Search

Ubrzani razvoj analitičkih tehnika u posljednjih nekoliko desetljeća omogućio je temeljito istraživanje procesa N-glikozilacije u brojnim patofioziološkim stanjima, a uočene promjene u mnogima od njih dovele su do strelovitog rasta interesa za glikobiologiju. Promjene u N-glikozilaciji danas se smatraju vrijednim biljezima raznih bolesti, te se njihova specifičnost pokušava iskoristiti u diferencijalne, dijagnostičke i prognostičke svrhe. Prethodne studije pokazale su da je N-glikanski profil plazmatskih proteina promijenjen u šećernoj bolesti tipa 1 (ŠBT1). Jedna od izraženije uočenih promjena bila je ona u zastupljenosti visoko-manoznih glikanskih struktura u plazmatskom N-glikomu. Ove strukture dominantno bi mogle potjecati s komponente komplementa C3, budući da je to glikoprotein s isključivo visoko-manoznim glikanima vezanima na proteinsku okosnicu za kojeg je poznato da doprinosi razvoju ŠBT1 pojačavanjem autoimunih upalnih procesa. Iz tog je razloga u ovom radu razvijena visokoprotočna metoda za analizu N-glikozilacije pojedinih glikozilacijskih mjesta ljudskog C3 proteina upotrebom tekućinske kromatografije spregnute sa spektrometrom masa (LC-MS) temeljena na njegovu obogaćivanju iz plazme pomoću lektinskog afinitetnog medija visokog afiniteta za manozu. Novorazvijenom metodom zatim je analizirana krvna plazma ispitanika novodijagnosticiranih šećernom bolesti tipa 1 i njihove zdrave braće i sestara te su uočene značajne promjene C3 N-glikoma. ŠBT1 povezana je s porastom manje procesuiranih struktura s više manoznih podjedinica na oba N-glikozilacijska mjesta. Nadalje, C3 N-glikozilacija je analizirana u odrasloj populaciji ispitanika s različitim stupnjem najčešćih komplikacija ŠBT1 – retinopatije i albuminurije. Pokazano je da se C3 N-glikom značajno mijenja u teškoj albuminuriji u ŠBT1, no da je neovisan o trajanju bolesti. Retinopatija je pak dovela do promjene samo jedne glikoforme, dok su svi osim jednog C3 glikopeptida značajno povezani s razinama hemoglobina A1c (HbA1c). Predstavljene spoznaje ukazuju na uključenost N-glikozilacije i C3 komponente komplementa u patofiziologiju šećerne bolesti tipa 1 te upućuju na značaj C3 N-glikoma kao potencijalnog dijagnostičkog i prognostičkog biljega ove bolesti i njoj pridruženih komplikacija. Rapid development of analytical techniques in the last few decades has enabled a thorough investigation of the N-glycosylation process in numerous pathophysiological conditions, and the observed changes in many of them have led to a rapid growth of interest in the field of glycobiology. Changes in N-glycosylation are now considered valuable biomarkers of various diseases, and their specificity is being exploited for differential, diagnostic and prognostic purposes. Previous studies have shown that the N-glycan profile of plasma proteins is altered in type 1 diabetes (T1D). One of the more pronounced changes observed was in he abundance of high-mannose glycans in the plasma N-glycome. These structures could predominantly originate from the complement component C3, a glycoprotein with exclusively high-mannose glycans attached to its protein backbone, which is known to contribute to the development of T1D by enhancing autoimmune inflammatory processes. For this reason, a high-throughput method for the site-specific N-glycosylation analysis of human C3 protein was developed in this study using liquid chromatography coupled to a mass spectrometer (LC-MS), based on its enrichment from plasma using lectin affinity matrix. The newly developed method was then used to analyze blood plasma of subjects newly diagnosed with type 1 diabetes and their healthy siblings, and significant changes in C3 N-glycome were observed. T1D was associated with an increase in less processed structures with more mannose subunits at both C3 N-glycosylation sites. Furthermore, C3 N-glycosylation was analyzed in the adult population of T1D subjects with different degrees of the most common complications of T1D – retinopathy and albuminuria. It was shown that C3 N-glycome significantly changes in severe albuminuria in T1D, but is independent of disease duration. Retinopathy led to a change in only one glycoform, while all but one C3 glycopeptide was significantly associated with levels of hemoglobin A1c (HbA1c). The findings presented indicate the involvement of N-glycosylation and the C3 complement component in the pathophysiology of type 1 diabetes and indicate the importance of C3 N-glycome as a potential diagnostic and prognostic biomarker of this disease and its associated complications.

