Search

Biocatalysis is an emerging and important scientific filed for the asymmetric synthesis of pharmaceuticals and fine chemicals that has accomplished astonishing growth in industrial sector in recent years. For individual biocatalytic synthesis to reach its full potential, the process must be explored from the aspect of various scientific fields, including protein engineering, organic chemistry, reaction engineering, and more. The focus of this PhD thesis are halohydrin dehalogenases (HHDHs), promising and yet quite unexplored group of enzymes, and their potential for industrial-scale synthesis. Through extensive research of the existing literature, a serious lack of kinetic data in biotransformations with enzymes from HHDH group was determined. Therefore, one of the objectives of the thesis was to gain insight into kinetic characteristics of HHDH from Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) and develop a mathematical model in synthesis of important building blocks, since this approach may lead to the discovery of enzyme kinetic limitations and process bottlenecks, and, more importantly, enable the enhancement of process outcome through model-based simulations. The investigated reactions were kinetic resolutions for the synthesis of optically pure, fluorinated β-substituted alcohols and epoxides that represent valuable building blocks in pharmaceutical and fine chemicals industries. Ring-opening reactions of fluorinated styrene oxide derivatives, catalyzed by wild-type HheC and its variants W249P and ISM-4, were explored. Fluorinated derivatives of styrene oxide with substituents in para-position were found to be most convenient substrates for HheC based on the activity, enantioselectivity and hydrolytic stability, whereby 2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]oxirane stood out as the best option. Enzyme variant W249P, with exchanged Trp and Pro amino acids on position 249, displayed higher substrate affinity in comparison to the wild type. Hence, it was selected for further kinetic investigation. The synthesis of (R)-2-azido-1-[4-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol was described by double substrate Michaelis-Menten kinetics, with the presence of enzyme inhibitions with reacting substrate (R)-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]oxirane, opposite enantiomer (S)-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]oxirane, product (R)-2-azido-1-[4-(trifluoromethyl)phenyl]ethanol, by-product rac-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]-1,2-ethanediol, and co-solvent DMSO. Apart from numerous inhibitions and substantial hydrolysis effect, operational stability decay was found to contribute greatly to the synthesis outcome on higher concentration scale, since deactivation constant is directly correlated to the initial concentration of the substrate, 2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]oxirane. The mathematical model was developed, and process simulations were employed in process optimization. Significant improvements in process metrics were achieved by modifying reactor set-up and selecting suitable initial conditions. The optimized biocatalytic system in repetitive batch reactor led to high reaction yield and optical purity (Y = 95%, ee > 99 %). However, process should be optimized further in order to increase reaction productivity that meets the target for industrial synthesis. The existence of various enzyme inhibitions and concentration-dependent enzyme deactivation, as well as low solubility and hydrolytic instability of the substrate, makes the system convenient for the switch from aqueous to alternative media. In the second part of the thesis, the focus was on the investigation of the influences of organic solvents (OSs) on HheC catalytic and structural performances. The stability of HheC in presence of dimethyl sulfoxide (DMSO), the most used co-solvent in HHDH-catalyzed biotransformations, was found to be preserved in cases when DMSO volume ratio does not exceed 30% (v/v). In higher DMSO content, HheC is not able to retain native structure and is completely and rapidly inactivated at 50% (v/v) co-solvent. This was confirmed by the combination of experimental studies, including monitoring enzyme stability and protein size distributions during incubation with different DMSO content, together with molecular dynamic studies (MD). DMSO also proved to be a mixed-type inhibitor of HheC in the reactions of para-nitro-2-bromo-1-phenylethanol (PNSHH) dehalogenation and para-nitro styrene oxide (PNSO) ring-opening with bromide ions. The inhibitory behavior was detected by kinetic Lineweaver-Burk analysis and confirmed by MD. Likewise, DMSO was found to be inhibitor of W249P variant in (R)-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl]oxirane azidolysis during kinetic investigation. Wild-type HheC also displayed inadequate catalytic properties in presence of other tested water-miscible co-solvents, specifically dimethylformamide, methanol, isopropanol, acetonitrile, and tetrahydrofuran. In case of hydrophobic solvents, a direct correlation between HheC activity and logP value was found in PNSHH ring-closure reaction. Knowledge of such a relationship makes biocatalysis with organic solvents more predictable, which may reduce the need to experiment with a variety of solvents in the future. However, this trend was not reported for PNSO ring-opening reaction. From hydrophobic OSs, tested alkanes (cyclohexane, n-hexane, n-heptane) were found to be compatible with HheC activity and stability during incubation, indicating the preservation of high enzyme structural integrity in these biphasic systems. Chloroform and toluene displayed inhibitory properties, especially in ring-opening reaction, which is more valuable from the synthetic point of view. In comparison to the wild type HheC, thermostable variant ISM-4 performed better in presence of OSs in terms of activity, stability, and enantioselectivity. In other words, the link between thermal stability and resistance to the action of OSs was established. These results revealed that ISM-4 has excellent potential for biotransformations in organic media, and as such should be explored for future implementations. Biokataliza je važno znanstveno područje u razvoju za asimetričnu sintezu lijekova i finih kemikalija koje je postiglo zapanjujući rast u industrijskom sektoru posljednjih godina. Kako bi pojedinačna biokatalitička sinteza dosegla svoj puni potencijal, proces se mora istražiti s aspekta različitih znanstvenih područja, uključujući proteinsko inženjerstvo, organsku kemiju, reakcijsko inženjerstvo itd. U fokusu ovog doktorskog rada su halogenhidrin-dehalogenaze (HHDH), obećavajuća ali još nedovoljno istražena skupina enzima, te njihov potencijal za industrijsku sintezu. Opsežnim istraživanjem postojeće literature utvrđen je ozbiljan nedostatak kinetičkih podataka u biotransformacijama s enzimima iz skupine HHDH. Stoga je jedan od ciljeva doktorskog rada bio dobiti uvid u kinetičke karakteristike HHDH iz Agrobacterium radiobacter AD1 (HheC) i razviti matematički model za sintezu važnih građevnih blokova, budući da ovaj pristup može dovesti do otkrića kinetičkih ograničenja enzima i uskih grla procesa te, što je još važnije, omogućiti poboljšanje ishoda procesa kroz simulacije temeljene na modelu. Istraživane reakcije bile su kinetičke rezolucije za sintezu optički čistih, fluoriranih β-supstituiranih alkohola i epoksida koji predstavljaju vrijedne gradivne elemente u farmaceutskoj industriji i industriji finih kemikalija. Istražene su reakcije otvaranja prstena fluoriranih derivata stiren-oksida, katalizirane divljim tipom HheC i njegovim mutantima W249P i ISM-4. Utvrđeno je da su fluorirani derivati stiren-oksida sa supstituentima u parapoložaju najprikladniji supstrati za HheC na temelju aktivnosti, enantioselektivnosti i hidrolitičke stabilnosti, pri čemu se 2-[4-(trifluormetil)fenil]oksiran istaknuo kao najbolja opcija. Enzim W249P, sa zamijenjenim Trp i Pro aminokiselinama na poziciji 249, pokazao je veći afinitet prema supstratu u usporedbi s divljim tipom, stoga je odabran za daljnje kinetičko istraživanje. Sinteza (R)-2-azido-1-[4-(trifluorometil)fenil]etanola opisana je dvosupstratnom Michaelis-Menteničinom kinetikom, uz prisutnost inhibicija enzima sa supstratom (R)-2-[4-(trifluormetil)fenil]oksiranom, suprotnim enantiomerom (S)-2-[4-(trifluormetil)fenil]oksiranom, produktom (R)-2-azido-1-[4-(trifluormetil)fenil]etanolom, nusproduktom rac-2-[4-(trifluorometil)fenil]-1,2-etandiolom, i ko-otapalom DMSO. Osim brojnih inhibicija i značajnog učinka hidrolize, utvrđeno je da pad operacijske stabilnosti enzima uvelike pridonosi ishodu sinteze pri višim koncentracijama, budući da je konstanta deaktivacije enzima izravno ovisna o početnoj koncentraciji supstrata, 2-[4-(trifluorometil)fenil]oksirana. Razvijen je matematički model, a pri optimizaciji procesa korištene su simulacije procesa. Značajna poboljšanja u ishodu sinteze postignuta su modificiranjem tipa reaktora i odabirom odgovarajućih početnih uvjeta. Optimizirani biokatalitički sustav u repetitivnom šaržnom reaktoru doveo je do visokog iskorištenja na produktu i optičke čistoće (Y = 95%, ee > 99 %). Međutim, proces treba dodatno optimizirati kako bi se povećala produktivnost reakcije koja ispunjava ciljeve za industrijsku sintezu. Postojanje različitih inhibicija i deaktivacije enzima ovisne o koncentraciji, kao i niska topljivost i hidrolitička nestabilnost supstrata, čine sustav pogodnim za prelazak s vodenog na alternativni medij. U drugom dijelu doktorskog rada fokus je bio na istraživanju utjecaja organskih otapala (engl. organic solvent – OS) na katalitička i strukturna svojstva HheC. Utvrđeno je da je stabilnost HheC u prisutnosti dimetil-sulfoksida (DMSO), najčešće korištenog ko-otapala u HHDH-biotransformacijama, očuvana u slučajevima kada volumni udio DMSO ne prelazi 30% (v/v). Pri većem udjelu DMSO, HheC nije u stanju zadržati prirodnu strukturu te se potpuno i brzo inaktivira pri 50% (v/v) ko-otapala. To je potvrđeno kombinacijom eksperimentalnih istraživanja, uključujući praćenje stabilnosti enzima i raspodjele veličine proteina tijekom inkubacije s različitim sadržajem DMSO, zajedno s molekulsko-dinamičkim studijama (engl. molecular dynamics – MD). Prema HheC, DMSO se također pokazao kao inhibitor miješanog tipa u reakcijama dehalogenacije para-nitro-2-bromo-1-feniletanola (PNSHH) i otvaranja prstena para-nitro stiren oksida (PNSO) s bromidnim ionima. Inhibicijsko ponašanje otkriveno je kinetičkom Lineweaver-Burk analizom i potvrđeno MD analizom. Isto tako, tijekom kinetičkih ispitivanja, otkriveno je da je DMSO inhibitor W249P mutanta tijekom azidolize (R)-2-[4-(trifluorometil)fenil]oksirana. Divlji tip HheC također je pokazao neadekvatna katalitička svojstva u prisutnosti drugih testiranih ko-otapala koja se miješaju s vodom, a posebice dimetilformamida, metanola, izopropanola, acetonitrila i tetrahidrofurana. U slučaju hidrofobnih otapala, izravna korelacija između aktivnosti HheC enzima i logP vrijednosti pronađena je u reakciji zatvaranja prstena PNSHH. Saznanje o takvoj ovisnosti čini biokatalizu s organskim otapalima predvidljivijom, što može smanjiti potrebu za eksperimentiranjem s različitim otapalima u budućnosti. Međutim, ovaj trend nije pronađen u reakciji otvaranja PNSO prstena. Od hidrofobnih OS, utvrđeno je da su alkani (cikloheksan, nheksan, n-heptan) kompatibilni s HheC aktivnošću i stabilnošću tijekom inkubacije, što ukazuje na očuvanje visokog strukturnog integriteta enzima u ovim dvofaznim sustavima. Kloroform i toluen pokazali su inhibicijska svojstva, posebno u reakciji otvaranja prstena koja je vrjednija sa sintetičkog gledišta. U usporedbi s divljim tipom HheC, termostabilni mutant ISM-4 demonstrirao je bolje rezultate u prisutnosti OS u smislu aktivnosti, stabilnosti i enantioselektivnosti. Drugim riječima, za slučaj ovog enzima utvrđena je poveznica između termičke stabilnosti i otpornosti na djelovanje otapala. Ova istraživanja otkrila su da ISM-4 mutant enzima ima izvrstan potencijal za biotransformacije u organskim medijima, te bi ga kao takvog trebalo istražiti za buduće primjene.

