Search

[eng] Human Concentrative Nucleoside Transporters (hCNTs) are encoded by SLC28 gene family. It has been demonstrated that hCNT1 is lost in some cancers. Furthermore, hCNTs have the ability of translocating selected nucleoside- derivatives, currently used in anticancer therapies, for that reason, a change in their expression profile could affect drug bioavailability and drug chemoresistance. Recent studies demonstrate that hCNT1 has also additional functions, being a transceptor and it is likely to be relevant in tumor biology and during the carcinogenic process. Although mechanisms responsible for hCNT1 loss during carcinogenesis are unknown, it seems likely that epigenetic modifications might be able to affect hCNT1 expression and functional activity. miRNAs are small, non-codding transcripts which play a key role during the carcinogenic process with a discriminatory expression profiles significantly different to healthy individuals. miRNAs pair to mRNA by complementarity to 3’UTR extreme of the target gene, modulating its expression. The objective of this work aims to elucidate miRNAs associated with hCNT1 loss of expression in CRC, PDAC and HCC. The analysis of paired clinical samples of CRC, PDAC and HCC confirm the decrease of hCNT1 compared to the adjacent non-tumoral tissue. Also, increased expression of miR-106a, miR-17 and miR- 18a is correlated with hCNT1 loss of expression in the same clinical samples. The luciferase assay validates hCNT1 as a direct target of miR-106a and miR-17. Furthermore, the modulation of these miRNAs could affect hCNT1 mRNA and protein levels. A new 3D cell culture model (spheroids) is presented to increase basal levels of endogenous hCNT1 compared to monolayer cell culture. This new model allows to evaluate hCNT1 modulation by miRNAs as an easy and complete way. The results obtained in spheroid culture confirm the ability of miR-106a and miR-17 to regulate hCNT1 expression. Moreover, miRNAs silencing increase gemcitabine effect in spheroids. All these results propose miR-106a and miR-17 as possible new therapeutic targets to improve nucleoside analogs treatment by increasing hCNT1 and also the possibility of using them as biomarkers.

[cat] La metamorfosi és un procés de canvi morfològic radical que succeeix en un període específic durant el desenvolupament postembrionari de diverses espècies animals, tals com amfibis o insectes. En el cas dels insectes, hi ha dos tipus principals de metamorfosi: de tipus hemimetàbol, on els individus fan una metamorfosi progressiva i les nimfes s’assemblen als adults, com succeeix en les xinxes, paneroles i saltamartins. En la metamorfosi holometàbola, en canvi, es dóna una transformació morfològica radical, de larva a pupa i de pupa a adult, com s’observa en papallones, escarabats i mosques. La metamorfosi holometàbola s’originà a partir d’ancestres hemimetàbols, i aquesta innovació va tenir molt d’èxit si considerem que més del 80% dels insectes actuals són espècies holometàboles. En tots dos tipus de metamorfosi la regulació és propiciada per l’acció de dues hormones, l’esteroide 20-hidroxiecdisona (20E), o hormona de la mud,a i el sesquiterpenoide hormona juvenil (HJ). Mentre que la 20E indueix les mudes, l’HJ reprimeix la metamorfosi. L’objectiu general d’aquesta tesi doctoral és ajudar a comprendre els mecanismes moleculars pels quals l’HJ reprimeix la metamorfosi, utilitzant com a model la panerola Blattella germanica, un insecte amb metamorfosi hemimetàbola poc modificada, i emmarcar aquests resultats en un context evolutiu. Així, hem estudiat el paper del receptor de l’HJ, el factor de transcripció Methoprene-tolerant (Met). Els estudis suprimint l’expressió d’aquest gen mitjançant RNA d’interferència (RNAi) en fases nimfals mostren que Met és necessari en la transducció del senyal hormonal, ja que la seva supressió provoca una metamorfosi precoç. El factor de transcripció Taiman (Tai) es postula com a millor candidat a actuar com a heterodímer de Met en la recepció de l’HJ, encara que cap experiment in vivo ha pogut demostrar aquesta funció degut a que la seva supressió en diversos models d’insectes resultà letal. A B. germanica Taiman s’expressa en quatre isoformes resultants de la combinació de dues insercions/delecions (indels) a la regió carboxi-terminal de la seqüència. La reducció de l'expressió de les isoformes que contenen la inserció-1 de Tai provoca una metamorfosi precoç. La presència d’aquesta inserció en isoformes de Tai d’altres espècies suggereix que el mecanisme de transducció de l’activitat antimetamòrfica de l’HJ mitjançant aquestes isoformes és un fenomen conservat en altres insectes. Un altre factor de transcripció que participa en la senyalització de l'HJ és Broad-Complex (BR-C). A les espècies holometàboles BR-C s’expressa al darrer estadi larvari i la seva expressió