N-glikozilacija, proces enzimski posredovanog vezanja šećernih struktura na asparaginske ostatke proteina, istraživana je u brojnim bolestima, u mnogima od kojih su promjene i potvrđene. Pronalazak specifičnih promjena N-glikozilacije nudi mogućnost razvoja predikcijskih, dijagnostičkih i prognostičkih alata potrebnih u sprječavanju i liječenju različitih bolesti. Studije ukupne N-glikozilacije proteina plazme provedene u istraživanju predispozicije za šećernu bolest tipa 2, kao i istraživanju šećerne bolesti zrele dobi kod mladih osoba (MODY), identificirale su promjene u glikozilaciji za koje se vjeruje da potječu s alfa-1-kiseloga glikoproteina (AGP). S ciljem detaljnijeg istraživanja ovih promjena, razvijena je metoda za visokoprotočnu analizu N-glikozilacije AGP-a koja uključuje obogaćenje ovog proteina te analizu njegovih glikopeptida metodom tekućinske kromatografije spregnute sa spektometrijom masa (LC-MS). Inicijalnom analizom 14 zdravih ispitanika utvrđena je temporalna stabilnost Nglikoma AGP-a, kao općeniti preduvjet za dijagnostičku upotrebu. Novorazvijenom metodom zatim je analizirana glikozilacija AGP-a 108 ispitanika koji se razlikuju po svojoj predispoziciji za razvoj šećerne bolesti tipa 2 te je utvrđena povezanost porasta grananja i smanjenja sijalinizacije glikana AGP-a s povećanim rizikom od razvoja šećerne bolesti tipa 2. Nadalje, kod 466 pacijenata oboljelih od različitih tipova šećerne bolesti (HNF1A-, HNF4AMODY, šećerna bolesti tipa 1 i tipa 2) analizom fukozilacije AGP-a ustanovljeno je njezino smanjenje koje je pokazano specifično za HNF1A-MODY. Nadalje, analizom uzoraka 98 pacijenata oboljelih od šećerne bolesti ranog nastupa bez autoimunosne podloge, pokazano je da je smanjena fukozilacija prisutna samo kod pacijenata s oštećujućim HNF1A mutacijama – sržnim uzrokom bolesti. Također, pokazana je visoka uspješnost identifikacije HNF1A-MODY pacijenata na temelju individualnih glikopeptida AGP-a. Prikupljene spoznaje upućuju na mogućnost upotrebe glikozilacije AGP-a kao predikcijskog biljega za šećernu bolest tipa 2, kao i biljega identifikacije pacijenata oboljelih od HNF1A-MODY-a što bi dalo velik doprinos pravovremenom prepoznavanju rizika kao i diferencijalnoj dijagnostici šećerne bolesti. N-glycosylation, the process of enzymatically mediated binding of sugar structures to proteins' asparagine residues, has been investigated in a number of diseases, in many of which the changes have been confirmed. The discovery of specific N-glycosylation changes offers a possibility for development of prediction, diagnostic and prognostic tools needed in the prevention and treatment of various diseases. Studies of total plasma protein N-glycosylation performed in type 2 diabetes predisposition research, as well as in the research of maturity-onset diabetes of the young (MODY), identified changes in glycosylation believed to originate from alpha-1-acid glycoprotein (AGP). In order to investigate these changes in more detail, a method for high-throughput AGP N-glycosylation analysis was developed. The method is based on enrichment of AGP and analysis of its glycopeptides by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS). Initial analysis performed on 14 healthy subjects confirmed the temporal stability of AGP N-glycome, as a general prerequisite for diagnostic use. The newly developed method was then used to analyze AGP glycosylation in 108 subjects differing in their predisposition for type 2 diabetes development. The results confirmed an association of increased branching and decreased sialylation of AGP glycans with an increased risk of type 2 diabetes development. Analysis of samples from 466 patients diagnosed with different types of diabetes (HNF1A-, HNF4A-MODY, type 1 and type 2 diabetes) revealed a reduction in AGP fucosylation, which was shown to be specific for HNF1A-MODY. Furthermore, analysis of samples from 98 patients with early-onset non-autoimmune diabetes showed that decreased fucosylation was present only in patients carrying damaging HNF1A mutations - the core cause of the disease. Also, high success rate of identification of HNF1A-MODY patients based on individual AGP glycopeptides was demonstrated. The findings suggest the possibility of utilizing AGP glycosylation as a predictor of type 2 diabetes, as well as a marker for identification of HNF1A-MODY patients. This would present a valuable contribution to timely risk identification and differential diagnosis of diabetes.

Šećerna bolest tipa 1 (T1DM) multifaktorska je, kronična i autoimuna bolest koja nastaje kao posljedica nedostatka endogenog lučenja inzulina iz β-stanica gušterače. Trenutno su dostupna dva biomarkera koji ukazuju na dugoročnu kontrolu dijabetesa – HbA1c i fruktozamin, ali oba imaju svoja ograničenja. Stoga, postoji velika potreba za markerom koji bi na precizniji način omogućio longitudinalno praćenje T1DM. Promjene u profilu N-glikozilacije ukupnih proteina plazme i imunoglobulina G u mnogim su se studijama pokazale kao potencijalni prognostički, dijagnostički i terapijski markeri raznih bolesti, posebice onih upalne prirode kao što je T1DM. Glikozilacija imunoglobulina A u različitim bolestima općenito je manje proučavana, a tek prije nekoliko godina započela su intenzivna istraživanja uloge njegove glikozilacije u T1DM. Cilj ovog istraživanja je identificirati promjene u IgA N-glikozilaciji u populaciji odraslih bolesnika s T1DM te ih usporediti sa zdravim osobama. Analiza glikana učinjena je HILIC-UPLC metodom. U ovom diplomskom radu je otkriveno da kod odraslih ispitanika s dijagnosticiranim T1DM postoji statistički značajna promjena udjela glikanskih struktura GP2, GP4, GP5, GP7, GP13, GP14, GP17, GP19, GP21, GP24, GP25, GP27 i GP29. Detaljnije proučavanje deriviranih svojstava pokazalo je smanjenje udjela nisko razgranatih glikana, a povećanje visoko razgranatih glikana. Nadalje, smanjenje udjela digalaktoziliranih glikana i povećanje udjela trigalaktoziliranih i trisijaliniziranih glikana pronađeno je u bolesnika s T1DM. Udio glikana sa sržnom fukozom značajno je smanjen u bolesnika s T1DM, dok je udio oligomanoznih glikana značajno povećan. Ove promjene u glikozilaciji IgA upućuju na njegovu moguću ulogu u progresiji bolesti te na potrebu daljnjeg ispitivanja njegove prognostičke vrijednosti. Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a multifactorial, chronic, and autoimmune disease that results from a lack of endogenous insulin secretion from pancreatic β-cells. There are two markers currently available that indicate long-term diabetes control – HbA1c and fructosamine, but both have their limitations. Therefore, there is a great need for a marker that would show the longitudinal progression of T1DM in a more precise way. Changes in the N-glycosylation profile of total plasma proteins and immunoglobulin G in many studies have proven to be a potential prognostic, diagnostic and therapeutic marker of various diseases, especially those of an inflammatory nature, such as T1DM. Glycosylation of immunoglobulin A in various diseases has generally been less studied, and only a few years ago, intensive research into the role of its glycosylation in T1DM began. The aim of this study is to identify changes in IgA N-glycosylation in the population of adult patients with T1DM and compare them with healthy individuals. Glycan analysis was done by ultra performance liquid chromatography based on hydrophilic interactions. In this thesis, it was discovered that in adult subjects diagnosed with T1DM there is a statistically significant change in the proportion of glycan structures GP2, GP4, GP5, GP7, GP13, GP14, GP17, GP19, GP21, GP24, GP25, GP27 and GP29. A more detailed study of the derived traits showed a decrease in the proportion of low-branched glycans, and an increase in highly branched glycans. Furthermore, a reduction in the proportion of digalactosylated glycans and an increase in the proportion of trigalactosylated and trisialinised glycans is found in T1DM patients. The proportion of glycans with core fucose was significantly reduced in T1DM patients, while the proportion of high mannose glycans was significantly increased. These changes in IgA glycosylation indicate that it has a possible role in the disease progression and the need for further examination of its prognostic value.