Accessible clean water is among the highest priorities for sustainable economic growth and societal wellbeing. Water supports life and is a crucial resource for humanity; it is also at the core of natural ecosystems and climate regulation. Water stress is primarily a water quantity issue, but it also occurs as a consequence of a deterioration of water quality and a lack of appropriate water management. Environmental problems that are associated with water pollution have been a persistently important issue over recent decades, correlated negatively with the health and ecosystem. The occurrence of trace amounts of antibiotics in various bodies of water was directly linked to the development of antibiotic resistant pathogens. Over the last two decades, penicillins have been widely prescribed and used across Europe. Recently, Amoxicillin (AMX) was added to the second and third EU “watch list” based on the Decision 2018/840/EU and 2020/1161/EU, respectively. Its presence in wastewater effluents is related to limited removal by common municipal wastewater treatment plants (WWTP's) based on primary (physical) and secondary (biological) treatment. Therefore, the new remediation techniques must be implemented within the water treatment train to remove such recalcitrant substances. Advanced oxidation processes (AOPs) have gained much research attention due to their innate ability to provide effective oxidation of a wide variety of organic pollutants persistent to conventional wastewater treatment methods. AOPs effectiveness rely on highly reactive and non-selective species, primarily hydroxyl radicals (HO•). Among various AOPs, semiconductor photocatalysis greatly attracts attention due to stability of the semiconductor material and potential to use abundant solar energy to degrade organic pollutants. The most widely investigated and employed photocatalyst in water purification is TiO2. However, TiO2 suffers from the fast recombination of photogenerated charges (i.e., electron/hole pairs; e-/h+) and is only active under UV light due its wide band gap (3.0-3.2 eV), thus hindering its potential for solar-driven applications. These deficiencies can be improved by the following strategies: doping with metals and/or non-metals, dye sensitization, incorporation with carbon nanotubes, reduced graphene oxide and coupling with other semiconductors with narrow band gaps. Coupling of TiO2 with narrow band gap semiconductors with visible light response may promote synergistic effects between two semiconducting materials leading to more efficient charge separation and high photocatalytic activity under visible light irradiation. Iron oxide (α-Fe2O3, also known as hematite) is a promising candidate for coupling with TiO2, due to its abundance, low cost, stability and visible light activity due to its narrow band gap (2.0–2.2 eV). Most importantly, suitable band-edge positions of hematite promote photogenerated charge separation in TiO2 via heterojunction transfer. Despite several photocatalytic applications of Fe2O3/TiO2 composites for the removal of contaminants of emerging concern (CECs), all studies investigated their applications in the suspension system (i.e., employing a powdered form of photocatalyst), while the application of immobilized Fe2O3/TiO2 composites are scarcely reported. Moreover, treatment of AMX under solar/visible light using Fe2O3/TiO2, as well as the ecotoxicity of AMX degradation/transformation by-products is rarely explored. In this dissertation, removal of AMX in pure water was investigated using sandwich-type Fe2O3/TiO2 layered films made of commercially available nanomaterials (Part 1) and using synthesized Fe2O3/TiO2 made of pure chemical precursors (Part 2). In part 1, sandwich-type composites made of commercial TiO2-P25 and α-Fe2O3 are obtained in a form of thin films by spin coating, possessing different layer configurations, namely: (i) TiO2 layer over α-Fe2O3 (TiO2@α-Fe2O3), (ii) α-Fe2O3 layer over TiO2 (α- Fe2O3@TiO2), and (iii) physically mixed 50% (w/w) of TiO2/Fe2O3. Photocatalytic activity under simulated solar irradiation of the aforementioned composites and their pure components is investigated for the degradation of AMX in the presence and absence of persulfate (PS). In both cases, TiO2@α-Fe2O3 sandwich-type achieved the highest degradation rates of AMX and a marked effect of PS addition on the AMX degradation rate is noted. The influence of pH and PS concentration on AMX degradation rate is established by means of experimental design and response surface modeling which revealed optimum conditions at [S2O82-] = 0.334 mM and pH = 4.0. The AMX degradation mechanisms and pathways are studied by means of reactive oxygen species scavenging and identification of intermediates by liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS), respectively. Evolution of formed intermediates is directly correlated with an increased toxicity assessed by Daphnia magna and Vibrio fischeri assays. Furthermore, biodegradability changes are correlated with the mineralization profile of AMX solution. The influence of water matrix constituents (Cl-, CO32-, NO3-, PO43- and Suwannee river natural organic matter) on AMX degradation is established as well. In part 2, Fe2O3/TiO2 nanocomposites were fabricated via a facile impregnation/calcination technique employing different amounts of iron (III) nitrate onto commercial TiO2 (P25 Aeroxide). The as-prepared Fe2O3/TiO2 nanocomposites were characterized by X-ray diffraction (XRD), Raman spectroscopy (RS), scanning electron microscopy/energy-dispersive spectroscopy (SEM/EDXS), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), Brunauer–Emmett–Teller analysis (BET), electron impedance spectroscopy (EIS), photoluminescence spectroscopy (PL), and diffuse reflectance spectroscopy (DRS). The Fe2O3/TiO2 composite possessing 5% (w/w) of Fe2O3 showed the highest photocatalytic activity in the slurry system and was thereafter successfully immobilized on glass support. Photocatalytic activity under visible-light irradiation was assessed by treating AMX in the presence and absence of additional oxidants: hydrogen peroxide (H2O2) and PS. The influence of pH and PS concentration on AMX conversion rate was established by means of statistical planning and response surface modeling. Results revealed optimum conditions of [S2O82-] = 1.873 mM and pH = 4.808; these were also utilized in presence of H2O2 instead of PS in long-term tests. The fastest AMX conversion possessing a zero-order rate constant of 1.51 × 10^−7 M·min^-1 was achieved with the photocatalysis + PS system. The AMX conversion pathway was established, and the evolution/conversion of formed intermediates was correlated with the changes in toxicity toward Vibrio fischeri. Reactive oxygen species (ROS) scavenging was also utilized to investigate the AMX conversion mechanism, revealing the major contribution of photogenerated h+ in all processes. Dostupna čista voda jedan je od najvećih prioriteta za održivi gospodarski rast i društvenu dobrobit. Voda podržava život i ključni je resurs za čovječanstvo; također je u srži prirodnih ekosustava i regulacije klime. Vodeni stres prvenstveno je uzrokovan problemom količine vode, ali se javlja i kao posljedica pogoršanja kvalitete vode i nedostatka odgovarajućeg gospodarenja vodom. Problemi okoliša povezani s onečišćenjem vode važno su pitanje tijekom posljednjih desetljeća, te su u negativnoj korelaciji sa zdravljem i ekosustavom. Pojava tragova antibiotika u raznim vodama u okolišu izravno je povezana s razvojem patogena otpornih na antibiotike. Tijekom posljednja dva desetljeća penicilini su naširoko propisivani i korišteni diljem Europe. Nedavno je amoksicilin (AMX) dodan na drugi EU „popis za praćenje” na temelju Odluke Komisije (EU) 2018/840/EU. Njegova prisutnost u otpadnim vodama povezana je s ograničenim uklanjanjem na komunalnim uređajima za pročišćavanje otpadnih voda (UPOV) koji se temelje na primarnom (fizičkom) i sekundarnom (biološkom) pročišćavanju. Stoga se moraju primijeniti nove tehnike remedijacije za uklanjanje takvih tvari. Nedavno su napredni oksidacijski procesi (AOP) privukli veliku pažnju istraživanča jer osiguravaju učinkovitu oksidaciju širokog spektra organskih onečišćivala koja su otporna na konvencionalne metode obrade vode. Učinkovitost AOP-a oslanja se na visoko reaktivne i neselektivne vrste, prvenstveno hidroksilne radikale (HO•). Među raznim AOP-ima, fotokataliza uz korištenje poluvodičkih materijala uvelike privlači pozornost zbog stabilnosti primjenjenih fotokatalizatora i potencijala korištenja sunčeve energije za razgradnju organskih onečišćivala. Najviše istraživan i korišten fotokatalizator u pročišćavanju vode je TiO2. Međutim, nedostatak TiO2 je brza rekombinacija fotogeneriranih naboja (tj. parova elektron/šupljina; e-/h+) te je aktivan samo pod UV svjetlom zbog široke zabranjene zone (3,0-3,2 eV), čime se smanjuje njegov potencijal u primjeni uz sunčevo zračenje. Ovi nedostaci mogu se poboljšati sljedećim strategijama: dopiranjem metalima i/ili nemetalima, senzibilizacijom boje, ugradnjom ugljičnih nanocijevi, reduciranim grafen oksidom i spajanjem s drugim poluvodičima s uskim propusnim pojasima. Spajanje TiO2 s poluvodičima s uskim razmakom i odzivom na vidljivo svjetlo može pospješiti sinergističke učinke između dva poluvodička materijala što dovodi do učinkovitijeg odvajanja naboja i visoke fotokatalitičke aktivnosti pod zračenjem vidljivim svjetlom. Željezni oksid (α-Fe2O3, također poznat kao hematit) obećavajući je kandidat za spajanje s TiO2, zbog svoje zastupljenosti, niske cijene, stabilnosti i aktivnosti pod vidljivom svjetlosti zbog uske zabranjene zone (2,0–2,2 eV). Ono što je najvažnije, prikladni rubni položaji hematita promiču fotogenerirano odvajanje naboja u TiO2 putem prijenosa heterospojnice. Unatoč nekoliko fotokatalitičkih primjena kompozita Fe2O3/TiO2 za uklanjanje postojanih onečišćivala (engl, contaminants of emerging concern, CECs), sve te studije istraživale su njihovu primjenu u suspenziji (tj. upotrebom praškastog oblika fotokatalizatora), dok je primjena imobiliziranih kompozita Fe2O3/TiO2 vrlo rijetka. Štoviše, tretman AMX-a pod sunčevim/vidljivim svjetlom pomoću Fe2O3/TiO2, kao i ekotoksičnost nusproizvoda razgradnje/transformacije AMX-a rijetko se istražuje. U ovoj disertaciji, uklanjanje AMX-a istraženo je korištenjem slojevitih filmova Fe2O3/TiO2 sendvič tipa izrađenih od komercijalno dostupnih nanomaterijala (1. dio) i korištenjem sintetiziranog Fe2O3/TiO2 napravljenog od čistih kemijskih prekursora (2. dio). U dijelu 1, kompoziti sendvič tipa izrađeni od komercijalnog TiO2-P25 i α-Fe2O3 dobiveni su centrifugiranjem tankih filmova s različitim konfiguracijama slojeva: i) sloj TiO2 preko α-Fe2O3 (TiO2@Fe2O3), ii) α-Fe2O3 sloj preko TiO2 (α-Fe2O3@TiO2), i iii) fizički pomiješano 50% (w/w) TiO2/ Fe2O3. Fotokatalitička aktivnost pod simuliranim sunčevim zračenjem gore spomenutih kompozita i njihovih čistih komponenti istražena je kroz praćenje razgradnje amoksicilina (AMX) u prisutnosti i odsutnosti persulfata (PS). U oba slučaja, TiO2@α-Fe2O3 sendvič tip postigao je najviše stope razgradnje AMX-a i primjećuje se značajan učinak dodatka PS na stopu razgradnje AMX-a. Utjecaj pH i koncentracije PS na brzinu razgradnje AMX-a utvrđen je primjenom eksperimentalnog dizajna i modeliranja površine odziva kojima su određeni optimalni ujveti [S2O82-] = 0,334 mM i pH = 4,0. Put razgradnje AMX proučavao je pomoću uklanjanja reaktivnih kisikovih vrsta i identifikacije međuprodukata tekućinskom kromatografijom s tandemskom spektrometrijom mase (LC-MS/MS). Njihovo nastajanje je u izravnoj korelaciji s povećanom toksičnošću procijenjenom testovima Daphnia magna i Vibrio fischeri. Nadalje, promjene biorazgradljivosti povezane su s profilom mineralizacije AMX otopine. Utvrđen je i utjecaj sastojaka vodene matrice (Cl-, CO32-, NO3-, PO43- i prirodne organske tvari rijeke Suwannee) na razgradnju AMX-a. U 2. dijelu, nanokompoziti Fe2O3/TiO2 proizvedeni su jednostavnom tehnikom impregnacije/kalcinacije korištenjem različitih količina željezovog (III) nitrata na komercijalnom TiO2 (P25 aeroksid). Pripremljeni nanokompoziti Fe2O3/TiO2 karakterizirani su difrakcijom X-zraka (XRD), Ramanovom spektroskopijom (RS), skenirajućom elektronskom mikroskopijom/energetsko-disperzijom spektroskopije (SEM/EDXS), fotoelektronskom spektroskopijom X-zraka (XPS), Brunauer– Emmett-Tellerova analiza (BET), spektroskopija elektronske impedancije (EIS), fotoluminiscencijska spektroskopija (PL) i spektroskopija difuzne refleksije (DRS). Kao rezultat toga, 5% (w/w) Fe2O3/ TiO2 postigao je najveću fotokatalitičku aktivnost u suspenzijskom sustavu i uspješno je imobilizirano na staklenoj podlozi. Fotokatalitička aktivnost pod zračenjem vidljivim svjetlom procijenjena je tretiranjem farmaceutskog amoksicilina (AMX) u prisutnosti i odsutnosti dodatnih oksidansa: vodikovog peroksida (H2O2) i persulfatnih soli (PS). Utjecaj pH i koncentracije PS na stopu konverzije AMX utvrđen je pomoću statističkog planiranja i modeliranja površine odziva. Određeni su optimalni uvjeti [S2O82-] = 1,873 mM i pH = 4,808; oni su također korišteni u prisutnosti H2O2 umjesto PS u dugoročnim testovima. Najbrža AMX pretvorba s konstantom brzine nultog reda od 1,51 × 10^-7 M·min^-1 postignuta je sustavom fotokataliza + PS. Utvrđen je put pretvorbe AMX, a evolucija/pretvorba nastalih međuprodukata povezana je s promjenama toksičnosti prema Vibrio fischeri. Uklanjanje reaktivnih kisikovih vrsta (ROS) također je korišteno za istraživanje mehanizma pretvorbe AMX, otkrivajući glavni doprinos fotogeneriranog h+ u svim procesima. El agua limpia accesible es una de las principales prioridades para el crecimiento económico sostenible y el bienestar social. El agua sustenta la vida y es un recurso crucial para la humanidad; también está en el centro de los ecosistemas naturales y la regulación del clima. El estrés hídrico es principalmente un problema de cantidad de agua, pero también ocurre como consecuencia del deterioro de la calidad del agua y la falta de una gestión adecuada del agua. Los problemas ambientales asociados con la contaminación del agua han sido un problema persistentemente importante en las últimas décadas, correlacionados negativamente con la salud y el ecosistema. La aparición de cantidades mínimas de antibióticos en varios cuerpos de agua estuvo directamente relacionada con el desarrollo de patógenos resistentes a los antibióticos. Durante las últimas dos décadas, las penicilinas se han recetado y utilizado ampliamente en toda Europa. Recientemente, la amoxicilina (AMX) se agregó a la segunda "lista de vigilancia" de la UE con base en la Decisión Europea propuesta 2018/840/EU. Su presencia en los efluentes de aguas residuales está relacionada con la eliminación limitada por parte de las plantas de tratamiento de aguas residuales (PTAR) comunes municipales basadas en el tratamiento primario (físico) y secundario (biológico). Por lo tanto, las nuevas técnicas de remediación deben aplicarse para eliminar dichas sustancias recalcitrantes. Recientemente, los procesos de oxidación avanzada (POA) han ganado mucha atención en la investigación debido a su capacidad innata para proporcionar una oxidación eficaz de una amplia variedad de contaminantes orgánicos persistentes en los métodos de tratamiento de aguas residuales convencionales. La eficacia de los AOP se basa en especies altamente reactivas y no selectivas, principalmente basadas en radicales hidroxilo (HO•). Entre varios AOP, la fotocatálisis de semiconductores atrae mucho la atención debido a la estabilidad del material semiconductor y el potencial para usar abundante energía solar para degradar contaminantes orgánicos. El fotocatalizador más ampliamente investigado y empleado en la purificación del agua es el TiO2. Sin embargo, el TiO2 sufre la rápida recombinación de las cargas fotogeneradas (es decir, pares de electrones/huecos; e-/h+) y solo es activo bajo la luz ultravioleta debido a su ancho de banda prohibida (3,0-3,2 eV), lo que dificulta su potencial para aplicaciones impulsadas por energía solar. Estas deficiencias se pueden mejorar mediante las siguientes estrategias: dopaje con metales y/o no metales, sensibilización de colorantes, incorporación con nanotubos de carbono, óxido de grafeno reducido y acoplamiento con otros semiconductores con bandas prohibidas estrechas. El acoplamiento de TiO2 con semiconductores de banda estrecha con respuesta de luz visible puede promover efectos sinérgicos entre dos materiales semiconductores que conducen a una separación de carga más eficiente y una alta actividad fotocatalítica bajo la irradiación de luz visible. El óxido de hierro (α-Fe2O3, también conocido como hematita) es un candidato prometedor para el acoplamiento con TiO2, debido a su abundancia, bajo costo, estabilidad y actividad de luz visible debido a su estrecha banda prohibida (2.0–2.2 eV). Lo que es más importante, las posiciones adecuadas del borde de la banda de hematita promueven la separación de carga fotogenerada en TiO2 a través de la transferencia de heterounión. A pesar de varias aplicaciones fotocatalíticas de los compuestos de Fe2O3/TiO2 para la eliminación de contaminantes emergentes (CEC), todos los estudios investigaron sus aplicaciones en la suspensión (es decir, empleando una forma de fotocatalizador en polvo), mientras que la aplicación de compuestos de Fe2O3/TiO2 inmovilizados es escasamente conocida. Informado. Además, rara vez se explora el tratamiento de AMX bajo luz solar/visible usando Fe2O3/TiO2, así como la ecotoxicidad de los subproductos de degradación/transformación de AMX. En esta disertación, se investigó la eliminación de AMX usando películas en capas tipo sándwich de Fe2O3/TiO2 hechas de nanomateriales disponibles comercialmente (Parte 1) y usando Fe2O3/TiO2 sintetizado hecho de precursores químicos puros (Parte 2). En la parte 1, se obtienen compuestos tipo sándwich hechos de TiO2-P25 y α- Fe2O3 comerciales mediante recubrimiento por rotación de películas delgadas con diferentes configuraciones de capa, a saber: i) capa de TiO2 sobre α- Fe2O3 (TiO2@α-Fe2O3), ii) capa de α-Fe2O3 sobre TiO2 (α-Fe2O3@TiO2), y iii) mezclado físicamente al 50 % (p/p) de TiO2/ Fe2O3. Se investiga la actividad fotocatalítica bajo irradiación solar simulada de los compuestos antes mencionados y sus componentes puros para la degradación de amoxicilina (AMX) en presencia y ausencia de persulfato (PS). En ambos casos, el tipo sándwich de TiO2@α-Fe2O3 logró las tasas de degradación más altas de AMX y se observa un marcado efecto de la adición de PS en la tasa de degradación de AMX. La influencia del pH y la concentración de PS en la tasa de degradación de AMX se establece mediante un diseño experimental y un modelo de superficie de respuesta que reveló condiciones óptimas de [S2O82−] = 0,334 mM y pH = 4,0. La ruta de degradación de AMX se estudia mediante la eliminación de especies reactivas de oxígeno y la identificación de intermediarios mediante cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Su evolución está directamente relacionada con una mayor toxicidad evaluada por los ensayos de Daphnia magna y Vibrio fischeri. Además, los cambios de biodegradabilidad están correlacionados con el perfil de mineralización de la solución AMX. También se establece la influencia de los componentes de la matriz del agua (Cl−, CO32−, NO3−, PO43− y la materia orgánica natural del río Suwannee) en la degradación de AMX. En la parte 2, se fabricaron nanocompuestos de Fe2O3/TiO2 mediante una sencilla técnica de impregnación/calcinación empleando diferentes cantidades de nitrato de hierro (III) sobre TiO2 comercial (aeróxido P25). Los nanocompuestos de Fe2O3/TiO2 preparados se caracterizaron mediante difracción de rayos X (XRD), espectroscopia Raman (RS), microscopia electrónica de barrido/espectroscopia de dispersión de energía (SEM/EDXS), espectroscopia de fotoelectrones de rayos X (XPS), Brunauer– Análisis de Emmett-Teller (BET), espectroscopia de impedancia de electrones (EIS), espectroscopia de fotoluminiscencia (PL) y espectroscopia de reflectancia difusa (DRS). Como resultado, el 5 % (p/p) de Fe2O3/ TiO2 logró la actividad fotocatalítica más alta en el sistema de suspensión y se inmovilizó con éxito en un soporte de vidrio. La actividad fotocatalítica bajo irradiación de luz visible se evaluó mediante el tratamiento de amoxicilina farmacéutica (AMX) en presencia y ausencia de oxidantes adicionales: peróxido de hidrógeno (H2O2) y sales de persulfato (PS). La influencia de la concentración de pH y PS en la tasa de conversión de AMX se estableció mediante planificación estadística y modelado de superficie de respuesta. Los resultados revelaron condiciones óptimas de [S2O82−] = 1,873 mM y pH = 4,808; estos también se utilizaron en presencia de H2O2 en lugar de PS en pruebas a largo plazo. La conversión AMX más rápida que poseía una constante de velocidad de orden cero de 1,51 × 10^-7 M·min^-1 se logró con el sistema de fotocatálisis + PS. Se estableció la ruta de conversión de AMX y se correlacionó la evolución/conversión de los intermedios formados con los cambios en la toxicidad hacia Vibrio fischeri. También se utilizó la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS) para investigar el mecanismo de conversión de AMX, lo que reveló la principal contribución del h+ fotogenerado en todos los procesos. L'aigua neta accessible és una de les màximes prioritats per al creixement econòmic sostenible i el benestar social. L'aigua dóna suport a la vida i és un recurs crucial per a la humanitat; també és el nucli dels ecosistemes naturals i la regulació del clima. L'estrès hídric és principalment un problema de quantitat d'aigua, però també es produeix com a conseqüència d'un deteriorament de la qualitat de l'aigua i la manca d'una gestió adequada de l'aigua. Els problemes ambientals associats a la contaminació de l'aigua han estat un tema persistentment important durant les últimes dècades, correlacionats negativament amb la salut i l'ecosistema. L'aparició de traces d'antibiòtics en diverses masses d'aigua estava directament relacionada amb el desenvolupament de patògens resistents als antibiòtics. Durant les dues últimes dècades, les penicil·lines s'han prescrit i utilitzat àmpliament a tot Europa. Recentment, l'amoxicil·lina (AMX) es va afegir a la segona "llista de seguiment" de la UE basada en la proposta de Decisió europea 2018/840/UE. La seva presència en els efluents d'aigües residuals està relacionada amb l'eliminació limitada de les depuradores municipals comunes (EDAR) basades en el tractament primari (físic) i secundari (biològic). Per tant, cal aplicar les noves tècniques de remediació per eliminar aquestes substàncies recalcitrants. Recentment, els processos d'oxidació avançats (AOP) han guanyat molta atenció en la investigació a causa de la seva capacitat innata de proporcionar una oxidació eficaç d'una àmplia varietat de contaminants orgànics persistents als mètodes convencionals de tractament de WW. L'eficàcia dels AOP es basa en espècies altament reactives i no selectives, basades principalment en radicals hidroxil (HO•). Entre els diversos AOP, la fotocatàlisi de semiconductors crida molt l'atenció a causa de l'estabilitat del material semiconductor i el potencial d'utilitzar energia solar abundant per degradar els contaminants orgànics. El fotocatalitzador més investigat i emprat en la purificació d'aigua és el TiO2, no obstant això, el TiO2 pateix la recombinació ràpida de càrregues fotogenerades (és a dir, parells d'electrons/forats; e-/h+) i només està actiu sota llum UV a causa de la seva gran bretxa de banda (3,0).