transitòria és essencial per una formació de la pupa. Els estudis a B. germanica revelen funcions ancestrals de BR-C relacionades amb divisió cel·lular i creixement de l’ala, alhora que aporten noves pistes que ajuden a entendre l’evolució de la metamorfosi dels insectes. Un altre element important que participa en la transducció del senyal de l’HJ en relació amb la metamorfosi és el factor de transcripció Krüppel-homolog 1 (Kr-h1). Hem mostrat que la reducció de nivells d'expressió de Kr-h1 a fases nimfals a B. germanica indueix una metamorfosi precoç. Aquests resultats, conjuntament amb els resultats previs obtinguts en espècies holometàboles, suggereixen que el paper repressor de Kr-h1 en la metamorfosi és una condició ancestral que s’ha conservat en espècies hemimetàboles i holometàboles. Els microRNAs (miRNAs) són una classe d’RNAs petits no codificants que regulen l’expressió de gens a nivell transcripcional mitjançant la regulació de l’mRNA. Per tal de desvetllar la funció dels miRNAs durant el desenvolupament de B. germanica, es van dur a terme experiments suprimint l’expressió de Dicer-1, enzim que participa en la biosíntesi dels miRNAs, i el resultat va ser una inhibició de la metamorfosi. Els resultats presentats en aquesta tesi suggereixen aquest fenotip és la conseqüència principal d’una davallada de l’expressió d’una sola família de miRNAs, miR-2. El conjunt d’experiments realitzats indiquen que miR-2 regula la davallada de l’expressió del transcrit de Kr- h1 a la darrera fase nimfal de B. germanica, la qual cosa propicia que la metamorfosi es desenvolupi correctament., [eng] Metamorphosis is a process were a sudden and conspicuous morphological change occurs at a specific time point during the postembryonic development of several animal groups, like amphibians and insects. Insect metamorphosis proceeds in two modes: hemimetaboly, defined by a gradual change along the life cycle, as occurs in bugs, cockroaches and locusts, and holometaboly, characterized by an abrupt change from larvae to adult mediated by a pupal stage, has observed in butterflies, beetles and flies. Metamorphosis evolved from hemimetaboly to holometaboly and the latter innovation was most successful because more than 80% of present insects are holometabolan species. From an endocrine point of view, both hemimetabolan and holometabolan metamorphosis is regulated by two kinds of hormones: 20-hydroxyecdysone (20E), which induce molts, and juvenile hormone (JH), which inhibits metamorphic changes. Using the cockroach Blattella germanica as a basal hemimetabolous model, the general objective of this thesis is to study the molecular action of JH in repressing insect metamorphosis. One of the main players in hormonal signalling is Methoprene-tolerant (Met), which plays the role of JH receptor. Depletion of Met in young nymphal instars triggers precocious metamorphosis, suggesting that Met transduces the antimetamorphic signal of JH. Recent studies report that Met heterodimerizes with Taiman (Tai) forming the receptor complex of JH in metamorphosis repression. However, there is no data in vivo demonstrating a role of Tai in metamorphosis, because its depletion in a number of insect models resulted in 100% mortality. B. germanica possesses four Tai isoforms resulting from the combination of two indels in the C-terminal region of the sequence. RNAi depletion of insertion-1 isoforms results in a precocious adult development, demonstrating its involvement in metamorphosis. The insertion-1 of Tai is conserved in other insect species, which suggests that the mechanism of signal transduction of the antimetamorphic action of JH I conserved in other species. An important JH-dependent factor is BR-C, whose expression in holometabolan species is inhibited by JH in young larvae and enhanced in mature larvae to specify to pupal stage. The functional study of BR-C in cockroach reveal ancestral functions related to cell division and wing pad growth. Krüppel-homolog 1 (Kr-h1) is a transcription factor whose function as transductor of the antimetamorphic action of JH has been demonstrated in holometabolan species. RNAi experiments depleting Kr-h1 in young nymphal instars of B. germanica results in precocious metamorphosis, suggesting that their role as a JH transductor in metamorphosis is evolutionary conserved in hemimetabolan and holometabolan species. Finally, it has been reported that depletion of dicer-1, the enzyme that catalyzes the final step of miRNA biosynthesis, prevents metamorphosis in B. germanica. This thesis has addressed the question of how miRNAs act in metamorphosis and why their absence impairs it. The whole data of experiments reported here indicate that miR-2 scavenges Kr-h1 transcripts in the last nymphal instar of B. germanica, which contributes to the correct development of metamorphosis.