Metabolički sindrom obuhvaća poremećaje poput visceralne pretilosti te inzulinske rezistencije koja često prethodi šećernoj bolesti tipa 2. Istraživanja su spomenute poremećaje povezala s promjenama N-glikozilacije proteina plazme, jedne od najčešćih i najkompleksnijih post-translacijskih modifikacija. Glavni ciljevi ovog doktorskog rada jesu identificirati N-glikanske strukture prisutne na proteinima plazme koje: a) omogućavaju predikciju i rano prepoznavanje pojedinaca s povećanim rizikom razvoja inzulinske rezistencije i šećerne bolesti tipa 2 i b) su povezane s indeksom tjelesne mase te pretilošću i promjenama indeksa tjelesne mase kod pojedinaca podvrgnutih operaciji želuca. Analizirani su uzorci krvne plazme oko 2 000 ispitanika iz TwinsUK registra sakupljani u više vremenskih točaka tijekom 20 godina pri čemu su bilježeni detaljni podaci o zdravstvenom statusu ispitanika poput dijagnoze inzulinske rezistencije i šećerne bolesti tipa 2, te uzorci krvne plazme 37 pretilih ispitanika okupljenih u Sveučilišnoj bolnici Oxford gdje su bili podvrgnuti restriktivnoj dijeti i operaciji želuca, a krv im je uzrokovana kontinuirano tijekom studije. Izolirani, pročišćeni te fluorescentno obilježeni N-glikani proteina plazme i imunoglobulina G analizirani su HILIC-UPLC metodom. Statistička obrada dobivenih rezultata pokazala je da se N-glikani proteina plazme u pojedinaca koji će razviti šećernu bolest tipa 2 i inzulinsku rezistenciju značajno razlikuju od ispitanika koji će ostati zdravi te se primijećene promjene počinju pojavljivati godinama prije službene dijagnoze što omogućuje uspješno pravovremeno identificiranje pojedinaca visokorizičnih za poremećaj u metabolizmu glukoze. Nadalje, opažene promjene N-glikana proteina plazme i imunoglobulina G u pretilih pojedinaca uslijed mršavljenja rezultat su podvrgavanja restriktivnoj dijeti i operaciji želuca. Iste promjene su primijećene i uslijed longitudinalnog praćenja pojedinaca kojima se mijenjao indeks tjelesne mase. Zaključno, primjenom N-glikana kao biljega ranog izdvajanja visokorizičnih pojedinaca te kao biljega praćenja metaboličkoga i upalnog statusa organizma, može se na vrijeme prevenirati i odgoditi razvoj ozbiljnih komorbiditeta koji se povezuju s metaboličkim sindromom, te čak i spriječiti pojavu samog sindroma, ali i pratiti učinkovitost terapijskog pristupa. Metabolic syndrome includes disorders such as visceral obesity and insulin resistance, which often precedes type 2 diabetes. Studies have linked these disorders to changes in plasma N-glycosylation, one of the most common and complex post-translational modifications. The main objectives of this study are to identify N-glycan structures present on plasma proteins that: a) allow prediction and early identification of individuals at increased risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes and b) are associated with body mass index and obesity and body mass index changes in individuals undergoing bariatric surgery (restrictive gastric surgery). Blood plasma samples of about 2000 subjects from the TwinsUK registry collected at multiple time points over 20 years were analysed, recording detailed data on the health status of subjects, as well as blood plasma samples of 37 obese subjects gathered at the Oxford University Hospital where they were subjected to a restrictive diet and bariatric surgery, and their blood was sampled continuously throughout the study. Isolated, purified and fluorescently labelled plasma protein and immunoglobulin G N-glycans were analysed by HILIC-UPLC method. Statistical processing of the obtained results showed that plasma protein N-glycans in individuals to be diagnosed with type 2 diabetes and insulin resistance differ significantly from healthy controls, and that the observed changes begin to appear years before official diagnosis, which allows successful timely identification of individuals at high risk of impaired glucose metabolism. Furthermore, observed significant changes in plasma and immunoglobulin G N-glycans in obese individuals due to weight loss are the result of being subjected to a low-calorie, restrictive diet and bariatric surgery. The same changes were observed due to longitudinal follow-up of individuals with changes in their body mass index. In conclusion, the use of N-glycans as markers of timely identification of high-risk individuals and as monitoring markers of metabolic and inflammatory status of the organism, can prevent and delay the development of serious comorbidities associated with metabolic syndrome, and even prevent the occurrence of the syndrome itself, but also can monitor the efficacy of used therapeutic approach.

