Search

Stanični prionski protein PrPC otkriven je u istraživanjima o uzroku prionopatija, koje karakterizira agregacija specifičnih proteina i posljedična neurodegeneracija. PrPC posjeduje dva mjesta za glikozilaciju i većina prionskog proteina izoliranog iz tkiva je diglikozilirana. Glikozilacija PrPC promovira transport PrPC do plazmatske membrane. S izuzetkom manje zastupljenih transmembranskih i cijepanih oblika, PrPC provodi veliku većinu životnog vijeka vezan za membranu putem GPI-sidra. Najveću količinu proteina PrPC nalazimo u imunosno privilegiranim mjestima, poput mozga, oka i placente te u imunosnom sustavu. Kako bi izbjegli nadzor imunosnog sustava domaćina, herpesvirusi su razvili raznolike mehanizme koji im omogućuju jedinstvenu sposobnost cjeloživotnog preživljavanja u inficiranim domaćinima u obliku latentne infekcije sa sposobnošću reaktivacije kad je imunosni sustav oslabljen. Dio mehanizama se temelji na sintezi proizvoda virusnih gena koji specifično zaustavljaju sintezu ili unutarstanični transport različitih efektorskih molekula imunosnog odgovora. Mišji citomegalovirus (MCMV), član obitelji obitelji herpesvirusa, dokazano mijenja reciklirajuće unutarstanične transportne puteve da bi smanjio ispoljavanje molekula bitnih za imunosnu reakciju na površini stanica. Svrha ovog rada bila je uspostaviti metodu za vizualizaciju i praćenje proteina PrPC ispoljenog na plazmatskoj membrani neuralnih stanica te uspostaviti metodu istovremenog praćenja četiri parametra u stanici putem konfokalne imunofluorescentne analize. Stanice neuroblastoma, N2A, bile su uzgojene, potom inficirane s virusom MCMV i zatim analizirane istovremeno na četiri parametara, putem četiri fluorofore, koje su bile marker za PrPC, jezgru, MCMV infekciju te stanični odjeljak, pri čemu je odabran AP1 pozitivan odjeljak. PrPC nije kolokalizirao s AP1 pozitvnim odjeljkom te vjerojatno MCMV ne utječe na njegov unutarstanični prijenos putem AP1 pozitivnog odjeljka., Cellular prion protein (PrPC) was discovered during research into the causes of prionopathis characterized by aggregation of specific proteins and subsequent neurodegeneration. PrPC possesses two glycosylation sites, and most tissue-isolated prion proteins are diglycosylated. PrPC glycosylation stimulates the transport of PrPC to the plasma membrane. With the exception of the less common transmembrane and split forms, PrPC spends most of its lifetime bound to a membrane with a GPI anchor. PrPC is most expressed in immunoprivileged sites, such as the brain, eye, and placenta, and in the immune system. To avoid controlling the host’s immune system, herpesviruses have developed various mechanisms that allow them to survive in infected hosts in the form of a latent infection with the ability to reactivate when the immune system is weakened. Several mechanisms are based on the synthesis of products of viral genes that specifically stop the synthesis or intracellular transport of various effector molecules of nonspecific and specific immune response. MCMV has been shown to alter the recycling of intracellular transport pathways to reduce the expression of molecules important for the immune response at the cell surface. The purpose of this study was to establish a method for visualization and monitoring of PrPC protein expressed on the plasma membrane of neural cells and to establish a method for simultaneous monitoring of four parameters in the cell by confocal immunofluorescence analysis. Neuroblastoma cells N2A were cultured, then infected with MCMV virus, and then analyzed simultaneously for four parameters, using 4 fluorophores, which were a marker for PrPC, nucleus, MCMV infection, and AP1. PrPC did not colocalize with the AP1 positive compartment and probably MCMV does not affect its intracellular sorting via the AP1 positive compartment.