Les patologies renals s’han convertit en una problemàtica a nivell mundial, en l’actualitat poden afectar a una de cada 9 persones al llarg de la seva vida i porten associats elevats costos econòmics. Malgrat els últims avenços científics i millores en el tractament d’aquestes patologies, el transplantament renal i la diàlisi continuen sent les dues úniques opcions terapèutiques efectives en el tractament de la insuficiencia renal. La regeneració de l’epiteli renal és determinant en la recuperació del pacient ja que determina que es pugui restablir la funcionalitat d’aquest òrgan. L’obtenció de precursors renals a partir de cèl•lules mare que puguin integrar-se i regenerar el ronyó lesionat s’ha convertit en una àrea de recerca biomèdica molt important. L’objecte d’estudi d’aquesta tesi va ser conèixer els mecanismes involucrats en la diferenciació de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) i les cèl•lules mare adiposes (ASCS) cap al llinatge epitelial renal ja que aquestes cèl•lules poden ser una potencial font d’aquests precursors renals amb capacitat regenerativa. Recentment s’ha descobert que els miRNAs, que tenen la funció de regular l’expressió gènica en l’etapa post-transcripcional, són essencials en la diferenciació de les cèl•lules mare i s’han trobat miRNAs específics que regulen la diferenciació a un llinatge cel•lular en concret. En aquest sentit, el nostre objectiu general en aquest treball va ser estudiar el paper dels miRNAs en la diferenciació de cèl•lules mare a progenitors epitelials renals. Per això, primer de tot es van realitzar experiments de diferenciació en que els cossos embrionaris (EBs) induïts a partir de les cèl•lules mare embrionàries (ESCs) es van cultivar amb un medi de cultiu suplementat amb all-trans-retinoic acid (ATRA) i activina A, i les cèl•lules mare adiposes (ASCs) amb un medi amb una concentració fisiológica de glucosa suplementat amb ATRA. Amb aquests protocols de diferenciació, es van obtenir cèl•lules amb característiques de progenitors renals. Els EBs cultivats amb el protocol de diferenciació expressaven els marcadors de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 i Wnt9b). Les ASCs cultivades amb ATRA varen canviar la seva morfologia a una morfologia epitelial i van expressar marcadors tant de l’organogènesi renal inicial (Pax2, WT1, Wnt4, Six2 i Megalina) com els marcadors epitelials (Citoqueratina 18, E-caderina). Un anàlisis de miRNAs va demostrar que la família de miRNAs let-7 es sobreexpressava durant la diferenciació dels EBs i que el miRNA let-7e més concretament era essencial en l’expressió dels marcadors Pax2, Wt1i Wnt4 ja que la seva silenciació disminuïa l’expressió d’aquests gens. En les ASCs, en canvi, es va demostrar que el miRNA let-7e també augmentava en la diferenciació i que a més tenia característiques d’inductor de la diferenciació, essent essencial en l’expressió tant dels marcadors de l’organogènesi renal (Pax2, Wt1, Wnt4, Megalina) com del marcador epitelial CK18. Profunditzant en el paper del miRNA let-7e en la diferenciació, es va demostrar amb experiments de Western blot, que el miRNA let-7e modula els nivells de β-catenina a través d’un mecanisme que implica la inhibició de la PKCβ i la conseqüent disminució en la fosforilació de la GSK3β (Ser-9) i que això és imprescindible per la correcta diferenciació de les ESCs. Per altra banda, en les ASCs es va demostrar utilitzant l’assaig del gen reporter de la luciderasa, que el miRNA let-7e inhibeix directament l’expressió de la metal•loproteinasa 9 i que d’aquesta manera modula la diferenciació de les ASCs al llinatge epitelial renal., Role of miRNA in stem cell differentiation Renal diseases have become a worldwide problem that can affect one in nine people throughout their life. Despite recent scientific advances, kidney transplantation and dialysis are still the only two effective therapeutic options in renal failure. The regeneration of the epithelium is critical for patient recovery as it determines the restoration of the kidney functionality. Cell precursors obtained from renal stem cells that can regenerate and integrate the injured kidney have