Glikozilacija je važna posttranslacijska modifikacija proteina koja ih oplemenjuje novim svojstvima te utječe na njihovu stabilnost i funkciju. Promjene u glikozilaciji proteina krvne plazme odnosno seruma primjećene su kod mnogih autoimunih bolesti i karcinoma. Jedan od takvih proteina je i imunoglobulin G (IgG), ključna molekula u obrani našeg organizma, a čiji su pripadajući N-glikani dosad pokazali snažan potencijal kod uporabe u dijagnostičke i prognostičke svrhe. Kako bi se ispitala N-glikozilacija IgG-a, ključan korak je njegovo pročišćavanje odnosno izolacija iz kompleksne smjese proteina krvne plazme i drugih sastojaka. Danas se u tu svrhu najčešće koristi afinitetno pročišćavanje uz pomoć proteina G u različitim formatima, no dostupne su i druge metode. Usporedbom tri metode izolacije IgG-a (protein G vezan za monolit, protein G vezan za agarozna zrnca, Melon Gel), Melon Gel se pokazao kao najbolja alternativa izolaciji IgG-a proteinom G vezanim za monolit pločice, metodi danas široko rasprostranjenoj u visoko-protočnoj N-glikanskoj analizi IgG-a. Glycosylation is an important posttranslational modification of proteins that enriches them with new properties and affects their stability and function. Changes in glycosylation of blood plasma or serum proteins have been observed in many autoimmune diseases and cancers. One of such proteins is immunoglobulin G (IgG), a key molecule in the defense of our body, whose associated N-glycans have shown strong potential for use in diagnostic and prognostic purposes. In order to examine the Nglycosylation of IgG, a key step is its purification or isolation from a complex mixture of blood plasma proteins and other ingredients. Today, affinity purification using protein G in various formats is most commonly used for this purpose, but other methods are also available. By comparing three methods of isolating IgG (protein G bound to a monolith, protein G agarose beads, Melon Gel), Melon Gel proved to be the best alternative to isolating IgG with protein G monolithic plate, a method widely used today in high-flow N-glycan analysis of IgG.

Alternativna glikozilacija fragmenta Fc imunoglobulina G (IgG) znatno mijenja ulogu ovog antitijela u imunom sustavu. Starenjem dolazi do promjena u glikozilaciji, prije svega galaktozilaciji, što dovodi do povećanja udjela IgG s proupalnom ulogom. Stanična linija FreeStyle™ 293-F koristi se za proučavanje regulacije glikozilacije IgG-a te za sintezu rekombinantnih imunoglobulina. Cilj ovog istraživanja bio je utvrditi utječe li starost stanične linije FreeStyle™ 293-F na glikom IgG-a te ukoliko utječe jesu li promjene uzrokovane starenjem nalik onima koje se dešavaju s glikomom IgG-a u serumu prilikom starenja u ljudi. Drugi dio istraživanja imao je za cilj utvrditi jesu li promjene glikoma izravna posljedica promjene ekspresije glikoziltransferaza koje sudjeluju u procesu glikozilacije IgG-a. Analizom glikana metodom tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti utvrđeno je da starenjem stanica modelne linije dolazi do promjena IgG glikoma. Najznačajnije promjene odnose se na porast udjela agalaktoziliranih glikana i smanjenje udjela fukoziliranih glikana. Promjene fukozilacije mogu se barem dijelom objasniti uočenim promjenama ekspresije fukoziltransferaze FUT8, dok promjene galaktozilacije nisu izravna posljedica promjene ekspresije galaktoziltransferaze B4GALT1. Promjene glikoma IgG-a zabilježene tijekom starenja modelne stanične linije uspoređene su s već poznatim promjenama koje nastaju u IgG glikomu u krvi čovjeka tijekom starenja. Glycosylation of the Fc fragment of immunoglobulin G (IgG) affects the role of this antibody in the immune system. Aging is associated with changes in glycosylation, primarily galactosylation, which lead to an increase in proportion of proinflammatory IgG antibodies. The FreeStyle ™ 293-F is the preferred model cell line used for production of recombinant immunoglobulins, but also for studies of IgG glycosylation. The aim of this study was to determine whether the aging of the FreeStyle ™ 293-F cells affects IgG glycome and, if so, whether the changes caused by cell aging are similar to changes of IgG glycome found during aging of a human organism. The aim of the second part of this study was to determine whether changes in IgG glycome result directly from changes in the expression of glycosyltransferases involved in the process of IgG glycosylation. Analysis of glycans by ultra-high performance liquid chromatography revealed that cell aging leads to changes in IgG glycome. The most significant changes are an increase in the proportion of agalactosylated glycans and a decrease in the proportion of fucosylated glycans. Changes in fucosylation can be at least partially explained by the changes in FUT8 expression, while changes in galactosylation are not a direct consequence of changes in B4GALT1 expression. Changes of IgG glycome found during aging of model cells were compared to changes of IgG glycome which are known to occur during human ageing.

Izlaganje proteina na staničnoj površini (˝surface display˝) predstavlja poboljšanu tehniku imobilizacije proteina te omogućuje kontinuiranu sintezu rekombinantnih proteina zahvaljujući fuziji gena koji kodira za ispitivani enzim i gena koji kodiraju za nativne proteine stanične stijenke. U ovom radu rekombinantni protein β-laktamaza (gen bla) fuzioniran je sa proteinom Pir2, odnosno sa dijelom proteina Ccw12. Pir2 veže se za stijenku svojim Nterminalnim dijelom. Dio gena CCW12, korišten u ovom radu, kodira za C-terminalnu signalnu sekvencu na koju se veže GPI-sidro, preko kojeg se protein veže u stijenku. Najveći je nedostatak ovakvog pristupa mali prinos imobiliziranih proteina u stijenku. S pretpostavkom da mutacije u N-glikozilaciji i endocitozi povećavaju učinkovitost imobilizacije ispitivan je utjecaj mutacija u N-glikozilaciji (och1 mutant i mnn mutanti) te mutacija u endocitozi (vam4 mutant i end mutanti) na efikasnost ugradnje rekombinantnog proteina u stijenku mjerenjem aktivnost β-laktamaze, što omogućuje procjenu količine imobiliziranog rekombinantnog proteina u staničnoj stijenci. „Surface display“ system provides enhanced immobilization technique that enables countinuous synthesis of recombinant protein. This is possible because of the genetic fusion between genes encoding for native cell wall proteins and enzyme that is reasearched. In this study the enzyme β-lactamase (gene bla) and Pir2 or a fragment of Ccw12 are fuzed. Pir2 is linked to the cell wall on its N-terminal end, while Ccw12 is linked to the cell wall by GPI anchor on C- terminal region. One of the major disadvantages of this approach is low yield in protein immobilization. With the assumption that mutation in N-glycosylation and endocytosis enhances surface display system efficiency, this system was examined in mutants in Nglycosylation (och1 mutant and mnn mutants) and in mutants in endocytosis (vam4 mutant and end mutants). By measuring β-lactamase activity, it is possible to estimate the amount of recombinant protein immobilized in cell wall.

