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The macaw palm, Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart., is a Brazilian native species with great potential for biofuel production. The aim of this work was to analyze macaw palm genetic diversity to structure and assist in the definition of sampling strategies for germplasm banks. Forty-six microsatellite markers, from which seven polymorphic markers were used to evaluate 103 macaw palm individuals collected from different Brazilian locations. The polymorphic markers were used to generate a dissimilarity matrix by weighted index. The imaging of genetic variability was realized by 3D projection of matrix dissimilarity. Sixty-seven individuals had their ITS region sequenced and aligned, and the mutations found were used to generate a haplotype network. The average genetic distance identified between individuals was 76.2%, ranging from 3.7 to 100%. Genetic variability structure was not found. ITS region sequencing of the 67 individuals revealed four polymorphic sites, defining four haplotypes. The results of this study suggest that historically, macaw populations were strongly connected, indicating a recent population expansion of the species. The results indicate that macaw genetic variety sampling should focus on effective collection in selected locations. Areas such as Caatinga and Humid Chaco however, could present new sources of genetic variability, and should be studied. RESUMO A macaúba, Acrocomia aculeata (Jacq.) Lodd. ex Mart.), é uma das espécies nativas brasileiras com maior potencial para a produção de biocombustíveis. O objetivo deste trabalho foi analisar a diversidade e estruturação genética de macaúba para auxiliar na definição de estratégias de amostragem para bancos de germoplasma. Quarenta e seis marcadores microssatélites, dos quais sete marcadores polimórficos foram utilizados para avaliar 103 indivíduos de macaúba coletados em diferentes regiões do Brasil. Os marcadores polimórficos foram utilizados para gerar uma matriz de dissimilaridade pelo índice ponderado. A visualização da variabilidade genética foi realizada através de uma projeção 3D da matriz de dissimilaridade. Sessenta e sete destes indivíduos tiveram sua região ITS sequenciada e alinhada, e as mutações encontradas foram utilizadas para gerar uma rede de haplótipos. A distância genética média identificada entre os indivíduos foi de 76,2%, variando de 3,7 a 100%. Não foi encontrada estruturação da variabilidade genética. O sequenciamento da região ITS dos 67 indivíduos revelou quatro sítios polimórficos, definindo quatro haplótipos. Os resultados obtidos neste estudo sugerem que as populações de macaúba estiveram fortemente conectadas historicamente, indicando recente expansão populacional da espécie. Os resultados indicam que a amostragem da variabilidade genética de macaúba deve estar focada em coletas mais robustas em poucos locais, mas áreas como Caatinga e Chaco Úmido podem apresentar novas fontes de variabilidade genética, e devem ser melhor estudadas.