-3,2 eV), dificultant així el seu potencial per a aplicacions impulsades per l'energia solar. Aquestes deficiències es poden millorar amb les següents estratègies: dopatge amb metalls i/o no metalls, sensibilització de colorants, incorporació amb nanotubs de carboni, òxid de grafè reduït i acoblament amb altres semiconductors amb bandes buides estretes. L'acoblament de TiO2 amb semiconductors de banda estreta amb resposta a la llum visible pot promoure efectes sinèrgics entre dos materials semiconductors que condueixen a una separació de càrrega més eficient i una alta activitat fotocatalítica sota irradiació de llum visible. L'òxid de ferro (α-Fe2O3, també conegut com a hematita) és un candidat prometedor per acoblar-se amb TiO2, a causa de la seva abundància, baix cost, estabilitat i activitat de la llum visible a causa de la seva banda estreta (2,0–2,2 eV). El més important és que les posicions de banda adequades de l'hematita promouen la separació de càrrega fotogenerada en TiO2 mitjançant transferència d'heterounió. Malgrat diverses aplicacions fotocatalítiques de compostos de Fe2O3/TiO2 per a l'eliminació de contaminants de preocupació emergent (CEC), tots els estudis van investigar les seves aplicacions a la suspensió (és a dir, emprant una forma de fotocatalitzador en pols), mentre que l'aplicació de compostos de Fe2O3/TiO2 immobilitzats amb prou feines són reportat. A més, rarament s'explora el tractament d'AMX sota llum solar / visible mitjançant Fe2O3/TiO2, així com l'ecotoxicitat dels subproductes de degradació / transformació d'AMX. En aquesta tesi, es va investigar l'eliminació d'AMX mitjançant pel·lícules en capes de Fe2O3/TiO2 tipus sandvitx fetes de nanomaterials disponibles comercialment (part 1) i utilitzant Fe2O3/TiO2 sintetitzat fet de precursors químics purs (part 2). A la part 1, els compostos de tipus sandvitx fets de TiO2-P25 i α-Fe2O3 comercials s'obtenen mitjançant pel·lícules primes de recobriment per gir amb diferents configuracions de capes, a saber: i) Capa de TiO2 sobre α-Fe2O3 (TiO2@α-Fe2O3), ii) La capa d'α-Fe2O3 sobre TiO2 (α-Fe2O3@TiO2) i iii) es va barrejar físicament el 50% (p/p) de TiO2/Fe2O3. S'investiga l'activitat fotocatalítica sota irradiació solar simulada dels compostos esmentats i dels seus components purs per a la degradació de l'amoxicil·lina (AMX) en presència i absència de persulfat (PS). En ambdós casos, el tipus sandvitx TiO2@α-Fe2O3 va aconseguir les taxes de degradació més altes d'AMX i es nota un efecte marcat de l'addició de PS sobre la taxa de degradació d'AMX. La influència de la concentració de pH i PS sobre la taxa de degradació d'AMX s'estableix mitjançant un disseny experimental i un modelatge de superfícies de resposta que va revelar condicions òptimes de [S2O82−] = 0,334 mM i pH = 4,0. La via de degradació de l'AMX s'estudia mitjançant l'eliminació d'espècies reactives d'oxigen i la identificació d'intermedis mitjançant cromatografia líquida amb espectrometria de masses en tàndem (LC-MS/MS). La seva evolució està directament correlacionada amb una toxicitat augmentada avaluada pels assaigs de Daphnia magna i Vibrio fischeri. A més, els canvis de biodegradabilitat estan correlacionats amb el perfil de mineralització de la solució AMX. També s'estableix la influència dels components de la matriu de l'aigua (Cl−, CO32−, NO3−, PO43− i matèria orgànica natural del riu Suwannee) en la degradació de l'AMX. A la part 2, es van fabricar nanocomposites Fe2O3/TiO2 mitjançant una tècnica d'impregnació / calcinació fàcil que utilitzava diferents quantitats de nitrat de ferro (III) en TiO2 comercial (aeròxid P25). Els nanocomposites Fe2O3/TiO2 preparats es van caracteritzar per difracció de raigs X (XRD), espectroscòpia Raman (RS), microscòpia electrònica d'escaneig/espectroscòpia dispersiva d'energia (SEM/EDXS), espectroscòpia fotoelectrònica de raigs X (XPS), Brunauer– Anàlisi Emmett-Teller (BET), espectroscòpia d'impedància electrònica (EIS), espectroscòpia de fotoluminescència (PL) i espectroscòpia de reflectància difusa (DRS). Com a resultat, el 5% (p/p) de Fe2O3/TiO2 va aconseguir l'activitat fotocatalítica més alta en el sistema de purins i es va immobilitzar amb èxit sobre suport de vidre. L'activitat fotocatalítica sota irradiació de llum visible es va avaluar tractant amoxicil·lina farmacèutica (AMX) en presència i absència d'oxidants addicionals: peròxid d'hidrogen (H2O2) i sals de persulfat (PS). La influència del pH i la concentració de PS en la taxa de conversió d'AMX es va establir mitjançant la planificació estadística i el modelatge de superfícies de resposta. Els resultats van revelar condicions òptimes de [S2O82−] = 1,873 mM i pH = 4,808; aquests també es van utilitzar en presència d' H2O2 en lloc de PS en proves a llarg termini. La conversió AMX més ràpida amb una constant de velocitat d'ordre zero d'1,51 × 10^−7 M· min^−1 es va aconseguir amb el sistema fotocatàlisi + PS. Es va establir la via de conversió AMX i l'evolució/conversió dels intermedis formats es va correlacionar amb els canvis de toxicitat cap a Vibrio fischeri. També es va utilitzar l'eliminació d'espècies reactives d'oxigen (ROS) per investigar el mecanisme de conversió d'AMX, revelant la principal contribució de l' h+ fotogenerat en tots els processos.

Pharmaceuticals, as one of the largest groups of contaminants of emerging concern (CECs), pose a threat to the environment and human health. Advanced Oxidation Processes (AOPs) have proven to be effective in the degradation of persistent, toxic, and non-biodegradable pollutants in water. Heterogeneous photocatalytic processes are multiparameter systems pertaining to AOPs based on in-situ generated radical, with overall effectiveness influenced by the different process parameters. Predicting the behaviour of photocatalytic AOPs by means of mathematical simulations is crucial not only for scale-up and process optimization, but also for controlling undesirable environmental effects such as the formation of by products with a higher toxicity than the parent compound. In this work, a multi-faceted approach was applied to develop a simulation model for the photocatalytic process for the degradation and mineralisation of pharmaceutical ibuprofen by UV-A/TiO2 P25. The mathematical – mechanistic model of heterogeneous photocatalysis includes a set of differential equations and takes into account the configuration of the photocatalytic reactor, the irradiation emission, the scattering of irradiation, the process parameters, the reaction kinetics and the degradation mechanism. The developed model was verified by experimental results obtained at different photocatalyst loadings. Coumarin and 1,4-benzoquinone were used as chemical probes to confirm the generation of hydroxyl and superoxide radicals and to fine-tune the chemical reactions in the model. To increase the robustness of the developed model, a variety of organic compounds whose structural features influence important mechanisms in photocatalytic treatment, such as adsorption on the TiO2 P25 surface and the prevalence of degradation by hydroxyl and superoxide radicals, were investigated using quantitative-structure activity/property relationship (QSA/PR) modelling. Adsorption was first investigated by a combined experimental/statistical approach using response surface method (RSM), which yielded a quadratic polynomial equation (QPE) describing adsorption for each organic compound studied. The coefficients of the QPE were related to structural features employing QSA/PR. The degradation of organic compounds by the UV-A/TiO2 P25 process in the presence of coumarin and 1,4-benzoquinone was studied, common radical scavengers for hydroxyl and superoxide radicals were investigated and coefficients were determined based on the kinetics obtained, that diversified the prevalence of oxidation or reduction mechanisms in the degradation of organic compounds. The determined coefficients were correlated with structural features of the investigated organic compounds by QSA/PR modelling. The simulation model developed by the proposed multi-faceted approach achieved good agreement between the predicted and experimental data. The QSA/PR modelling combined with RSM methodology accurately predicted the adsorption of organic compounds with complex molecular structure. The QSA/PR technique also successfully captured relevant structural features that determine degradation kinetics, so it can be used to increase the robustness of mathematical – mechanistic models which ensures their simulation capability for a wide range of organic structures. Farmaceutici, kao jedna od najvećih skupina onečišćivala koji izazivaju zabrinutost (eng. contaminants of emerging concern, CECs), predstavljaju prijetnju za okoliš i ljudsko zdravlje. Napredni oksidacijski procesi (eng. advanced oxidation processes, AOPs) su se pokazali učinkovitim u razgradnji postojanih, toksičnih i biološki nerazgradivih onečišćenja u vodi. Heterogeni fotokatalitički procesi kao dio AOP-a su višeparametarski sustavi, koji se temelje na in-situ generiranju radikala, pri čemu na ukupnu učinkovitost utječu različiti parametri procesa. Predviđanje ponašanja fotokatalitičkih AOP-a primjenom matematičkih simulacija važno je ne samo za uvećanje i optimizaciju procesa, nego i za kontrolu nepoželjnih učinaka na okoliš kao što su stvaranje toksičnijih nusprodukata u odnosu na primarni spoj. U ovom radu primijenjen je višestrani pristup za razvoj simulacijskog modela fotokatalitičke razgradnje i mineralizacije farmaceutika ibuprofena UV-A/TiO2 P25 procesom. Razvijeni matematičko – mehanistički model za heterogenu fotokatalizu sastoji se od seta diferencijalnih jednadžbi koje uključuju konfiguraciju fotokatalitičkog reaktora, emisiju zračenja, raspršenje zračenja, parametre procesa, kinetiku reakcije te mehanizam razgradnje. Razvijeni model verificiran je eksperimentalnim rezultatima dobivenih pri različitim koncentracijama fotokatalizatora. Kumarin i 1,4-benzokinon primijenjeni su u svrhu potvrde generiranja hidroksilnih i superoksidnih radikala te za fino podešavanja kemijskih reakcija na koje utječu u razvijenom modelu. Kako bi se povećala robusnost razvijenog modela istraženi su utjecaji strukturnih značajki različitih organskih spojeva na važne mehanizme fotokatalitičkog procesa, ponajprije na adsorpciju onečišćivala na površini TiO2 P25 te relativni doprinos razgradnji hidroksilnim i superoksidnim radikalima, primjenom kvantitativnog odnosa aktivnosti/svojstava strukture (eng. quantitative structure activity/property, QSA/PR) modeliranja. Adsorpcija je ispitana objedinjenim eksperimentalno/statističkim pristupom korištenjem metode odzivnih površina (eng. response surface methodology, RSM), a rezultat su kvadratne polinomne jednadžbe (eng. quadratic polynomial equation, QPE) koje opisuju adsorpciju za svaki pojedini ispitivani organski spoj. Koeficijenti iz QPE jednadžbi korelirani su sa strukturnim značajkama organskih spojeva primjenom QSA/PR modeliranja. Razgradnjom odabranih organskih spojeva UV-A/TiO2 P25 procesom u prisutnosti kumarina i 1,4-benzokinona, hvatača hidroksilnih i superoksidnih radikala, dobiveni su kinetički modeli te su određeni koeficijenti iz kojih je razvidan doprinos oksidacijskih i redukcijskih mehanizama prilikom razgradnje organskih spojeva. Dobiveni koeficijenti su zatim uspješno korelirani sa strukturnim značajkama ispitivanih organskih spojeva primjenom QSA/PR modeliranja. Simulacijski model, razvijen predloženim višestranim pristupom, ukazuje na dobro slaganje predviđenih i eksperimentalnih podataka. QSA/PR modeliranje kombinirano s RSM metodologijom točno predviđa adsorpciju organskih spojeva složenih molekulskih struktura. QSA/PR metodologija je uspješno ukazala na relevantne strukturne značajke koje određuju kinetiku razgradnje te se može primijeniti za uvećanje robusnosti matematičko – mehanističkog modela, što osigurava sposobnost simulacije modela za širok raspon organskih spojeva.