N-glikozilacija je posttranslacijska modifikacija imunoglobulina G (IgG) koja se mijenja u bolestima, sa starenjam i pod utjecajem spolnih hormona. U ovom doktorskom radu tekućinskom kromatografijom ultravisoke učinkovitosti analizirani su glikanski profili protutijela IgG iz krvne plazme zdravih žena tijekom menstruacijskih ciklusa (MC) iz ukupno 12 vremenskih točaka – svakih 7 dana tijekom 3 mjeseca. Primijećene su periodične cikličke promjene N-glikozilacije povezane s fazama ciklusa i koncentracijom spolnih hormona. Estrogen i progesteron su povezani s povećanom razinom digalaktoziliranih i sijaliniziranih N-glikana u luteinskoj fazi, a testosteron je povezan s povećanom razinom agalaktoziliranih i monogalaktoziliranih N-glikana u folikularnoj fazi ciklusa. Najveću varijabilnost unutar osobe imali su sijalinizirani i agalaktozilirani N-glikani, dok se fukozilacija nije mijenjala tijekom MC. Prosječna varijabilnost N-glikozilacije u ciklusima svih ispitanica su vrlo male, do 0.8%, što omogućuje da se prikupljanje i analiza N-glikana protutijela IgG iz uzoraka krvi žena u studijama s velikim brojem ispitanika odvija neovisno o fazi MC. N-glycosylation is a post-translational modification of immunoglobulin G (IgG) that changes in diseases, with ageing and under the influence of sex hormones. In this doctoral dissertation, plasma-derived IgG from 12 time points – every 7 days during 3 months in the menstrual cycles (MC) of 70 healthy women was glycoprofiled by ultra-performance liquid chromatography. Periodic cyclic N-glycosylation changes which associated with MC phases and plasma sex hormone concentrations were observed. Estrogen and progesterone associated with increased digalactosylated and sialylated N-glycans in the luteal phase, while testosterone associated with increased agalactosylated and monogalactosylated N-glycans in the follicular phase of the MC. The highest intra-individual variation was observed for sialylated and agalactosylated N-glycans, whereas fucosylation did not change during the MC. The average N-glycosylation variability in the MC is very small on the cohort level, up to 0.8%, meaning that sample collection and IgG N-glycoprofiling of women in large cohort studies can take place independently of the MC phase.

U ovom su radu uspoređivani utjecaji solnog i osmotskog stresa na proteine izolirane iz kalusnog i tumorskog tkiva kaktusa vrste Mamillaria gracilis Pfeiff. uzgajanih u uvjetima in vitro. Budući da se radi o biljci sa CAM metabolizmom, koja je prilagođena na sušne uvjete staništa i osjetljiva na promjene u okolišnim čimbenicima, ona je prikladan modelni organizam za proučavanje mehanizama u biljnim stanicama koji se aktiviraju tijekom izlaganja biljaka solnom i osmotskom stresu. U ovom je istraživanju pokazano kako izlaganje tkiva vrste M. gracilis soli i manitolu mijenja ekspresiju ukupnih topivih staničnih proteina i izaziva promjene u njihovoj N-glikozilaciji, važnoj posttranslacijskoj modifikaciji proteina. Osmotski stres izazvan manitolom imao je jači utjecaj na N-glikozilaciju proteina kalusa, dok je na tumorsko tkivo veći utjecaj imao solni stres (NaCl). S obzirom da je uočena razlika u ekspresiji između glikoproteina kalusnog i tumorskog tkiva nakon izloženosti istom tipu abiotičkog stresa, može se zaključiti da je N-glikozilacija proteina specifična za određeni tip tkiva. S druge strane, razlika u ekspresiji glikoproteina unutar istog tipa tkiva, nakon izloženosti različitim vrstama stresora u podlozi (NaCl ili manitol), navodi na zaključak da stupanj glikozilacije ovisi o vrsti stresa kojoj je tkivo izloženo. In this paper, the effects of salt and osmotic stress on proteins isolated from callus and tumour tissue lines of Mamillaria gracilis Pfeiff. cacti, grown in vitro, were compared. Because it is a plant with CAM metabolism adapted to arid habitats and sensitive to changes in environmental factors, it is a suitable model organism to study the mechanisms in plant cells that are activated during plant exposure to salt and osmotic stress. In this study, it was shown that the exposure of M. gracilis tissues to salt and mannitol alters the expression of total soluble cellular proteins and induces changes in protein N-glycosylation, a very important posttranslational modification. Osmotic stress induced by mannitol had stronger impact on callus protein N-glycosylation, while tumour tissue was found to be more sensitive to salt stress (NaCl). Difference in glycoprotein expression, which was found between callus and tumour tissue after their exposure to the same type of abiotic stress, brings to conclusion that N-glycosylation is specific to certain tissues type. On the other hand, difference in glycoprotein expression, detected within the same tissue type after exposure to different stressors (NaCl or mannitol), implies that level of protein N-glycosylation is dependent on the type of the stressor.

