement of DEP-1 in cancer cells, where Src activation has been linked to cancer progression. Thus, although, DEP-1 is believed to act as a tumour suppressor in different cancer types, we hypothesized that it might also promote Src-dependent functions such as migration and invasion in cancer cells. Interestingly, we found that DEP-1 is higher expressed in more invasive basal-like breast cancer cells than in luminal-like cell lines. Moreover, DEP-1 is implicated in the regulation of Src activity, Src-mediated cell motility and appropriate localization of proteins mediating cytoskeletal organization in basal-like breast cancer cell lines. To further support these results, analysis of a breast cancer tissue microarray revealed that DEP-1 expression is associated with a tendency towards reduced overall survival. Thus, our results provide first evidence for a tumour-promoting role of DEP-1 in breast cancer. Altogether, the work performed in the context of this thesis revealed that DEP-1 can similarly behave as a promoter of the angiogenic response and of the pro-invasive phenotype in basal-like breast cancer cell lines, most likely due to its ability to activate Src. This suggests for the first time that DEP-1 expression could contribute to tumour progression and the formation of metastases, and as such, represent a potential new target for anti-angiogenic and anti-cancer therapy.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Photodynamic therapy (PDT) can be used to cause vascular collapse and blood flow stasis of the irradiated pathological neovascularisation appearing in several diseases such as age-related macular degeneration (AMD) and cancer. We hypothesized that this PDT-related interruption of vessel integrity may lead to an increased transvascular passage of drugs that could be used as a drug delivery pathway. Thus, preceding the occlusion of the pathological vasculature, PDT could be used for instance as a local drug delivery pathway to administrate an anti-angiogenic drug in the case of AMD or chemotherapy in the case of cancer, potentially improving combination therapies. In the case of chorioneovessels (CNV) due to AMD, the recurrence of the exudative AMD component of the weeks/months after PDT, due to the re-opening and/or re-growth of neovessels might be avoided by adding an anti-angiogenic factor such as anti-VEGF or anti-inflammatory drug before, during or shortly after PDT. In the case of cancer, the starvation of tumour cells induced by the PDT occlusion of blood vessels feeding the tumour might be combined with a chemotherapeutic agent for the direct kill of the cancer cells themselves. It has been reported that following the light application in PDT, a physiological cascade of responses on the one hand leads to vascular occlusion but may also induce a vascular permeability enhancement. The aim of this thesis is to find conditions where this increase in leakage due to PDT can be observed, to characterize it and to take advantage of this phenomenon to develop the basis of a novel combination therapy approach. Hence in this thesis, pre-clinical experiments were performed in the vasculature of the chorioallantoic membrane model (CAM) of the chicken embryo and in the dorsal skinfold optical chamber of nude mice observed by intravital microscopy (IVM). In the CAM, no PDT-induced leakage of a fluorescent dye (FITC-dextran) was observed unless an anti-aggregating factor, such as aspirin was added. In the chicken embryo model, delaying the blood clot appears to be an essential process to allow effective potential drug delivery. In the dorsal skinfold of the nude mouse, the inflammatory response after PDT was observed and quantified. This revealed that PDT induces a time dependent acute inflammatory response as shown by increased number of leukocytes "rolling" along the vessel wall after treatment. This was observed over a 2 hour period following PDT. The quantification of the microvascular leakage showed a continuous FITC-dextran leakage from the vasculature treated by PDT to the interstitial space. This local leakage was clearly increased by the inflammatory status of the tissue (observed by quantifying the rolling leukocytes and by histology). This concept has the potential to improve the drug delivery of anti-angiogenic drugs in the eyes of patients treated for AMD and could also be applied to improve the uptake of cytostatic drugs in tumours.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

International audience; Les cellules endothéliales de capillaires cérébraux, support anatomique de la barrière hémato-encéphalique, présentent des caractéristiques structurales et métaboliques qui restreignent considérablement les échanges entre le sang et le parenchyme cérébral. Nécessaire au maintien de I'homéostasie du système nerveux central, ce filtre sélectif reste un problème pour le traitement des maladies cérébrales. Afin de recréer les interactions qui existent in vivo et d'étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent le passage des molécules vers le cerveau, nous avons établi un modèle de barrière hémato-encéphalique in vitro. Ce modèle consiste en une coculture de cellules endothéliales de capillaires cérébraux et de cellules gliales ensemencées de part et d'autre d'un filtre. Dans ces conditions de culture, nous avons démontré que les cellules endothéliales exprimaient toutes les caractéristiques, tant physiques que métaboliques, de l'endothélium invivo. Ces résultats font de notre modèle un outil pertinent et précieux dans le développement de nouvelles molécules à visée cérébrale.