Wheat bran is an edible by-product rich in dietary fibre and polyphenolic compounds, whose addition in cereal foods diminishes their technological and sensory properties. Three-dimensional (3D) printing technology could provide consumers with a more diverse range of healthier snacks with added bran. This study focused on bran pre-processing (using micronisation, lactic acid fermentation, enzymes, high-intensity ultrasound, microwaves or pulsed light) and their incorporation into 3Dprinted oat snacks or breakfast cereals. Bran pre-processing with high-intensity ultrasound, microwaves and pulsed light reduced polyphenol oxidase activity (by 93%, 83%, or 78%, respectively) and enzymatic darkening of dough. Ultrasonication also lessened the activity of lipase (by 64%) and peroxidase (by 90%) and prolonged bran shelf-life. Bran fermentation degraded fructans by 93%. Preprocessing of the bran contributed to the high printing precision (up to 95%) and minimized deformation in baking (to 5%), and resulted in snack products and breakfast cereals of the desired properties. Pšenične posije su jestivi nusproizvod i bogat izvor prehrambenih vlakana i polifenolnih spojeva čiji dodatak rezultira nepoželjnim promjenama tehnoloških i senzorskih svojstava proizvoda od žitarica. Tehnologija trodimenzijskog (3D) tiska bi potrošačima mogla pružiti raznovrsniju ponudu zdravijih snack-proizvoda s dodanim posijama. U ovoj disertaciji istražena je prethodna brada posija (usitnjavanje, kisela fermentacija, enzimski tretman, ultrazvuk visokog intenziteta, mikrovalovi ili pulsirajuće svijetlo) i njihov dodatak u 3D tiskani zobeni snack-proizvod ili žitarice za doručak. Prethodna obrada posija ultrazvukom visokog intenziteta, mikrovalovima i pulsirajućim svjetlom smanjila je aktivnost polifenol oksidaze (za 93%, 83%, odnosno 78%) te enzimatsko tamnjenje tijesta. Ultrazvučna obrada rezultirala je i smanjenjem aktivnosti lipaze (za 64%) i peroksidaze (za 90%) te produljenom trajnošću posija. Fermentacija posija razgradila je udio fruktana za 93%. Prethodna obrada posija pridonijela je visokoj preciznosti tiska (do 95%) i smanjenju deformacije proizvoda pečenjem (na 5%), te rezultirala snack-proizvodima i žitaricama za doručak željenih svojstava.

This research aimed to develop and implement alternative purification solutions into the production of biodiesel from sustainable feedstocks. The goal was to use deep eutectic solvents (DESs) for extractive deacidification of waste acidic feedstocks and extractive purification of crude biodiesel. Feedstocks included in the work ranged from slightly acidic, such as waste coffee ground oils (WCGO) and waste cooking oils (WCO), to very acidic like waste animal fats of Category 1 and 2 (WAF1) and Category 3 (WAF2), according to the animal by-product categorisation. Biodiesel was produced via base-catalysed transesterification, which required feedstock purification before the reaction. The study started with eight DESs of various properties - ranging from acidic to basic, from slightly to highly viscous. Six were choline chloride-based, and two were based on potassium carbonate. DESs were used for the removal of free fatty acids (FFA) from feedstocks via extractive deacidification. The results demonstrated that purification efficiency depended on the solvent's pH value, with two basic, potassium carbonate-based DESs exhibiting the highest efficacy. This conclusion raised the question of whether the efficiency was due to extraction or neutralisation. Further experiments revealed that it depended on the DES to feedstock mass ratio. The extraction was occurring at low mass ratios, while neutralisation was observed only at high mass ratios. Potassium carbonate : ethylene glycol (1:10, mol.) DES was chosen as the most suitable for deacidification, at DES to feedstock mass ratios 0.1:1 and 0.25:1, depending on the initial FFA content. The research into feedstock purification was extended to metals and trace elements (Na, K, Ca, Mg, P, B and Fe) purification, and four DESs were used for that purpose. Two were based on choline chloride, and two on potassium carbonate, with ethylene glycol and glycerol as hydrogen bond donors. DESs were compared against two commercial adsorbents and proved more efficient for removing most of the investigated impurities. The initial feedstock impurities composition highly influenced the purification efficiency - with a lower driving force, the mass transfer was slower for all tested purification methods. Upon identifying the best feedstock purification solvent, the investigation proceeded to biodiesel synthesis and crude biodiesel purification. Transesterification was conducted with methanol in the presence of KOH or NaOH. KOH proved slightly better. The ratio of methanol and catalyst to oil was also varied, and their influence was almost negligible in the investigated range. Crude biodiesels were then purified with choline chloride : ethylene glycol (1:2.5 mol.) DES. The experiments were conducted to determine the optimal extraction duration and DES/biodiesel mass ratio. Results showed that the chosen DES was very effective for removal of free and total glycerol. Long extraction time or high mass ratios resulted in a slight decrease in fatty acid methyl ester (FAME) content, except in WAF1, leading to the conclusion that unsaturated FAME slightly dissolved in the DES, while saturated ones present in fat did not. Purification of WCGO biodiesel was also conducted in a continuous Karr column. Stabilisation was achieved after 15 minutes, and purified biodiesel satisfied the criteria for FAME, free glycerol and total glycerol content. Svrha ovog istraživanja je razvoj nove alternativne metode pročišćavanja te njena primjena u procesu proizvodnje biodizela. Cilj rada je primjena niskotemperaturnih eutektičkih otapala (engl. deep eutectic solvents, DES) za uklanjanje nečistoća iz kiselih sirovina te ekstrakciju glicerola i glicerida iz sirovog biodizela. U radu su korištene sirovine niske kiselosti poput ulja od otpadnog taloga kave (engl. waste coffee ground oil, WCGO) i otpadnog jestivog ulja (engl. waste cooking oil, WCO), te visoke kiselosti, poput tehničke masti kategorije 1 i 2 (engl. waste animal fat 1, WAF1) te otpadne masti kategorije 3 (engl. waste animal fat 2, WAF2), prema kategorizaciji životinjskih nus-proizvoda. Sirovinama je titracijom određen kiselinski broj i sve su sadržavale iznad 1 % slobodnih masnih kiselina, zbog čega ih je bilo nužno pročistiti. Kiseline su uklonjene ekstrakcijom pomoću DES-ova kako bi se izbjegla moguća saponifikacija prilikom proizvodnje biodizela procesom lužnato katalizirane transesterifikacije. Metanol je korišten kao reaktant, a kalijev hidroksid ili natrijev hidroksid (KOH ili NaOH) kao katalizatori. Istraživanje je započelo pripremom osam različitih DES-ova, odabranih tako da pokrivaju širok raspon različitih svojstava, poput pH-vrijednosti, viskoznosti, gustoće i ionske vodljivosti. Šest otapala pripravljeno je s kolin-kloridom, a preostala dva s kalijevim karbonatom. Otapala su karakterizirana u temperaturnom rasponu od 20 do 60 °C (s korakom od 10 °C). Određeni su pH, viskoznost, indeks loma i ionska vodljivost. Molarni volumeni izračunati su na temelju literaturnih podataka o gustoći. Polarnost otapala mjerena je pri sobnoj temperaturi. DES-ovi su korišteni za pročišćavanje sirovina različite početne kiselosti – WAF1, WAF2 te WCGO. Cilj je bio odrediti postoji li veza između svojstava otapala i ekstrakcijske učinkovitosti, kako bi se olakšalo pretraživanje otapala za slične primjene. Eksperimenti su provedeni na magnetskoj miješalici s grijanjem, pri 60 °C, 500 o/min, u trajanju od 3 sata uz maseni omjer otapala i sirovine 1:1. Po završetku eksperimenta, kiselinski broj uzoraka određen je titracijom, a uzorci su analizirani primjenom infracrvene spektroskopije s Fourierovim transformacijama (engl. Fourier transformation infrared spectroscopy, FTIR) te protonske nuklearne magnetske spektroskopije (engl. proton nuclear magnetic resonance spectroscopy, 1H NMR). Rezultati su pokazali da učinkovitost ekstrakcije najviše ovisi o pH-vrijednosti otapala, pri čemu su najučinkovitija bila dva lužnata DESa bazirana na kalijevu karbonatu. Unatoč početnim očekivanjima, viskoznost i ionska vodljivost otapala nisu imali znatnu ulogu u procesu ekstrakcije. Ti zaključci nametnuli su pitanje o mehanizmu deacidifikacije - događa li se u procesu ekstrakcija ili neutralizacija kiselina lužnatim otapalom? S ciljem pronalaženja odgovora na to pitanje, provedeni su dodatni eksperimenti s najučinkovitijim DES-om (DES H: kalij-karbonat : etilen-glikol, 1:10 mol.) i najkiselijom sirovinom (WAF1), pri različitim omjerima otapala i masti. Otkriveno je da pri visokim masenim omjerima otapala i sirovine dolazi do otapanja otapala u masti te neutralizacije, dok se pri nižim omjerima (0,1:1 te 0,25:1) deacidifikacija odvija ekstrakcijom. U zasebnom eksperimentu s uljem iz kave (WCGO) otkriveno je da do neutralizacije ne dolazi pri 25 °C, čak i pri omjeru 1:1. Zaključeno je da je DES H optimalno otapalo za deacidifikaciju zbog visoke učinkovitosti i male viskoznosti te da su najučinkovitiji manji maseni omjeri, 0,1:1 ili 0,25:1, ovisno o početnoj kiselosti sirovine. U nastavku istraživanja pročišćavanja sirovine, fokus je proširen na uklanjanje metala i elemenata u tragovima (Na, K, Ca, Mg, P, B, Fe) iz WAF1, WAF2 i WCO. Četiri DES-a su korištena za tu svrhu, dva na bazi kolin-klorida i preostala dva na bazi kalijeva karbonata, u kombinaciji s etilen-glikolom i glicerolom. Za usporedbu, eksperimenti su provedeni i s dva komercijalna adsorbensa. Različite kombinacije eksperimenata provedene su za tri sirovine različitog početnog sastava nečistoća - provedeni su procesi adsorpcije i ekstrakcije, a zatim višestupnjeviti procesi poput ekstrakcije praćene adsorpcijom, dvostupnjevite ekstrakcije s dva različita otapala te trostupnjevite ekstrakcije. Eksperimenti su provedeni pri 60 °C, u trajanju od 3 h, pri 500 o/min. Udio adsorbensa bio je 5 % i 1 %, a maseni omjer otapala i sirovine 1:1, te u kasnijim eksperimentima s lužnatim DESom 0,1:1. Ispitan je i utjecaj masenog omjera otapala i sirovine na učinkovitost ekstrakcije. Maseni omjeri bili su 1:1, 2:1 te 3:1, a ekstrakcija je provedena u tri stupnja. Uzorci su karakterizirani optičkom emisijskom spektrometrijom induktivno spregnute plazme (engl. inductively coupled plasma optical emission spectrometry, ICP-OES), uz prethodnu pripremu mikrovalnom razgradnjom, te FTIR i 1H NMR spektroskopijom. Učinkovitost ekstrakcije metala i elemenata u tragovima iz sirovine najviše ovisi o početnom sadržaju nečistoća u sirovini - učinkovitost je znatno veća kod sirovine s najvećim udjelom nečistoća zbog veće pokretačke sile. Općenito, ekstrakcija se pokazala znatno učinkovitijom od adsorpcije. Sva ispitana otapala pokazala su veliku djelotvornost, uz iznimku otapala s kalijevim karbonatom koja su se djelomično otapala u sirovini i time povećavala