Varfarin je najstariji i najpropisivaniji oralni antikoagulans. Zbog svoje uske terapijske širine i velikih interindividualnih varijabilnosti zahtijeva praćenje INR-a. Uspostavljanjem adekvatne inicijalne doze varfarina smanjuje se rizik od nuspojava lijeka i skraćuje vrijeme do postizanja optimalne koncentracije. Američka agencija za hranu i lijekove (FDA) stoga predlaže provođenje farmakogenomskog testiranja na polimorfizam alela CYP2C9 i VKORC1 kod uvođenja varfarina u terapiju. Ta metoda, kombinirana s kliničkim parametrima, ipak ne uspijeva dovoljno dobro predvidjeti stabilnu terapijsku dozu varfarina za sve pacijente. Uloga glikozilacije proteina plazme u farmakokinetici lijekova nije dovoljno raszjašnjena. Za alfa-1 kiseli glikoprotein, koji je jedan od glavnih glikoproteina plazme za vezanje lijekova, in vitro je dokazano da visoki stupanj grananja Nglikana i antenarna fukozilacija smanjuju njegov afinitet vezanja varfarina. Stoga je cilj ovog rada bilo ispitati može li N-glikom ukupnih plazmatskih proteina (koji sadrži i glikane alfa-1 kiselog glikoproteina) predvidjeti potrebnu inicijalnu dozu varfarina. Nakon izoliranja iz uzoraka krvnih plazmi i obilježavanja fluorescentnom bojom (2-aminobenzamid), N-glikani su razdvojeni visokotlačnom tekućinskom kromatografijom temeljenoj na hidrofilnim interakcijama. Dobiveni kromatografski vršci su ručno integrirani i normalizirani na ukupnu površinu. Pomoću općeg linearnog modela, prilagođenog po dobi i spolu, napravljena je regresijska analiza u programu R (verzija 3.3.3). Rezultati pokazuju da nijedan glikan, kao niti jedno derivirano svojstvo glikana ne pokazuje statistički značajnu povezanost s potrebnom terapijskom dozom varfarina, no postoje naznake da bi povezanost mogla biti uočena smanjenjem šuma glikana ostalih plazmatskih glikoproteina prethodnom izolacijom alfa-1kiselog glikoproteina i analizom samo njegove N-glikozilacije. Warfarin is the oldest and the most widely prescribed oral anticoagulant. Due to its narrow therapeutic range and wide interpatient variability, INR monitoring is required. Establishing the proper initial warfarin dose, adverse effects are minimized and time to achieve optimal drug concentration is shortened. That is why FDA has proposed pharmacogenomic testing of CYP2C9 and VKORC1 alleles for guiding the initial dose of warfarin. Combined with clinical algorithms, pharmacogenomic testing is still not able to estimate stable therapeutic dose for all patients. The role of plasma protein glycosylation in pharmacokinetics is yet to be elucidated. Alpha-1 acid glycoprotein, which is one of the most common drug binding proteins, has shown in vitro reduced warfarin-binding-affinity due to increased N-glycans' antennae branching and antennary fucosylation. Therefore, the goal of this thesis was to examine if total plasma protein N-glycome (which also include alpha-1 glycoprotein's N-glycans) can predict required initial dose of warfarin. After isolation from plasma samples and labeling with flourescent dye (2-aminobenzamide), N-glycans were separated by hydrophilic interaction liquid chromatography. Later, chromatographic peaks were manually integrated and normalized to total peak area. Using general linear model, adjusted by age and sex, regression analysis in R software (version 3.3.3) has been performed. Results show that there is not any glycan nor derived glycan feature showing statistically significant association with required warfarine dose, but there is some indication that the associations could be found by reducing other plasma protein N-glycans' background noise by alpha-1 acid glyoprotein isolation prior to N-glycome analysis.

N-glikozilacija je post-translacijska modifikacija proteina koja se odvija u endoplazmatskom retikulumu i Golgijevom aparatu. Modifikacije N-glikana u Golgijevom aparatu su pH ovisne te je narušavanje homeostaze pH u Golgijevom aparatu vidljivo u promjeni struktura Nglikana. Efekt salinomicina istraživan je na profilu N-glikana na modelu TMS (HMLE-pBp i HMLE-Twist). Za salinomicin je prethodno pokazano selektivno djelovanje na tumorske matične stanice (TMS). Profil N-glikoma sekretiranih proteina se promijenio nakon tretmana salinomicinom u obje stanične linije. Najuočljivija razlika u profilima nakon tretmana je izostanak razgranatih kompleksnih glikanskih struktura te relativno povećanje jednostavnih glikana, što upućuje na to da salinomicin narušava homeostazu u Golgijevom aparatu dok endoplazmatski retikulum ostaje nepromijenjen. Nadalje, primijetili samo da je efekt naglašeniji na HMLE-Twist nego na HMLE-pBp staničnoj liniji. N-glycosilation is a post-translational modification of proteins that occurs in endoplasmatic reticulum and Golgi apparatus. Modifications of N-glycans in the Golgi apparatus are pH dependent and a disruption of pH homeostasis in Golgi apparatus is visible in the change of N-glycan structures. We investigated the effect of salinomycin, a cancer stem cell (CSC) targeting compound, on N-glycan profile of a CSC model (HMLE-pBp and HMLE-Twist cell lines). N-glycome profile of secreted proteins changed in both cell lines after treatment with salinomycin. The most evident difference in profiles after treatment is the loss of highly branched complex glycan structures and the relative increase of simpler glycans, indicating that salinomycin disrupts the Golgi apparatus homeostasis while the endoplasmatic reticulum remains intact. Moreover, we noticed that the effect of is more prominent on HMLE-Twist than on HMLE-pBp cell line.

Dijabetes mladih koji se javlja u odrasloj dobi (MODY, engl. maturity onset diabetes of the young) monogenski je tip dijabetesa, najčešće uzrokovan mutacijama u genu HNF1A. Vrlo se često pogrešno dijagnosticira kao dijabetes tipa 1 ili 2, međutim, pravilna dijagnoza od izrazite je važnosti, budući da je kod ovih pacijenata moguće dugo održavati normoglikemiju oralnom primjenom derivata sulfonilureje. Definitivna dijagnoza bolesti postavlja se sekvenciranjem gena HNF1A, ali i tada postoji problem određivanja patogenosti pronađenih varijanti. Kako se protein HNF1α pokazao ključnim regulatorom fukozilacije proteina, plazmatski je N-glikom značajno promijenjen kod oboljelih od HNF1A-MODY-a. Dobiveni rezultati pokazuju da mnogi glikanski parametri mogu uspješno raspoznati pacijente s rijetkim varijantama gena HNF1A, od pacijenata bez HNF1A varijanti. Glikani pokazuju vrijednost i u određivanju utjecaja pronađenih rijetkih HNF1A varijanti na funkciju, točnije, mogu se upotrijebiti kao biljeg patogenih varijanti. Zaključno, uključivanjem glikanskog biljega u dijagnostički protokol za HNF1A-MODY značajno bi se povećala dijagnostička osjetljivost. Maturity onset diabetes of the young (MODY) is a monogenic form of diabetes most commonly caused by HNF1A mutations. It is frequently misdiagnosed as type 1 or type 2 diabetes, but correct diagnosis of MODY patients is of utmost importance, since their hyperglycemia is usually very sensitive to oral treatment with sulphonylurea agents. HNF1A-MODY is definitively diagnosed by gene sequencing, but even then, a confirmation that HNF1A variants are pathogenic remains an issue. Since HNF1α showed to be a master regulator of protein fucosylation, plasma N-glycome is significantly altered in HNF1A-MODY patients. Results presented in this thesis show that many glycan traits can successfully discriminate patients with rare HNF1A variants from patients without the variant. Glycans also show value in assessing the effect of identified allele variants on gene function, i.e., they can be used as biomarkers of pathogenic variants. In conclusion, incorporating glycans in diagnostic protocol for HNF1AMODY would significantly increase diagnostic sensitivity.

