8 results on '"Krasnoselska, Ganna"'
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2. Screening of Membrane Protein Production by Comparison of Transient Expression in Insect and Mammalian Cells.
- Author
-
Kaipa, Jagan Mohan, Krasnoselska, Ganna, Owens, Raymond J., and van den Heuvel, Joop
- Subjects
- *
MEMBRANE proteins , *GENE expression , *GREEN fluorescent protein , *GENE delivery techniques , *INSECTS - Abstract
Membrane proteins are difficult biomolecules to express and purify. In this paper, we compare the small-scale production of six selected eukaryotic integral membrane proteins in insect and mammalian cell expression systems using different techniques for gene delivery. The target proteins were C terminally fused to the green fluorescent marker protein GFP to enable sensitive monitoring. We show that the choice of expression systems makes a considerable difference to the yield and quality of the six selected membrane proteins. Virus-free transient gene expression (TGE) in insect High Five cells combined with solubilization in dodecylmaltoside plus cholesteryl hemisuccinate generated the most homogeneous samples for all six targets. Further, the affinity purification of the solubilized proteins using the Twin-Strep® tag improved protein quality in terms of yield and homogeneity compared to His-tag purification. TGE in High Five insect cells offers a fast and economically attractive alternative to the established methods that require either baculovirus construction and the infection of the insect cells or relatively expensive transient gene expression in mammalian cells for the production of integral membrane proteins. [ABSTRACT FROM AUTHOR]
- Published
- 2023
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3. Engineering rotor ring stoichiometries in the ATP synthase
- Author
-
Pogoryelov, Denys, Klyszejko, Adriana L., Krasnoselska, Ganna O., Heller, Eva-Maria, Leone, Vanessa, Langer, Julian D., Vonck, Janet, Müller, Daniel J., Faraldo-Gómez, José D., and Meier, Thomas
- Published
- 2012
4. Instruct-ULTRA D7.1 Standardised workflows for production, crystallisation and data collection of membrane proteins
- Author
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Archer, Magarida, Athayde, Diogo, van den Heuvel, Joop, Mohan Kaipa, Jagan, Krasnoselska, Ganna, Owens, Ray, Rodrigues, Jose, and Rosario, Ana L.
- Abstract
Workflows have been developed for the expression of integral membrane proteins (IMPs) in three different contexts: mammalian IMPs in human embryonic kidney cell s (expi293F™); mammalian IMPs in Trichoplusia nicells (High Five™) insect cells; and bacterial IMPs expressed in E. coli. Two common features of the workflows were cost-effective testing for expression in small culture volumes (1- 15 ml) and fusion to a fluorescent reporter protein (GFP or mCherry) to analyse expression and/or detergent solubilisation. The protocols developed for the expression of membrane proteins in human and insect cells were compared by analysing the same six targets, selected from different subcellular locations (plasma membrane, endoplasmic reticulum (ER) membrane, and Golgi apparatus membrane). The six targets were transiently transfected at small-scale into either expi293F™ or Hi5 High Five™ cells and analysis of fluorescence showed that all were expressed, though differences in the levels of protein produced were observed between the two expression cell systems. Work is on-going to purify proteins from both expression systems for subsequent structural studies by cryo-EM. The protocol for the production of bacterial membrane proteins in E. coli was exemplified by the analysis of two enzyme families from mycobacteria involved in cell wall synthesis (Arabinosyltransferase and Arabinofuranosyltransferase). The results demonstrated the critical importance of selecting homologues from multiple species and screening these for expression in parallel at small scale. Approximately 50 % of the cloned genes were expressed and from these, eight proteins were purified and structural studies initiated by cryo-electron microscopy.
