Search

Investigation of RNA and DNA function often requires sequence-specific incorporation of various reporter and affinity probes. This can be achieved using AdoMet-dependent methyltransferases (MTases) as they can be active with synthetic AdoMet analogues equipped with transferable chains larger than the methyl group. These chains usually carry reactive groups that can be further chemically appended with required reporters. For this, azide-alkyne 1,3-cycloaddition (AAC), also called “click”, reaction is particularly attractive. This work shows that the HhaI cytosine-5 DNA MTase (variant Q82A/Y254S/N204A) catalyzes efficient sequence-specific transfer of hex-2-ynyl side chains containing terminal alkyne or azide groups from synthetic cofactor analogues to DNA. Both the enzymatic transfer and subsequent “click” coupling of a fluorophore can be performed even in cell lysates. For RNA labeling, the activity of an archaeal RNA 2‘-O-MTase C/D ribonucleoprotein complex (RNP) with synthetic cofactors was investigated. It was shown that synthetically reprogrammed guide RNA sequences can be used to direct the C/D RNP-dependent transfer of a prop-2-ynyl group to predetermined nucleotides in substrate RNAs. Followed by AAC this can be used for programmable sequence-specific labeling of a variety of RNA substrates in vitro. These new possibilities for specific labeling of nucleic acids can be adopted in biochemistry, biomedical, nanotechnology, etc. research. Tiriant DNR ir RNR, neretai svarbu prijungti įvairius reporterinius ar giminingumo žymenis griežtai apibrėžtose (sekos) vietose – t.y. specifiškai. Tam galima pasitelkti fermentus metiltransferazes (MTazes). Natūraliai jos naudoja kofaktorių AdoMet, tačiau gali būti aktyvios ir su sintetiniais jo analogais, turinčiais ilgesnes nei metil- pernešamas grandines. Jei šios grandinės turi galines funkcines grupes, prie jų vėliau cheminių reakcijų pagalba galima prijungti norimus žymenis. Tam itin patogi azidų-alkinų cikloprijungimo (AAC), dar vadinama „click“, reakcija. Šiame darbe parodyta, kad DNR citozino-5 MTazė HhaI (variantas Q82A/Y254S/N204A) efektyviai katalizuoja sekai specifinę heks-2-inil- grandinių, turinčių galines alkinil- arba azido- grupes, pernašą nuo sintetinių kofaktorių ant DNR. Naudojant šią MTazės-kofaktorių sistemą bei AAC, visą specifinio DNR žymėjimo procesą galima atlikti netgi ląstelių lizate. RNR žymėjimui ištirtas archėjų RNR 2‘-O-MTazės C/D ribonukleoproteininio komplekso aktyvumas su sintetiniais kofaktoriais. Parodyta galimybė sintetiškai keičiant kreipiančiąją RNR, prop-2-inilgrupės pernašą nukreipti į norimas įvairių substratinių RNR sekos vietas ir po to AAC reakcijos pagalba prijungti fluoroforą. Taigi, sukurtas naujas molekulinis įrankis, leidžiantis be suvaržymų pasirinkti norimą pažymėti RNR seką. Šios naujos specifinio nukleorūgščių žymėjimo galimybės gali būti pritaikytos biochemijos, biomedicinos, nanotechnologijų ir kitose tyrimų srityse... [toliau žr. visą tekstą]