udio kalija u uzorku. Pri udjelu od 5 %, adsorbensi su se otapali u masti i povećavali udio Mg i Ca, što se eliminiralo smanjenjem udjela na 1 %. Ukupna djelotvornost adsorpcije time je bila nešto niža, ali nije dolazilo do otapanja adsorbensa. Zatim je ispitan utjecaj kiselosti sirovine na učinkovitost adsorpcije, zbog čega je prvo provedena ekstrakcija-deacifikacija s DESom na bazi kalijeva karbonata pri omjeru 1:1, praćena adsorpcijom s 1 % adsorbensa. Pokazalo se da adsorbensi dobro uklanjaju zaostali kalij. Temeljem tih spoznaja, provedena je dvostupnjevita ekstrakcija s dva otapala - prvo s otapalom na bazi kalijeva karbonata pri nižem masenom omjeru (0,1:1), a zatim i s otapalom na bazi kolin-klorida kako bi se uklonio višak kalija koji zaostaje za prvim otaplom. Učinkovitost ekstrakcije DES-om s kalijevim karbonatom pri omjeru 0,1:1 niža je nego pri omjeru 1:1, ali se znatno smanjuje i količina zaostalog kalija. Učinkovitost DES-a s kolin-kloridom u drugom stupnju znatno je niža nego kod jednostupnjevitog procesa, zbog manje pokretačke sile. Najveću djelotvornost pokazao je DES kolin-klorid : etilen-glikol (1:2,5 mol.). Povećanjem masenog omjera s 1:1 na 2:1 i 3:1, kao i provođenjem ekstrakcije u tri stupnja, ta djelotvornost je neznatno povećana. Sljedeći korak istraživanja bio je sintetiziranje i pročišćavanje biodizela. Biodizel je sintetiziran iz prethodno pročišćenih WCGO, WAF1 i WCO, u reaktoru pri 60 °C. Prilikom sinteze istražen je utjecaj vrste katalizatora na čistoću dobivenog biodizela. KOH se pokazao učinkovitijim od NaOH. Potom je istražen utjecaj masenog omjera katalizatora prema metanolu i sirovini, u omjerima 0,1:40:100, 0,5:40:100 i 1:40:100. Pokazalo se kako najmanji udio katalizatora ne daje zadovoljavajuće rezultate, odnosno da ne nastaje biodizel zadovoljavajuće koncentracije metilnih estera masnih kiselina (eng. fatty acid methyl esters, FAME). Također, prilikom sinteze biodizela iz WAF1 pokazalo se da uz najveću količinu katalizatora dolazi do neutralizacije i nastanka soli. Nakon toga, s fiksnom količinom katalizatora ispitan je utjecaj masenog omjera metanola prema sirovini, i to u omjerima 30:100, 40:100 i 50:100. Sva tri omjera davala su biodizel zadovoljavajuće čistoće i nije primijećen veći rast udjela FAME s porastom količine metanola. Prema tome, optimalnim su se pokazali omjeri 0,5:40:100 i 1:40:100. Nakon sinteze, uzorci sirovih biodizela pročišćeni su kapljevinskom ekstrakcijom pomoću DES-a kolin-klorid : etilen-glikol, molarnoga omjera 1:2,5. Istražen je utjecaj masenog omjera DES-a i biodizela, te vremena trajanja ekstrakcije. Sve ekstrakcije provedene su pri 25 °C, na magnetskoj miješalici pri 500 o/min. Za biodizele iz ulja WCGO i WCO pokazalo se da produljenjem trajanja ekstrakcije dolazi do smanjenja udjela FAME u konačnom biodizelu, što navodi na zaključak da su nezasićene FAME koje su prisutne u uljima djelomično topljive u odabranom otapalu. Unatoč tome, sadržaj FAME u pročišćenim biodizelima ispunjavao je minimalne zahtjeve, odnosno bio je iznad 96,5 %. Kod biodizela iz masti WAF1 pokazao se suprotan trend, odnosno ispostavilo se da su zasićene FAME manje topljive u DES-u nego nezasićene. DES je također uspješno ekstrahirao skoro sav slobodni glicerol te je smanjio sadržaj ukupnog glicerola u biodizelu. S povećanjem omjera DES-a i biodizela dolazi do poboljšanja učinkovitosti ekstrakcije, s time da je i pri najmanjem ispitanom omjeru DES izuzetno učinkovit. Po završetku šaržnih eksprimenata ekstrakcije, biodizel iz WCGO pripremljen je u većoj količini i pročišćen u koloni s pulsirajućim pliticama. Uzorci su uzimani svakih 5 minuta tijekom ekstrakcije i karakterizirani snimanjem 1H NMR spektara. Promatrajući udio FAME u pravilnim vremenskim periodima, zaključeno je da do stabilizacije dolazi nakon 15 minuta ekstrakcije. Pročišćeni biodizel je karakteriziran i zadovoljavao je zahtjeve norme HRN EN 14214 prema svim ispitanim svojstvima, uključujući i udio FAME te sadržaj glicerola i glicerida. Ispitani DES pokazao se kao izuzetno djelotvoran za pročišćavanje biodizela u šaržnim i kontinuiranim eksperimentima. U ovom radu uspješno je provedeno pročišćavanje otpadnih održivih sirovina za proizvodnju biodizela DES-ovima. Slobodne masne kiseline najuspješnije su uklonjene ekstrakcijom pomoću DES-a kalijev karbonat : etilen-glikol (1:10), a metali i elementi u tragovima pomoću DES-a kolin-klorid : etilen-glikol (1:2,5). Potonji se pokazao izuzetno učinkovit i za pročišćavanje biodizela, ukanjajući skoro sav slobodni glicerol. U sklopu rada, DES na bazi kalijeva karbonata prvi je put upotrijebljen za ekstrakcijsku deacidifikaciju, a i sama ekstrakcijska deacidifikacija prvi je put provedena na otpadnim životinjskim mastima, otpadnom jestivom ulju te otpadnom ulju od kave. Također, DES-ovi su prvi put primijenjeni za pročišćavanje metala i elemenata u tragovima iz otpadnih sirovina i pokazali su izuzetnu učinkovitost za tu primjenu. Iz pročišćenih sirovina proizveden je biodizel koji je nakon pročišćavanja zadovoljavao standarde kvalitete, dokazujući još jednom učinkovitost DES-ova u procesu proizvodnje biodizela.

A model representing the steady–state and dynamic behaviour of a Haber-Bosch ammonia plant was developed based on plant data from Croatian fertilizer company Petrokemija Plc. Kutina. The plant model was developed with the aim to study the performance of advanced control strategy and optimize the economic performance of the plant. Industrial ammonia plant within fertilizer production asset typically comprises eight highly integrated catalysed process steps with many process units, heat integration, and gas recycles. The intensive nature of the ammonia production process with many nested mass and energy streams makes it a significant challenge to design the appropriate control system. The objective of the research was to design an optimal control strategy based on the plant model. The model takes the main dynamic relationship between the ammonia production rate and other relevant process parameters in downstream and upstream units. As an additional feature, online monitoring of the reforming catalyst and reformer tubes performance in the steam–natural gas reformer as the main energy consumer of an ammonia plant was considered. In order to design an optimised advanced control system, the plant model was divided into three logical process units to reduce the computational effort needed for the optimal synthesis gas preparation, raw synthesis gas purification, and ammonia synthesis loop. With respect to achieving scientific contribution and subsequently practical implementation of the proposed control strategy, a custom advanced process control scheme has been developed that uses programmed cascade functions to predict and adjust critical process parameters in ammonia production. Specifically, it was developed an advanced ratio–cascade process control scheme, which provides efficient disturbance rejection. To reach an optimal economic level the ammonia production rate (set point) acts as the primary/master control loop while holding the steam–to–natural gas and air–to–natural gas molar ratios as secondary/slave controllers. To enhance the profit of the ammonia plant the economic profit objective function is proposed. Feedback from the profit function is used in the advanced process control scheme as an input to bring the ammonia plant operation to the maximum profitability level. The benefits of the developed process control strategy are more effective disturbances’ rejection, simplification of ammonia process control operation, and plantwide optimization of the overall ammonia plant. The developed model offers the opportunity to operate the plant with higher energy and throughput efficiency with more comprehensive insight into the operation of the catalysts and reformer tubes with the possibility to predict its lifetime. With the practical implementation of the proposed control scheme, an ammonia plant can increase profitability, availability, improve safety, and handle environmental related issues. Na temelju procesnih podataka s postrojenja za proizvodnju amonijaka baziranog na Haber- Boschovom postupku u sastavu kompleksa proizvodnje mineralnih gnojiva Petrokemije d.d. Kutina, razvijeni su statički i dinamički modeli procesa proizvodnje amonijaka. Model postrojenja razvijen je za izvedbu napredne strategije vođenja i analize njezinog utjecaja na ekonomske pokazatelje procesa proizvodnje amonijaka. Tipično postrojenje za proizvodnju amonijaka integrirano u proizvodnju mineralnih gnojiva karakterizira nekoliko kemijskih reakcija za čije odvijanje je nužno osam različitih katalizatora uz maksimalno učinkovito korištenje toplinske energije i recikliranje sinteznog plina što se postiže različitom stacionarnom i rotacionom procesnom opremom. Kompleksnost procesa proizvodnje amonijaka, koje uključuje međusobnu povezanost materijalnih i energetskih procesnih tokova, predstavlja značajni izazov prilikom projektiranja sustava za vođenje procesa. Svrha ovog istraživanja bila je unaprijediti sustav za vođenje postrojenja proizvodnje amonijaka na temelju detaljnog modela procesa. Model procesa uzima u obzir sve odnose između proizvodnog kapaciteta i drugih bitnih procesnih parametara u ostalim dijelovima postrojenja. Modelom procesa prati se i rad katalizatora i katalitičkih cijevi u dijelu parnog reforminga prirodnog plina kao najvećeg potrošača energije u proizvodnji amonijaka. U cilju optimizacije sustava vođenja, model je podijeljen u tri sekcije kako bi se smanjilo potrebno vrijeme za provedbu izračuna parametara modela. Osnovne sekcije su priprema sinteznog plina, pročišćavanje sinteznog plina i procesna petlja sinteze amonijaka. Znanstveni doprinos i praktična primjena temelji se na razvoju prilagođene napredne metode kontinuiranog vođenja procesa u kojoj se primjenjuju programirane kaskadne funkcije za predviđanje i podešavanje kritičnih procesnih parametara tijekom proizvodnje amonijaka. Razvijena metoda temelji se na kaskadnoj regulacija omjera temeljenog na prediktivnom vođenju za kompenzaciju poremećaja u procesu. U cilju smanjenja operativnih troškova proizvodnje predložena je ekonomska funkcija cilja. Rezultat ekonomske funkcije cilja unaprijeđeni je sustav vođenja koji osigurava rad postrojenja za proizvodnju amonijaka uz minimalne operativne troškove. Doprinos istraživanja na osnovi razvijenog naprednog sustava vođenja su bolja kompenzacija procesnih poremećaja, unaprjeđenje vođenja i optimizacija postrojenja proizvodnje amonijaka. Boljim vođenjem procesa očekuje se veća djelotvornost kemijskih reakcija i toplinske energije uz mogućnost praćenja i predviđanja rada katalizatora za parni reforming prirodnog plina i katalitičkih cijevi. Praktičnom primjenom predloženog naprednog sustava vođenja u procesu proizvodnje amonijaka može se smanjiti varijabilni trošak proizvodnje, povećati dostupnost rada postrojenja, poboljšati sigurnost te smanjiti emisija stakleničkih plinova.