N-glikozilacija ima strukturnu ulogu te utječe na efektorske funkcije imunoglobulina G (IgG-a). Promjena glikozilacije povezuje se s kompleksnim bolestima za čiji se mehanizam nastanka kao modelni organizmi koriste miševi. Miševi s uklonjenim genima (eng. knockout) za receptore specifične za fragment koji kristalizira (FcγR) mogu dati uvid kako N-glikozilacija utječe na interakcije fragmenta koji kristalizira (Fc) i receptora Fcγ u reakcijama imunološkog sustava. Potrebno je razviti osjetljive visokoprotočne metode kojima se osim velikog broja uzoraka, može analizirati i N-glikozilacija manjih koncentracija IgG-a kao što je mišji IgG. Metodom LC-MS analizirana je N-glikozilacija IgG-a izoliranog iz seruma divljeg tipa i miševa s uklonjenim genima koji kodiraju FcγRI, FcγRIIB, FcγRIII, FcγRIV te γ teški lanac fragmenta Fc. Također, uspoređeni su glikanski profili IgG-a iz miševa divljeg tipa te miševa s uklonjenim genima za receptore Fcγ i γ lanac. Djelomično je optimizirana metoda CGE-LIF kojom je analizirana N-glikozilacija ljudskog IgG-a. N-glycosylation has structural roll and modulate immunoglobulin G (IgG) effector functions. Glycosylation changes are associated with complex diseases and mouse model organism is used for studies of disease development mechanism. Fragment crystallizable γ receptor (FcγR) knockout mouse can provide insight into how IgG N-glycosylation affects the fragment crystallizable (Fc) and FcγR interaction during immune reaction. It is necessary to bring into practice sensitive high-throughput methods not only for large number of samples, but also for N-glycosylation analysis in samples with low IgG concentrations as for example mouse IgG. N-glycosylation of FcγRI, FcγRIIB, FcγRIII, FcγRIV and γ-chain knockout mouse IgG is analysed by LC-MS method. Furthermore, glycoprofiles of IgG glycoforms from wild type mouse strains are compared with FcγR and γ chain knockouts. CGE-LIF method is partially optimised and human IgG N-glycosylation is analysed.

N-glikozilacija proteina je ključna za razvoj i funkciju živčanog sustava. U ovoj disertaciji konstruiran je prostorno-vremenski glikomski profil mozga, istražujući N-glikanske strukture četiriju funkcionalno različitih regija mozga, fronatalna dorsalna kora velikog mozga, hipokampus, strijatum te mali mozak, i njihovu raspodjelu u mozgu odraslog čovjeka; kao i u mozgu čovjeka tijekom fetalnog razvoja. Također, s namjerom da se dobije evolucijska perspektiva N-glikanskih struktura unutar različitih regija mozga, napravljena je usporedba odgovarajućih regija mozga između glikoma mozga čovjeka, čimpanzi, makaki majmuna i štakora. Određivanje glikanskih profila uzoraka mozga je provedeno korištenjem dvaju analitičkih pristupa: tekućinske kromatografije ultravisoke djelotvornosti i spektrometrije masa. Uvidom u N-glikom analiziranih uzoraka, uočena je značajna razlika između različitih regija, vrsta i razvoja mozga. Razlika između N-glikoma je bila veća što su vrste bile evolucijski udaljenije. N-glikanski profil malog mozga se najviše razlikovao od ostalih analiziranih regija. Razvijena HILIC-UPLC metoda za analizu N-glikana tkiva mozga se pokazala reproducibilnom i robusnom. Protein N-glycosylation is crucial for the development and function of the nervous system. In this dissertation, a spatio-temporal profile of the brain glycome was constructed by investigating N-glycan structures of four functionally distinct brain regions, the dorsal fronatal cortex, the hippocampus, the striatum and the cerebellum, and their distribution within the adult human brain as well as the fetal. Moreover, in order to obtain an evolutionary perspective of the corresponding brain regions, a cross-species comparison was made between the human, the chimpanzee, the macaque and the rat. Two analytical approaches were used for glycosylation profiling of brain samples: ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Significant difference was noticed between the regions, the species and the developmental stages in the analyzed N-glycomes. The difference between species was higher as they were evolutionary more distinct. The cerebellar N-glycom was the most distinctive of all the analyzed brain regions. The developed HILIC-UPLC method for the N-glycans analysis of the brain tissue was reproducible and robust.