- Published
- 2020
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5. Biochemical investigation of cation selectivity of the 'Ilyobacter tartaricus' Na+-ATP synthase rotor ring
- Author
-
Krasnoselska, Ganna
- Subjects
ddc:570 ,ddc:540 - Abstract
Die membranintegrierten, rotierenden F-Typ ATP-Synthasen zählen zu den essentiellen Komponenten der bakteriellen Energieversorgung. Ihre Rolle im zellulären Energiehaushalt bestehtin der Synthese von ATP unter Nutzung des transmembranen, elektrischen Ionengradienten (Mitchell 1961, Duncan et al. 1995, Noji et al. 1997, Kinosita et al. 1998). Die rotierenden ATP-Synthasen werden entsprechend der Kationenselektivität, die sie unter physiologischen Bedingungen zeigen, in zwei verschiedene Klassen eingeteilt, die H+-selektiven, sowiedie Na+-selektiven ATP-Synthasen. Hierbei bildet die Selektivität beider Klassen für einwertige Kationen (H+ oder Na+) eine essenzielle Grundlage für ihre Rolle im Energiehaushalt der bakteriellen Zellen. Jedoch gibt es nur eine begrenzte Anzahl von anaeroben Eubakterien und Archaeen, die noch einen auf Na+- Ionen basierenden Energiehaushalt besitzen. Gut charakterisierte Beispiele für Na+-selektive ATP-Synthasen bilden die F-Typ-Synthasen von I. tartaricus, P. modestum, sowie die V/A-Typ-Enzyme von E. hirae und A. woodii. Trotz der Unterschiede in der Kationenselektivitätder unterschiedlichen F-Typ ATP-Synthasen sind sie jedoch sowohl inihre Organisation, als auch hinsichtlich ihre Wirkungsweisen ähnlich. Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998). Das Ziel, der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Forschung, bestand in der Identifizierung der Faktoren, die sowohl die hohen Selektivität, als auch die Affinität des in der Membran-eingebetteten Rotor-C-Rings der ATP-Synthasezu Protonen (H+) und Na+- Ionen beeinflussen. Die Untersuchungen wurden hierbei andem c11-Ring der F-Typ-ATP-Synthase aus dem anaeroben Bakterium Ilyobacter tartaricus durchgeführt, das hierbei als Modellsystem diente. Der untersuchte Ring zeigt unter physiologischen Bedingungen eine hohe Bindungsselektivität für Na+ Ionen, kann jedoch unter nicht-physiologischen Bedingungen auch Li+ und H+ Ionen binden und zur ATP-Synthese verwenden (Neumann et al. 1998). Die Kd- und KM-Werte wurden verwendet, um die Na+ -Bindungsaffinität der C-Ringe bzw. ATP-Synthasen zu quantifizieren. Über die Selektivität wurdebeschrieben, welche Kationen an die C-Ringe und ATP-Synthasen binden können (z. B. H+/Na+/Li+, H+/Na+ - oder nur H+ Ionen).Das Verhältnis der absoluten Bindungsaffinitäten zwischen zwei Kationen (z. B. Kd (Na+)/Kd (H+)) wurde verwendet, um die Präferenz des Enzyms für eines der Ionen zu quantifizieren. Die Faktoren, dieder Kationenselektivität und der Affinität des I. tartaricus c-Rings zugrunde liegen, wurden mit Hilfe von Mutageneseexperimenten der Aminosäuren in der Ionenbindungsstelle untersucht. Im I. tartaricus-c-Ring erfolgt die Na+ Bindung an der Grenzfläche von zwei benachbarten c-Untereinheiten des c-Rings. An der Bindung der Na+-Ionen sind sowohl Aminosäuren aus Helix 1 (Gln32), sowie von Helix 2 (Val63, Ser66, Thr67 und Tyr70) beteiligt, die in der Nähe, des für den Mechanismusessentiellen Glu65 liegen. Insgesamt wurden 19 verschiedene, spezifische Einzel- und Doppelmutationen in die Sequenz des atpE-Gens eingeführt, die für die I. tarticus-ATP-Synthase-c-Untereinheit kodiert. Bei den Experimenten mit dem I. tartaricus c-Ring (Ser66, Thr67 und Tyr70) wurden drei polare Reste der Ionenbindungsstelle durch die polaren Reste (Ser67, Ile67 oder Leu67) oder hydrophobe Reste (Ala66, Gln67 und Phe70) ersetzt, während das geladene Glu65 durch die kürzere, aber immer noch geladene Seitenkette Asp65 ausgetauscht wurde. Zur Charakterisierung der monovalenten Kationenbindung durch die Wildtyp, sowie die mutierten C-Ringe von I.-tartaricus, wurde ein Ansatz verwendet, der biochemische (DCCD-Ionen-Kompetitionsassay) und biophysikalische (ITC) Methoden kombiniert. Die Daten der in dieser Arbeit durchgeführten Experimente, zeigen, dass c-Ringe selektiv für H+ sind, solange in der Ionenbindungsstelle des c-Rings ein ionisierbarer Glu/Asp-Rest vorhanden ist. Die H+-Bindungsaffinität des c-Rings hängt von der Hydrophobizität der Reste ab, aus der die Ionenbindungsstelle aufgebaut ist.Jedoch ist die Zahl der Faktoren, die die Na+-Selektivität des C-Rings bestimmen, weitaus größer. Von den in dieser Arbeit untersuchten Faktoren war die Zahl der polaren Reste, die Wasserstoffbrücken zu Na+ bilden, die Co-Koordination von Na+ durch strukturell