The aims of the study were to determine the reasons for unsuccessful expression of measles virus hemaglutinin (MeH) in the yeast cells and to generate a stable yeast strains with integrated genes of protein secretory pathway of human cells and to examine influence of coded human proteins on MeH maturation. For the firs time, overexpression of MeH in yeast S. cerevisiae and P. pastoris was described. It was demonstrated that mechanisms of cotranslational translocation into the endoplasmic reticulum (ER) and protein maturation in the ER of yeast cells are not adapted to deal with for such complex virus glycoproteins. Proteomic analysis revealed, that overexpression of human virus surface protein precursors induces cytosolic unfolded protein response (UPR-cyto) in the yeast S. cerevisiae. A key feature of this response is the formation of extremely large aggregates involving macromolecular structures of eEF1A. Efficient mammalian like cotranslational translocation pathway was attempted to reconstitute in yeast cells by transferring human SRP, Sec61 complexes and TRAM1 protein. Human chaperones BiP, clanexin, calreticulin, ERp57 and PDI were transferred to the yeast cells to create suitable environment for maturation of MeH in the ER. Even though yeast strains, able to produce biologically active MeH protein, were not generated during this study, results show, that humanization of yeast secretory pathway, designed for producing active virus glycoproteins, is possible. Baigiamojo darbo tikslai – nustatyti neefektyvios žmogaus virusų glikobaltymų raiškos mielėse priežastis ir sukurti mielių kamienus su integruotais žmogaus ląstelių sekrecinio kelio genais bei ištirti jų įtaką glikobaltymų sintezei ir brendimui mielėse. Darbo eigoje pirmą kartą buvo aprašytos tymų viruso hemagliutinino (TVH) sintezės galimybės mielėse Saccharomyces cerevisiae ir Pichia pastoris. Parodyta, kad mielių ko-transliacinio baltymų perkėlimo į endoplazminį tinklą (ET) ir ET baltymų sulankstymo mechanizmai nėra pritaikyti sudėtingų virusinių baltymų brendimui, todėl klasikinės mielių rūšys ir standartiniai rekombinantinių baltymų raiškos ir gryninimo protokolai nėra tinkami diagnostikai ir vakcinų kūrimui reikalingo TVH baltymo gavimui. Proteominė S. cerevisiae ląstelių, sintetinančių TVH baltymą, analizė leido nustatyti kad, TVH sintezė mielėse sukelia neseniai literatūroje aprašytą citoplazminį nesusivyniojusių baltymų atsaką (UPR-cyto). Pagrindinis šiame darbe aprašyto atsako į stresą požymis yra ypatingai didelių baltymų agregatų, kurių šerdį sudaro TVH ir mielių eEF1A baltymai, susidarymas. Žmogaus tipo ko-transliacinį baltymų pernešimą į ET mielių ląstelėse bandyta atkurti perkeliant žmogaus SRP, Sec61 kompleksų ir TRAM1 baltymus, o siekiant sukurti tinkamas TVH baltymo brendimui sąlygas, mielių ląstelių ET buvo sintetinami pagrindiniai žmogaus ląstelių ET šaperonai – BiP, kalretikulinas, kalneksinas, PDI ir ERp57. Nors šiame darbe nepavyko sukurti mielių... [toliau žr. visą tekstą]

Baigiamojo darbo tikslas – ištirti Paramyxoviridae šeimos virusų nukleokapsidės baltymų sintezės mielėse Saccharomyces cerevisiae galimybes ir nustatyti ar mielėse susintetintus nukleokapsidės baltymus galima taikyti Paramyxoviridae šeimos virusų infekcijų serologinei diagnostikai. Tikslas pasiektas ištyrus Paramyxoviridae šeimos Sendai, žmogaus parainfluenza, žmogaus respiracinio sincitinio, Nipah, Hendra ir Menangle virusų nukleokapsidės baltymų sintezę mielių Saccharomyces cerevisiae kamiene 214∆pep4. Nustatyta, kad mielėse susintetinti nukleokapsidės baltymai pasižymi natyviems analogiškų virusų nukleokapsidės baltymams būdingomis savybėmis: yra tirpūs, formuoja virusų nukleokpsidę primenančias daleles, kurios nespecifiškai įjungia ribonukleorūgštis, pasižymi antigeninėmis savybėmis, būdingomis natyviems analogiškų virusų nukleokapsidės baltymams. Taip pat mielėse susintetinti nukleokapsidės baltymai išgryninti juos centrifuguojant per tankų sacharozės tirpalo sluoksnį ir CsCl tankio gradiente. Įsitikinta, kad mielėse Saccharomyces cerevisiae susintetinti Paramyxoviridae šeimos virusų nukleokapsidės baltymai reaguoja su atitinkamais šios šeimos virusais užsikrėtusių žmonių ir gyvūnų kraujo serumo antikūnais, todėl tinka šių virusų infekcijų serologinės diagnostikos sistemų kūrimui. Naudojant mielėse susintetintus nukleokapsidės baltymus buvo gauti specifiniai monokloniniai antikūnai reaguojantys su natyviais virusų nukleokapsidės baltymais. Įvertinos gautų monokloninių... [toliau žr. visą tekstą] The aims of this study was to investigate synthesis of SeV, hPIV1, hPIV3, hRSV, NiV, HeV and MenV nucleocapside (N) proteins in yeast Saccharomyces cerevisiae, to determine properties of recombinant N proteins and evaluate the feasibility to use them in diagnostics. In this study it was demonstrated, that yeast S.cerevisiae is an excellent host for a high-level production of proteins SeV, hPIV1, hPIV3, hRSV, NiV, HeV and MenV N proteins as virus nukleokapsid-like particles (vNLP). The yeast-expressed hPIV1, hPIV3, hRSV, NiV, HeV and MenV vNLPs represent useful tools for the development of new virus detection systems and demonstrate the effectiveness of yeast as a host for generation of recombinant proteins organized in complex structures like human virus NLPs.