Upalne bolesti crijeva (engl. inflammatory bowel diseases, IBD) su kronične bolesti probavnog trakta koje nastaju zbog neodgovarajućeg upalnog odgovora imunološkog sustava na crijevnu mikrofloru u osoba s genetičkom predispozicijom. Cjelogenomske studije povezanosti su povezale gliko-gen MGAT3 s glikozilacijom imunoglobulina G (IgG) i IBD-em. Druga istraživanja su s razvojem IBD-a povezala i gliko-gen MGAT5. Bisulfitnim pirosekvenciranjem analizirala sam metilaciju gena MGAT3 i MGAT5 iz krvi pacijenata s IBD-em dviju velikih neovisnih kohorti te pokazala da je metilacija ovih gena značajno promijenjena u ulceroznom kolitisu i Crohnovoj bolesti. Korelacijske analize upućuju na smanjenu ekspresiju gena MGAT3 (kodira za enzim GnT-III) u IBD-u, ako je točna pretpostavka da su analizirana CpG mjesta unutar promotora tog gena uključena u regulaciju ekspresije. U trećoj manjoj kohorti analizirala sam metilaciju gena MGAT3 i MGAT5 u mononuklearnim stanicama krvi, T-limfocitima izoliranim iz krvi i iz tkiva crijeva, te pokazala značajnu promjenu metilacije oba gena u T-limfocitima iz crijeva, te promijenjenu metilaciju i ekspresiju gena MGAT5 u T-limfocitima iz tkiva crijeva pacijenata s aktivnim oblikom ulceroznog kolitisa. Inflammatory bowel diseases (IBD) are a group of intestinal disorders that occur due to inappropriate immune response to intestinal microbiome in genetically susceptible individuals. Genome wide association studies associated MGAT3 gene with IgG glycosylation and IBD. Previous studies associated another glyco-gene, MGAT5 with IBD, too. Methylation of MGAT3 and MGAT5 genes was analysed from whole blood of IBD patients from two large independent cohorts using bisulfite pyrosequencing. The results showed significant change in methylation level between patients with Crohn's disease and ulcerative colitis, and healthy controls. Correlation analysis between MGAT3 methylation and IgG glycans suggests that MGAT3 (coding for GnT-III enzyme) expression is reduced in IBD, if CpG sites encompassed with methylation assays are relevant for transcriptional regulation. In third cohort with smaller number of patients with ulcerative colitis, methylation of MGAT3 and MGAT5 genes was analysed in mononuclear cells from blood, T cells from blood, and T cells from inflamed bowel tissue. Change in methylation level of both genes was observed only in T cells from bowel tissue. The methylation and expression of MGAT5 gene was significantly changed in T cells from bowel tissue in active ulcerative colitis.

Sažetak Upalna bolest crijeva je kroniĉni upalni poremećaj gastrointestinalnog trakta za koji se smatra da je rezultat meĊudjelovanja genskih i okolišnih ĉimbenika. Genetiĉka israţivanja su pokazala da postoji povezanost gena koji sudjeluju u regulaciji glikozilacije IgG-a i upalne bolesti crijeva. N-glikozilacija IgG-a utjeĉe na njegovu strukturu i imunološku funkciju. U ovoj disertaciji analizirana je N-glikozilacija IgG-a kod 804 pacijenta s upalnom bolesti crijeva i zdravih ispitanika, što je dosad najveće istraţivanje glikana u upalnoj bolesti crijeva. Pokazano je da su galaktozilirane glikoforme IgG-a statistiĉki znaĉajno manje zastupljene kod pacijenata koji boluju od Crohnove bolesti i ulceroznog kolitisa u odnosu na zdrave ispitanike. Monosijalinizirane glikoforme su statistiĉki znaĉajno manje zastupljene kod pacijenata koji boluju od Crohnove bolesti. Uoĉena je veća zastupljenost glikoformi s raĉvajućim GlcNAc-om u upalnoj bolesti crijeva u odnosu na zdrave ispitanike. IgG ima potencijal kao dijagnostiĉki i prognostiĉki biomarker za upalnu bolest crijeva. Tijekom studije evaluirana je metoda HILIC-UPLC, te je razvijena, optimirana i validirana nova visoko-protoĉna metoda priprave N-glikana za analizu tekućinskom kromatografijom. Poboljšanje metodologije će omogućiti toĉniju i informativniju analizu N-vezanih glikana u budućnosti. Inflammatory bowel disease is chronic inflammatory disorder of the gastrointestinal tract which is considered to be the result of the interaction of genetic and environmental factors. Genetic studies have shown pleiotropy between IgG glycosylation and inflammatory bowel disease. IgG N-glycosylation affects its structure and immune function. IgG N-glycosylation in 804 inflammatory bowel disease patients and healthy controls was analyzed within this dissertation, which makes it the largest study of glycans in inflammatory bowel disease. The results demonstrated statistically significant decrease in IgG galactosylation in Crohn's disease and ulcerative colitis compared to healthy controls, as well as statistically significant decrease in IgG monosialylation in Crohns disease. Increase in proportion of structures with bisecting GlcNAc was observed in inflammatory bowel disease patients compared to healthy controls. Therefore, IgG has a potential as diagnostic and prognostic biomarker for inflammatory bowel disease. Within this dissertation HILIC-UPLC method was validated, and new high-throughput preparation method for N-glycan analysis by liquid chromatography was developed, optimized, and validated. Improved methodology will enable more accurate and informative N-glycan analysis in the future.

Glikanske strukture terapeutskih proteina utječu na njihova farmakodinamička i farmakokinetička svojstva. Optimalna glikozilacija povećala bi učinkovitost i sigurnost rekombinantnih farmaceutskih proteina. S obzirom na jeftiniji uzgoj i procesiranje, jednostavan N-glikozilacijski put i odsutnost O-glikozilacijskog puta karakterističnog za sisavce, biljke su se posljednjih godina nametnule u modeliranju ekspresijskog sustava za proizvodnju potpuno humaniziranih rekombinantnih terapeutskih proteina. Ciljevi pri konstruiranju takvog optimalnog sustava su inaktivacija gena za enzime karakteristične za biljnu glikozilaciju te uvođenje gena za enzime koji su karakteristični za čovjeka. Glycan structures of therapeutic proteins affect their pharmacodynamics and pharmacokinetic characteristics. Optimal glycosylation would enhance efficiency and safety of recombinant pharmaceutical proteins. Due to inexpensive and simple cultivation, simple Nglycosylation pathway and absence of typical mammalian O-glycosylation pathway, in recent years plants have emerged as interesting new hosts for the production of fully humanized recombinant pharmaceutical proteins. Aims in engineering optimal expression system are inactivation of genes for plant-specific enzymes and introduction of enzymes that are humanspecific.