become an important research area. The aim of our study was to determine the mechanisms involved in the differentiation of embryonic stem cells (ESCs) and adipose stem cells (ASCs) to renal epithelial lineage as these cells can be a source of these renal precursors with regenerative potential. It was recently discovered that miRNAs, which have the function of regulating gene expression in the post-transcriptional level, are essential in the differentiation of stem cells. In this sense, our main objective was to study the role of miRNAs in stem cells differentiation to renal epithelial progenitors. For this purpose, We have carried out experiments of stem cells differentiation. Embryoid bodies (EBs) from ESCs were cultured with activin A and ATRA and ASCs where cultured in a medium with physiological concentration of glucose supplemented with ATRA, obtaining progenitor cells with renal epithelial characteristics. EBs expressed the early kidney organogenesis markers (Pax2, WT1, Wnt4, Notch2 Wnt9b) and ASCs changed their morphology to a more epithelial one and expressed both markers of kidney organogenesis (Pax2, WT1, Wnt4, SIX2 i Megalin) and epithelial markers (cytokeratin-18 and E-cadherin). Furthermore, miRNA analysis and the subsequent overexpression and silencing of the miRNA let-7e in stem cells, demonstrates that this miRNA has characteristics of differentiation inductor and that is essential in the expression of both kidney organogenesis markers and epithelial markers. Furthermore, the ESCs, let-7e miRNA modulates β-catenin levels through a mechanism involving inhibition of PKCβ and the consequent decrease in the phosphorylation of GSK3 (Ser-9). Moreover, it was demonstrated using the luciferase assay, that the miRNA let-7e directly inhibits expression of gelatinase B (MMP9) in ASCs and thereby modulates its renal epithelial differentiation.

[cat]La fibril.lació auricular és l’arítmia cardiaca més freqüent, amb una elevada morbimortalitat i impacte econòmic. Augmentant-ne la importància epidemiològica, s’espera que la seva incidència s’incrementi de forma molt marcada com a conseqüència de l’envelliment de la població. En aquesta tesi doctoral, estudio la fisiopatologia i el tractament de la fibril.lació auricular a través d’un abordatge experimental i clínic. L’exercici físic de molt elevada intensitat és una de les causes emergents de fibril.lació auricular, especialment en individus joves i de mitjana edat. La fisiopatologia n’és desconeguda. En aquesta tesi, en un model exeperimental d’exercici físic en rata, es demostra mitjançant tècniques in vivo i in vitro que la hipertonia vagal característica dels atletes és un factor clau en el desenvolupament de la fibril.lació auricular de l’atleta. El substrat aritmogènic induit per l’exercici és reversible, especialment la hipertonia vagal. Per contra, el remodelat estructural (dilatació auricular i fibrosi) reverteixen de forma molt més lenta o incompleta. Els microRNA són seqüències curtes de RNA, recentment descrites, que participen en la regulació post-transcripcional de l’expressió génica. Els microRNA participen en gran quantitat de processos fisiològics i patològics, entre els quals el desenvolupament de fibrosi en diferents teixits. Tanmateix, es desconeix la seva participació en el desenvolupament del substrat de la fibril.lació auricular. En aquesta tesis, s’estudia la participació de miR-21 en el remodelat auricular post-infart de miocardi ventricular. S’usa un model en rata en el que objectivem una elevada inducibilitat de fibril.lació auricular. Es demostra que miR-21 participa en el desenvolupament de fibrosi miocàrdica auricular, i que la seva inhibició és capaç de prevenir-ne el desenvolupament i la inducibilitat de fibril.lació auricular. Es postul.la miR-21 com a possible diana terapéutica en el tractament de la fibril.lació auricular. El tractament anticoagulant constitueix la base de la prevenció del risc embòlic en la fibril.lació auricular. Ocasionalment, els pacients diagnosticats de fibril.lació auricular pateixen malaltia coronària com a comorbilitat, i requereixen tractament antiplaquetari amb aspirina i tienopiridines. El