Hepatitis B virus (HBV) is a major human pathogen, but up to now little is known about its core protein (HBc) interactions with host proteins. The role of mutated HBc proteins in enhanced pathogenicity of mutant viruses is also unclear. In this work, the yeast two-hybrid system was employed to find human proteins interacting with HBV core mutants HBc1 and HBc2, as well as with the wild-type core protein. All HBc variants strongly and specifically interacted with human proteins GIPC1 and GIPC2. Common protein interaction domain PDZ in both GIPC1 and GIPC2 was identified as the region interacting with the C-end of HBc. A putative PDZ-interacting motif was identified at the C-end of the HBc protein, and variation of this sequence influenced determined interactions. Human proteins FLJ20850 and IKKγ (NEMO) strongly and specifically interacted with mutants HBc1 and HBc2 only. Gene structure and expression FLJ20850 protein, which was never before described in scientific literature, were analyzed bioinformatically. Detailed analysis of interacting protein pairs revealed regions, responsible for discovered interactions. IKKγ is known as an important regulator of transcription factor NF-kB, therefore HBc1 influence on NF-kB activity in human cells was evaluated experimentally. Determined protein interactions potentially add to understanding of HBV replication and pathogenicity and could serve as targets for developing of new antivirals. Hepatito B virusas (HBV) yra plačiai paplitęs žmogaus patogenas, bet iki šiol mažai ištirta jo šerdies baltymo (HBc), o ypač natūraliai aptinkamų mutantinių formų įtaka viruso dauginimuisi ir patogeniškumui. Šiame darbe mielių dviejų hibridų metodu atrinkti žmogaus kepenų baltymai, sąveikaujantys su laukinio tipo baltymu bei mutantais HBc1 ir HBc2. Su visomis tirtomis HBc atmainomis stipriausiai ir specifiškiausiai sąveikavo žmogaus baltymai GIPC1 ir GIPC2. Detaliau tiriant šias sąveikas nustatyta, kad HBc baltymo C-galas sąveikauja su GIPC1 ir GIPC2 baltymų PDZ domenais. HBc baltymo C-gale aptiktas PDZ domenų atpažįstamos sekos motyvas ir parodyta, kad šios sekos pokyčiai įtakoja HBc sąveiką su GIPC1 ir GIPC2. Vien su mutantais HBc1 ir HBc2 stipriausiai ir specifiškiausiai sąveikavo žmogaus baltymai FLJ20850 ir IKK (NEMO). Anksčiau netyrinėto nežinomos funkcijos žmogaus baltymo FLJ20850 raiška ir geno struktūra apibūdinta naudojantis bioinformatinėmis duomenų bazėmis. Detaliau tiriant mutantų sąveikas su FLJ20850 ir IKK buvo nustatytos baltymų sritys, apsprendžiančios tarpusavio sąveiką. IKK baltymas reguliuoja transkripcijos veiksnio NF-κB aktyvumą, todėl buvo tiriama ir mutanto HBc1 įtaka NF-κB aktyvumui žmogaus ląstelėse. Aptiktos baltymų sąveikos gali padėti geriau suprasti HBV dauginimosi ciklą bei patogeniškumą ir tapti naujų antivirusinių vaistų taikiniais.

The contribution of Cys17 and surface-exposed histidine residues in rhG-CSF interaction with Cu(II), Ni(II) and Hg(II) ions chelated by Light Resistant Yellow 2KT-polyethylene glycol derivative was evaluated in aqueous two-phase systems composed of polyethylene glycol (PEG) and dextran. It was determined that His43, His52, His156 and His170 residues are involved in protein interaction with chelated Cu(II) ions. Protein interaction with chelated Ni(II) is governed by His52 and His170 residues, though Cys17 is also involved. The contribution of Cys17 side chain is dominant in the interaction between rhG-CSF and chelated Hg(II) ions. The direct interaction between chelated Hg(II) ions and the –SH group of protein was determined for the first time. Based on the study of the interaction between rhG-CSF and chelated metal ions, rhG-CSF was successfully refolded from inclusion bodies in aqueous two-phase systems PEG-dextran containing chelated Ni(II) or Hg(II) ions for the first time. The refolding of rhG-CSF (C17S) in these systems was more effective compared to that of intact rhG-CSF. The dependence of refolding efficiency of rhG-CSF (C17S) in two-phase systems containing chelated metal ions on the number of histidine mutations was evaluated. It was determined that the refolding efficiency of protein in the systems containing chelated Ni(II) is inversely proportional to the number of histidine mutations. The affinity of purified rhG-CSF (C17S) and its histidine mutants for... [to full text]