vorhandene Wassermoleküle und die Anwesenheit von negativ geladenen Resten besonders wichtig für die Bindung der Na+-Ionen an den Ring. Die hohe Bindungsaffinität des c-Rings für Na+-Ionen, wird sowohl durch Wechselwirkungen begünstigt die das gebundene Na+-Ion stabilisieren, als auch den gesamten atomaren Aufbau der Ionenbindestelle, der die enthalpiegetriebene Na+-Bindungan den c-Ring begünstigen. Im Rahmen dieser eingehenden Studien konnten zum ersten Mal die thermodynamischen Eigenschaften aufgeklärt werden, die der hohen Na+-Bindungsaffinität des c-Rings zugrunde liegen, sowie der Einfluss von Mutationen auf diese Parameter ermittelt werden. Durch zahlreiche Experimente mit ATP-Synthasen, die mit mutierten c-Ringen zusammengesetzt wurden, sollte eine Verbindung zwischen Veränderungen der H+- und der Na+-Bindungsaffinitäten und Unterschiede im Betrieb der ATP-Synthase aufgeklärt werden. Die wichtigste Schlussfolgerung, die sich aus dieser Arbeit ableiten lässt, ist, besteht darin, dass sich Na+/H+-selektiven ATP-Synthasen durch den Austausch von 1-2 Aminosäureresten innerhalb der rotierenden c-Ring-Ionenbindungsstelle in ausschließlich H+-selektive, vollfunktionelle ATP-Synthasen umwandeln lassen.
- Published
- 2018
6. Tuning the ion specificity of the ATP synthase rotor
- Author
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Krasnoselska, Ganna O., Pogoryelov, Denys, Krah, Alexander, Langer, Julian D., Faraldo-Gómez, José D., and Meier, Thomas
- Published
- 2012
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7. Transient Transfection and Expression of Eukaryotic Membrane Proteins in Expi293F Cells and Their Screening on a Small Scale: Application for Structural Studies.
- Author
-
Krasnoselska GO, Dumoux M, Gamage N, Cheruvara H, Birch J, Quigley A, and Owens RJ
- Subjects
- Cell Line, Chromatography, Gel, Eukaryota genetics, Eukaryota metabolism, Gene Expression, HEK293 Cells, Humans, Membrane Proteins genetics, Recombinant Fusion Proteins genetics, Transfection methods, Biotechnology methods, Cell Culture Techniques methods, Eukaryotic Cells metabolism, Membrane Proteins biosynthesis, Recombinant Fusion Proteins biosynthesis
- Abstract
Cancers, neurodegenerative and infectious diseases remain some of the leading causes of deaths worldwide. The structure-guided drug design is essential to advance drug development for these important diseases. One of the key challenges in the structure determination workflow is the production of eukaryotic membrane proteins (drug targets) of high quality. A number of expression systems have been developed for the production of eukaryotic membrane proteins. In this chapter, an optimized detailed protocol for transient transfection and expression of eukaryotic membrane proteins in Expi293F cells is presented. Testing expression and purification on a small scale allow optimizing conditions for sample preparation for downstream structural (cryo-EM) elucidation.
- Published
- 2021
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8. Purification and Reconstitution of Ilyobacter tartaricus ATP Synthase.
- Author
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Krasnoselska GO and Meier T
- Subjects
- Adenosine Triphosphate metabolism, Chromatography, Affinity, Escherichia coli enzymology, Hydrolysis, Plasmids genetics, Proteolipids metabolism, Proteolipids ultrastructure, Proton-Translocating ATPases ultrastructure, Biochemistry methods, Fusobacteria enzymology, Proton-Translocating ATPases isolation & purification
- Abstract
F-type adenosine triphosphate (ATP) synthase is a membrane-bound macromolecular complex, which is responsible for the synthesis of ATP, the universal energy source in living cells. This enzyme uses the proton- or sodium-motive force to power ATP synthesis by a unique rotary mechanism and can also operate in reverse, ATP hydrolysis, to generate ion gradients across membranes. The F
1 Fo -ATP synthases from bacteria consist of eight different structural subunits, forming a complex of ∼550 kDa in size. In the bacterium Ilyobacter tartaricus the ATP synthase has the stoichiometry α3 β3 γδεab2 c11 . This chapter describes a wet-lab working protocol for the purification of several tens of milligrams of pure, heterologously (E. coli-)produced I. tartaricus Na+ -driven F1 Fo -ATP synthase and its subsequent efficient reconstitution into proteoliposomes. The methods are useful for a broad range of subsequent biochemical and biotechnological applications.- Published
- 2018
- Full Text
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