Statins, also known as 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase inhibitors, are the most widely prescribed lipid-lowering drugs in the world. Even though well-established chemical approaches for the production of statins are employed, they are time-consuming and require a large number of steps. The increasing commercial demand for statins and requirements for their high chemical and stereochemical purity have led to immense efforts to find a more efficient and economical production of chiral statin side-chain precursors. Due to the nature of enzymes to perform highly stereoselective attacks under mild conditions, biocatalysis represents the most attractive alternative. The objective of this thesis was the development of two enzymatic cascades for the synthesis of two distinctive statin side-chain precursors. The kinetics of each elementary reaction within the multi-enzyme system and the impact of all present compounds (organic compounds: substrates and products) on the enzyme stability were determined. The developed mathematical models were validated in different reactor types (batch, repetitive batch, and fed-batch reactor). Using the validated models, the reaction conditions were optimized with respect to production of optimum quantity of key molecules and volume productivity. The research was based on the following hypotheses: 1. The kinetic models and enzyme stability properties will enable determination of the most suitable strategy for the implementation of a multi-enzyme process. 2. The mathematical models will enable determination of optimal reaction conditions. 3. The optimized multi-enzyme process for the synthesis of statin side-chain precursors will become an attractive alternative to chemical methods. Two different routes towards the production of statin side-chain precursors were examined, which differed in starting materials and used enzymes. The first statin side-chain precursor was obtained by conducting a reaction that involved a 2-deoxyribose-5-phosphate aldolase (DERA), an NAD(P)-dependent dehydrogenase (DH), and a halohydrin dehalogenase (HHDH), while the second precursor was synthesized by carrying out a tandem reaction consisting of DERA and DH, whereby different genetically modified DERA and DH variants were tested, using inexpensive, easily-accessible aldehydes. To make the DH-catalyzed reactions economically feasible, for each reaction an in situ NAD(P)+ regeneration system was examined using an NAD(P)H-dependent oxidase (NOX). The influence of different pH, buffers and organic compounds (substrates and products) on the activity and/or stability of all applied enzymes was investigated. The kinetic data of each elementary reaction within the multi-enzyme system was obtained applying the initial reaction rate method. The developed kinetic models and the data obtained from the enzyme stability measurements enabled the determination of the most suitable strategy for the implementation of a multi-enzyme process. The mathematical models were developed for different reactor modes and the proposed models were experimentally validated. The possibility of running multi-enzyme one-pot reactions was examined as well. It was experimentally proven that all cascade reactions could be conducted in a sequential multi-step one-pot manner with an integrated coenzyme regeneration system working as simultaneous one-pot in order to obtain industrially relevant metrics. The validated mathematical models were used for further optimization of reaction conditions. Based on the obtained results and calculated metrics, optimal reaction setups and enzymes were found. The validated mathematical models represent a valuable basis for future application in the examined multi-enzyme-catalyzed synthesis of statin side-chain precursors. Statini spadaju u najčešće propisivane lijekove današnjice za snižavanje lipida u krvi. Iako se za njihovu proizvodnju primjenjuju dobro uhodane kemijske metode, one su dugotrajne i sastoje se od velikog broja koraka. Zbog sve veće potražnje za statinima i zbog zahtjeva za njihovom visokom kemijskom i stereokemijskom čistoćom ulažu se veliki napori u pronalaženju učinkovitih i ekonomski prihvatljivih procesa proizvodnje kiralnih prekursora bočnog lanca statina. Iz tog razloga razvijaju se biokatalitički procesi njihove sinteze. Naime, primjena enzima predstavlja vrlo atraktivnu alternativu kemijskim procesima zbog činjenice da kataliziraju stereoselektivne reakcije pri vrlo blagim reakcijskim uvjetima koje rezultiraju proizvodnjom produkata visoke enantiočistoće. Cilj istraživanja bio je razvoj dviju enzimskih kaskada u svrhu proizvodnje dvaju prekursora statina. Određena je kinetika svake pojedine reakcije unutar postavljenih višeenzimskih sustava te utjecaj svih prisutnih komponenata reakcija (organskih spojeva: supstrata i produkata) na stabilnost enzima. Razvijeni matematički modeli reakcija validirani su u različitim izvedbama reaktora (šaržni reaktor, ponovljivi šaržni reaktor, šaržni reaktor s dotokom). Primjenom validiranih matematičih modela optimirani su reakcijski uvjeti s ciljem proizvodnje optimalne količine ključnih molekula i postizanje visoke volumne produktivnosti. Istraživanje se temeljilo na hipotezama kako će kinetički modeli i informacije o stabilnosti enzima omogućiti definiranje najprikladnije strategije implementacije višeenzimskog sustava, da će se primjenom matematičkog modeliranja utvrditi optimalni reakcijski uvjeti te će optimirani višeenzimski sustav za proizvodnju prekursora bočnih lanaca statina biti atraktivna alternativa trenutno zastupljenim kemijskim metodama. Istraživane kaskade razlikovale su se u polaznim molekulama (supstratima) i primijenjenim enzimima. Supstrati koji su se koristili za potrebu sinteza prekursora bili su ekonomski prihvatljivi i lako dostupni aldehidi, a reakcije su bile katalizirane kombinacijom enzima različitih skupina. Supstrati prve rute bili su kloroacetaldehid (CAA) i acetaldehid (AA), dok su supstrati druge rute bili N-(3-oksopropil)-2-fenilacetamid (OPA) i AA. Prva se kaskada sastojala od enzima 2-deoksiriboza-5-fosfat-aldolaze (DERA), NAD(P)-ovisne dehidrogenaze (DH) i halogenhidrin-dehalogenaze (HHDH001), dok se druga sastojala od enzima DERA i DH, pri čemu su bile korištene različite genetički modificirane varijante enzima DERA i DH. S obzirom na to da su određeni stupnjevi reakcija bili katalizirani enzimom DH, ispitana je mogućnost primjene regeneracije koenzima NAD(P)+ in situ primjenom NAD(P)H-ovisne oksidaze (NOX). Prva reakcijska ruta (slika 1.) sastojala se od dvostruke aldolne adicije, oksidacije te od dehalogenacije i otvaranja prstena epoksida u pristustvu jakoga nukleofila. Dvostruka aldolna adicija bila je katalizirana enzimom DERA (DERATm ili DERA024). Prva aldolna adicija AA na CAA rezultirala je nastajanjem međuprodukta 4-kloro-3-hidroksibutanala (CHB), dok je adicijom druge molekule AA na međuprodukt CHB dobiven konačni aldolni produkt 6-kloro-3,5-dihidroksiheksanal (CDH). Oksidacija dobivenog aldehida CDH-a u 6-kloro-3,5-dihidroksiheksansku kiselinu (CDHA) provedena je primjenom enzima DH. U tu svrhu ispitana su dva različita enzima: NAD-ovisna aldehid dehidrogenaza (AlDH) i NADP-ovisna ketoreduktaza (KRED332). Regeneracija koenzima NAD+ provedena je implementacijom regeneracijskog sustava in situ uvođenjem enzima NADH-ovisne oksidaze (NOX009), koja kao kosupstrat zahtjeva kisik. Treći, a ujedno posljednji stupanj kaskade, bila je reakcija katalizirana enzimom HHDH (HHDH001). Enzim HHDH001 katalizira reakciju dehalogenacije CDHA-a, čime se na mjestu klorida fomira epoksid te nastaje konačni produkt 3-hidroksi-4-(oksiran-2-il)-butanska kiselina (HOBA). Ukoliko se reakcija provodi uz dodatak jakog nukleofila, poput kalijeva cijanida, enzim HHDH001 katalizira dvostupnjevitu reakciju nastanka 6-cijano-3,5-dihidroksiheksanske kiseline (CYDHA) preko gore spomenutog međuprodukta HOBA. Druga reakcijska ruta (slika 2.) sastojala se od dvostruke aldolne adicije i oksidacije nastalog aldolnog produkta. Dvostruke aldolne adicije bila je katalizirana enzimom DERA062, dok je oksidacija aldola bila katalizirana NADP-ovisnom DH (KRED354). Reakcija katalizirana enzimom DERA062 rezultirala je produktom N-(2-((2R,4R)-4,6-dihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)-2-fenilacetamidom (DHP). Nastali aldehid DHP bio je enzimski oksidiran u N-(2-((2R,4R)-4-hidroksi-6-oksotetrahidro-2H-piran-2-il)ethil)-2-fenilacetamid (HOP). Ispitana je mogućnost regeneracije koenzima NADP+ implementacijom regeneracijskog sustava in situ uvođenjem enzima NADPH-ovisne DH. Kao mogući enzimi ispitani su NOX001, enzim koji kao kosupstrat zahtjeva kisik, i KRED011, enzim koji kao kosupstrat zahtjeva aceton (ACE). S obzirom na to da enzim DERA prihvaća AA ujedno kao donor i akceptor, reakcija dvostruke aldolne samoadicije AA rezultira nastankom konačnog produkta 3,5-dihidroksiheksanala (DHH) preko međuprodukta 3-hidroksibutanala (HB) (slika 3.). Razlog provedbe oksidacije u oba slučaja bio je prevođenje konačnog produkta (aldehidi CDH i DHP) u svoj stabilniji oblik (kiseline CDHA i HOP). U slučaju prve rute, oksidacija CDH-a je također bila nužna iz razloga što karbonilni spojevi (aldehidi i ketoni) kemijski reagiraju s cijanidom (CN-) čime dolazi do cijanohidrinske reakcije. Time bi nastali neželjeni nusprodukti, a reakcija bi rezultirala sa smanjenim prinosom na konačnom produktu (prekursoru bočnog lanca statina). Metodologija Analitičke metode Uzorci uzeti iz reakcijske otopine analizirani su primjenom tekućinske kromatografije na kromatografu Shimadzu HPLC (Kyoto, Japan). Aktivnosti svih enzima utvrđene su primjenom eksperimentalno definiranih spektrofotometrijskih testova na spektrofotometru Shimadzu UV-1601 (Kyoto, Japan). Optimalni pH i temperatura Utjecaj različitih pufera, pH i temperature na aktivnost i stabilnost svih korištenih enzima određeni su provedbom spektrofotometrijskih mjerenja. Pošto enzimi DH kataliziraju reakcije pri jednom pH (čime nastaje glavni produkt oksidacije), a regeneracija koenzima odvija se pri drugom pH, pronađen je kompromisan pH temeljem dostupne literature i prikupljenih eksperimentalnih rezultata. Stabilnost enzima Stabilnost enzima određena je miješanjem enzima s različitim koncentracijama supstrata ili produkta, u optimalnom puferu pri optimalnoj temperaturi. Tijekom definiranog razdoblja uzimani su uzorci i mjerena je aktivnost enzima. Iz dobivenih rezultata procijenjene su konstante deaktivacije