Stanični prionski protein (engl. Prion Protein Cellular, PrPC) je sastavni dio različitih tkiva pri čemu je njegova fiziološka uloga i dalje predmet debate. Unutar stanice se može pronaći u više formi - citoplazmatskoj, transmembranskoj te formi koja je putem glikozilfosfatidilinozitolnog sidra pričvršćena na membranu, pri čemu je posljednja forma najraširenija. Pojedine forme proteina utvrđene su u gotovo svim odjeljcima stanice, što uključuje plazmatsku membranu, endoplazmatski retikulum, Golgijev aparat, endosome, pojedine vezikule te citoplazmu. Dodatnu kompleksnost u izučavanju biologije ovog proteina unose glikoforme, odnosno različite šećerne modifikacije, kojih ima nekoliko. Monoklonska protutijela, koja uspješno detektiraju različite molekule PrPC unutar stanice te omogućavaju praćenje pojedinih specifičnih (gliko)formi i određivanje njihova interaktoma, nezamjenjiv su alat u istraživanju biološke uloge PrPC. Ovim radom se utvrđivala djelotvornost novo-proizvedenih monoklonskih protutijela, u formi supernatanta, na sposobnost prepoznavanja mišjeg i humanog PrPC u metodama Western blot/imunoblot, imunofluorescentnoj mikroskopiji te protočnoj citometriji. Svi pokusi su rađeni na staničnim linijama mišjeg glioma GL261, mišjih embrionalnih fibroblasta MEF, mišjeg limfoma BW i transfektanti BW-PrP te na humanoj staničnoj liniji adenokarcinoma alveolarnih bazalnih epitelnih stanica A549, kao prikladnim staničnim modelima za ispitivanje PrPC i validacije monoklonskih protutijela na sposobnost prepoznavanja PrPC unutar stanice. Protutijela HuPrP.01, HuPrP.02 te HuPrP.04 su pokazala najveći potencijal u prepoznavanju humanog PrPC dok se u prepoznavanju mišjeg PrPC najboljim kandidatom pokazalo protutijelo MoPrP.03. Ova protutijela imaju potencijal za daljnji razvoj, koji će započeti proizvodnjom koncentriranih pripravaka poznate koncentracije protutijela putem pročišćavanja ispitanih supernatanata. Zanimljivo je kako je jedno od protutijela na humani PrPC, protutijelo 1G8, detektiralo PrPC putem imunofluorescentne mikroskopije u području membrane jezgre, gdje isti protein još do sada nije opisan. Zaključno, na temelju ukupnih rezultata prikupljenih različitim metodama, utvrdili smo koja novo-proizvedena protutijela vrijedi dalje razvijati, pročišćavati i validirati te koristiti u budućim istraživanjima bioloških uloga PrPC., PrPC is an integral part of different tissues, and its physiological role remains the subject of debate. Within the cell, this protein can be found in several forms, including a cytoplasmic form and a transmembrane form. However, the most widespread form is one that is attached to the membrane through a glycosylphosphatidylinositol anchor. Certain protein forms have been found in almost all cell compartments including the plasma membrane, endoplasmic reticulum, Golgi apparatus, endosomes and other vesicles, as well as the cytoplasm. An additional level of complexity in the study of the biology of this protein is its glycoprofile, or different sugar modifications, of which there are several. Monoclonal antibodies that successfully detect different PrPC molecules within cells also enable the monitoring of specific forms of PrPC (glyco)forms and determination of the PrPC interactome. The present study determined the efficacy of newly-produced monoclonal antibodies to recognize mouse and human PrPC in Western blotting/immunoblotting, immunofluorescence microscopy, and flow cytometry. Antibodies HuPrP.01, HuPrP.02 and HuPrP.04 showed the greatest potential for recognition of human PrPC, while the antibody MoPrP.03 showed best capability in recognition of mouse PrPC. These antibodies have the potential for further development, which will start by the production of concentrated preparations of known antibody concentrations by purifying the supernatants that were tested. Interestingly, one of the anti-HuPrP antibodies, 1G8, detected immunofluorescence signal around the nucleus membrane, where the PrPC localization has not been previously described. Based on the obtained results, we have determined which newly-produced antibodies are candidates for further development, purification and validation, and can be used in future research of the biological role of PrPC.