enzima u prisutnosti svakog pojedinog ispitanog spoja. Regeneracija koenzima Regeneracija koenzima provođena je ili uvođenjem novog enzima u reakcijski sustav (NADH-ovisna NOX) ili primjenom istoga enzima koji katalizira glavnu reakciju oksidacije (NADPH-ovisna KRED), ovisno o enzimu koji katalizira glavnu reakciju oksidacije, odnosno njegovoj specifičnosti prema vrsti upotrijebljenog kofaktora. Količina regeneriranog koenzima praćena je spektrofotometrijski pri 340 nm, s obzirom na to da koenzim NAD(P)H apsorbira svjetlost pri toj valnoj duljini. Kinetička mjerenja Za svaki pojedini biokatalitički stupanj unutar promatranog sustava provedena su nezavisna mjerenja praćenjem ovisnosti početne reakcijske brzine o koncentracijama pojedinih komponenti reakcijskog sustava, to jest primjenom metode početnih reakcijskih brzina. Dobiveni eksperimentalni podaci korišteni su za procjenu kinetičkih parametara. Mjerenja su provedena ili primjenom spektrofotometrijskoga testa ili praćenjem reakcije u vremenu mjerenjem koncentracije supstrata ili produkta primjenom tekućinske kromatografije. Jednostupanjske reakcije Sve reakcije uključene u sintezu prekursora bočnog lanaca statina provedene su u barem jednom od sljedećih reaktora: šaržnom reaktoru (BR), ponovljivom šaržnom reaktoru (RBR) ili šaržnom reaktoru s dotokom (FBR). Kada se reakcija provodila u RBR-u, dodavana je svježa količina supstrata ili enzima jednaka onoj početnoj u onome trenutku kada je koncentracija ili aktivnost pala na nulu. Kod reakcija koje su provedene u FBR-u, supstrati i/ili enzimi dovođeni su u reaktor pomoću klipnih pumpi (PHD 4400 Syringe Pump Series, Harvard Apparatus, SAD). Višeenzimski sustavi Nakon što su ispitane sve jednostupanjske reakcije uključene u sintezu prekursora, provedene su kaskadne reakcije. Višeenzimski sustavi sastojali su se od kombinacije različitih enzima u svrhu pojednostavljenja procesa sinteze bez pada produktivnosti. Reakcije su provedene ili u jednom reaktoru ili kao slijedne reakcije u odabranom tipu reaktora. Kod reakcija provedenih u jednom reaktoru, na početku eksperimenta dodani su svi supstrati, enzimi i koenzimi, a kod reakcija provođenih kao niz slijednih reakcija, svaki se sintetski korak gledao kao samostalna reakcija, što znači su se samo najnužniji supstrati, enzimi i koenzimi dodali prije sljedećeg sintetskog koraka, ali bez prethodnog pročišćavanja nastalih (među)produkata. Matematičko modeliranje, validacija i simulacije modela Matematički modeli sastoje se od kinetičkih i bilančnih jednadžbi, a razvijeni su na temelju reakcijske sheme, procijenjenih kinetičkih parametara i bilančnih jednadžbi za odabrani tip reaktora te su validirani na nezavisnom skupu eksperimentalnih podataka prikupljenih iz podataka prikupljenih u odgovarajućem tipu reaktora. Razvijeni modeli poslužili su u simulacijama i optimizaciji početnih parametara reakcije u svrhu dobivanja optimalne koncentracije glavnoga produkta i postizanja volumne produktivnosti. Obrada podataka Za procjenu kinetičkih parametara i konstante operacijske stabilnosti enzima korištene su simpleks-metoda i metoda najmannjih kvadrata primjenom računalnog programa Scientist (MicroMath), pri čemu se kao funkcija cilja koristila suma kvadrata odstupanja. Za potrebe simulacije primijenjen je algoritam Episode za rješavanje skupa diferencijalnih jednadžbi. Standardna devijacija i koeficijenti determinacije izračunati su primjenom statističkih funkcija ugrađenih u Scientist. Rezultati, rasprava i zaključci Da bi se utvrdili optimalni pufer i pH za provedbu enzimskih reakcija, ispitan je utjecaj različitih pufera i pH-vrijednosti na aktivnost i stabilnost enzima. Eksperimentalno je utvrđeno kako je optimalni pufer za provedbu reakcije aldolne adicije AA na CAA katalizirane DERATm-om 0.1 M pufer TEA-HCl, pH 7, dok je za istu reakciju kataliziranu DERA024-om najbolji 0.1 M fosfatni pufer, pH 6. Za reakciju oksidacije CDH-a katalizirane enzimom AlDH odabran je 0.1 M fosfatni pufer, pH 8. Za reakciju aldolne adicije AA na OPA katalizirane enzimom DERA062 utvrđeno je kako je optimalni pufer 0.1 M fosfatni pufer, pH 7, dok je za slijednu reakciju kataliziranu KRED354 optimalni isti pufer, ali pH 8. Ispitan je utjecaj temperature na aktivnost i stabilnost enzima DERATm. Rezultati su potvrdili kako aktivnost enzima raste s porastom temperature u skladu s Arrheniusovom jednadžbom. Pomoću prikupljenih eksperimentalnih podataka određeni su parametri jednadžbe. Enzim je pokazao vrlo dobru termostabilnost zadržavši 87 % inicijalne aktivnosti nakon tri dana inkubacije pri temperaturi 20 – 25 °C. Kako bi se uspješno postavili matematički modeli, bilo je potrebno odrediti utjecaj organskih spojeva (supstrata i produkata) na stabilnost enzima te odrediti kinetiku enzima u reakcijama koje kataliziraju. Konstanta deaktivacije enzima u prisustvu organskih spojeva za svaki pojedini enzim procijenjena je pomoću eksperimentalnih podataka vremenskih promjena aktivnosti enzima za svaku pojedinu koncentraciju pojedinačnog aldehida primjenom kinetike drugoga reda. Procijenjene konstante deaktivacije su potom prikazane kao ovisnost konstante deaktivacije o pojedinoj koncentraciji svakog ispitivanog spoja, te opisane polinomom. Rezultati ispitivanja utjecaja organskih spojeva na stabilnost enzima potvrdili su kako je nužno odrediti optimalne početne koncentracije supstrata te izbjeći akumulaciju spojeva koji imaju destabilizirajući učinak na enzime odabirom prikladne konfiguracije reaktora. Primjenom metode početnih brzina određena je kinetika svih enzima u svakoj pojedinoj reakciji unutar postavljenog višeenzimskog sustava. Kinetika svake pojedine enzimski katalizirane reakcije opisana je jednosupstratnom ili dvosupstratnom Michaelis-Menteničinom kinetikom. Ukoliko je bilo eksperimentalno utvrđeno, kinetičke jednadžbe bile su proširene članovima koji su se uključivali inhibicije uzrokovane supstratom i/ili produktom reakcije. Svi parametri Michaelis-Menteničine kinetike bili su procijenjeni primjenom nelinearne regresije programskog paketa Scientist (MicroMath). Uzimajući vrijednosti kinetičkih parametara u obzir, enzimi su se pogodnim katalizatorima istraživanih reakcija, međutim zaključeno je kako je za dvostruku aldolnu adiciju AA na CAA prikladniji enzim DERA024 nego enzim DERATm, a kako je za oksidaciju CDH-a prikladniji enzimski sustav kojeg čine AlDH/NOX009 nego enzim KRED332. U slučaju druge reakcijske rute, vezano uz regeneraciju koenzima NADP+ in situ, oba bi se enzima mogla uspješno koristiti u svrhu njegove regeneracije, pri čemu primjena enzima NOX001 pokazuje određene prednosti nad KRED011. Temeljem prikupljenih podataka ovisnosti stabilnosti enzima o prisustvu organskih spojeva u reakcijskoj otopini i razvijenih kinetičkih modela predloženi su matematički modeli za odgovarajući tip reaktora. Razvijeni matematički modeli validirani su u odgovarajućem reaktoru provedbom jednoenzimskih i višeenzimskih (kaskadnih) reakcija. Služeći se validiranim matematičkim modelima, optimirani su reakcijski uvjeti promatranih enzimski kataliziranih reakcija s ciljem proizvodnje industrijski relevantne količine ključnih molekula. U tu svrhu, kao mjerilo uspješnosti, poslužili su relevantni industrijski zahtjevi za proizvodnju finih kemikalija, poput količine proizvedenog produkta (> 50 g/L), konverzije supstrata (> 95 %, 24 h), iskorištenje biokatalizatora (> 10 gprodukt/genzim) i produktivnost (> 100 g/(L∙dan)). Kaskadne reakcije bile su provedene u odgovarajućem reaktoru na simultani (ako je uključivalo regeneraciju koenzima) i/ili sekvencijalni (ako su produkti prethodne reakcije bili supstrati sljedeće reakcije bez prethodne alternacije reakcijske otopine) način. Na temelju prikupljenih eksperimentalnih podataka, potvrđeno je kako je moguće pojednostaviti promatrane reakcijske sustave provedbom kaskadnih reakcija i time dobiti veće količine željenog produkta. Iako nije bilo moguće simultano provesti kaskadne reakcije koje uključuju enzime DERA i DH, iz razloga što enzimi DH neselektivno oksidiraju aldehide, eksperimentalno je potvrđeno kako je moguće provesti kaskadne reakcije na sekvencijalan način. Tako je provedbom sekvencijalne kaskade, koja uključuje prisustvo DERA024-e i AlDH/NOX009-a, reakcija rezultirala zadovoljavanjem industrijski značajnih procesnih veličina, u usporedbi s kaskadnom reakcijom provedenom u prisustvu DERA024-e i KRED332-a. Spomenute kaskade provedene su u šaržnom reaktoru, pri čemu su aldolne reakcije provedene s dodacima supstrata i enzima a reakcije oksidacije s dodacima enzima u trenutcima kada su se supstrati u potpunosti potrošili, odnosno kada je preostala aktivnost enzima bila ispod 20 %. Iako zbog kemijske reakcije aldehida s cijanidom nije bilo moguće provesti kaskadnu reakciju katalizirane s HHDH001 na simultan način (AlDH, NOX009 i HHDH001 dodani u istom stupnju), reakcija je provedena na sekvencijalni (po završetku reakcije katalizirane enzimskim sustavom AlDH/NOX009 dodana je HHDH001) način. Ta se kaskada sastojala od prvog stupnja (aldolna reakcija: DERA024, ponovljivi šaržni reaktor), drugog stupnja (reakcija oksidacije: AlDH/NOX009, šaržni reaktor s dodatcima enzima) i trećeg stupnja (reakcija katalizirana s HHDH001, u prisustvu KCN-a, šaržni reaktor), a demonstrirala je mogućnost uspješne provedbe kaskadne reakcije, kao i postizanje industrijskih zahtjeva za proizvodnju finih kemikalija. Provedbom kaskadne reakcije na sekvencijalni način, sačinjene od enzima DERA062 u prvom reakcijskom stupnju i KRED354 i NOX001 ili KRED011 u drugom stupnju, pri optimalnim reakcijskim uvjetima, dobiveni rezultati upućuju kako se oba enzima (NOX001 i KRED011) mogu uspješno koristiti u svrhu regeneracije koenzima NADP+. Zbog jednostavnosti i neznatno boljih rezultata, preporučeni regeneracijski sustav je onaj kataliziran enzimom NOX001. Eksperimentalno je utvrđeno da dolazi do raspada produkta oksidacije HOP-a, čime je dokazano kako nastala kiselina HOP nije stabilniji oblik aldehida DHP-a proizvedenog aldolnom adicijom. Time je dokazano kako oksidaciju trebalo provoditi simultano u prisustvu, na primjer, lipaze kako bi se zaobišao gubitak na produktu HOP, odnosno gubitak HOP-a kao supstrata sljedećeg, trećeg stupnja promatrane kaskade. Ekperimenti provedeni na temelju validiranih matematičkih modela rezultirali su s industrijski značajnim vrijednostima. Ti modeli predstavljaju dragocjenu osnovu za buduću primjenu promatranih kaskadnih sustava u svrhu proizvodnje prekursora bočnog lanca statina.