risc hemorràgic i trombòtic de la triple combinació d’anticoagulació, aspirina i tienopiridina roman desconeguda. En aquesta tesi estudiem aquest problema en pacients sotmesos a intervencionisme coronari i mostrem que es presenta en un de cada vuit pacients. En el seguiment, els pacients als que se’ls prescriu la triple combinació antitrombòtica presenten una incidència significativament menor d’esdeveniments trombòtics que els que no la van rebre, amb una major incidència d’hemorràgies no greus com a contrapartida., [eng] Atrial fibrilliation is the most common cardiac arrhythmia, with a high morbidity, mortality and economic burden. An aging population in the upcoming years will likely increase its incidence and intensificate its epidemiological importante. This doctoral thesis approaches the pathology and therapy of atrial fibrillation through clinical and experimental studies. Very high intensity exercise is an emerging cause of atrial fibrillation in young and middle-aged individuals. However, its pathophysiology is unknown, yet. Here, a rat model of endurance, very high intensity exercise is used to study its mechanisms. By mean of in vivo and in vitro techniques, vagal enhancement is shown to be key factor in the development of exercise-induced atrial fibrillation. Moreover, exercise-induced arrhythmogenic atrial substrate is reversible, particularly concerning vagal enhancement. In contrast, structural remodeling (atrial fibrosis and dilatation) slowly or uncompletely reversed. MicroRNAs are recently discovered short RNA sequences that regulate post-transcriptional gene expression. MicroRNAs are involved in a large number of physiological and pathological processes, including fibrosis development. However, it is unknown whehter they participate in atrial fibrillation substrate. In this thesis, miR-21 involvement in post-left ventricle myocardial infarction atrial remodeling is explored. A left ventricle myocardial infarction rat model with a high burden of atrial fibrillation inducibility is used. We show that miR-21 is involved in atrial fibrosis pathology, and its inhibition may prevent its development and atrial fibrillation inducibility. Mir-21 is postulated as a potential therapeutic target in the treatment of atrial fibrillation. Anticoagulant therapy is on the basis of thrombo-embolic risk prevention in atrial fibrillation patients. Occasionally, patients diagnosed with atrial fibrillation are also diagnosed of ischemic cardiomyopathy and require antiplatelet therapy with aspirin and tienopiridines. The hemorrhagic risk of triple thrombotic combination of anticoagulation, aspirin and thienopiridines is unknown. In this thesis we study this problem in patients undergoing coronary intervention and show that this occurs in one out of eight patients in the cath lab. At follow-up patients who were prescribed triple combination antithrombotic had a significantly lower incidence of thrombotic events than those who did not receive it. A higher risk of non-serious bleeding balanced its benefits.

La fibril.lació auricular és l’arítmia cardiaca més freqüent, amb una elevada morbimortalitat i impacte econòmic. Augmentant-ne la importància epidemiològica, s’espera que la seva incidència s’incrementi de forma molt marcada com a conseqüència de l’envelliment de la població. En aquesta tesi doctoral, estudio la fisiopatologia i el tractament de la fibril.lació auricular a través d’un abordatge experimental i clínic. L’exercici físic de molt elevada intensitat és una de les causes emergents de fibril.lació auricular, especialment en individus joves i de mitjana edat. La fisiopatologia n’és desconeguda. En aquesta tesi, en un model exeperimental d’exercici físic en rata, es demostra mitjançant tècniques in vivo i in vitro que la hipertonia vagal característica dels atletes és un factor clau en el desenvolupament de la fibril.lació auricular de l’atleta. El substrat aritmogènic induit per l’exercici és reversible, especialment la hipertonia vagal. Per contra, el remodelat estructural (dilatació auricular i fibrosi) reverteixen de forma molt més lenta o incompleta. Els microRNA són seqüències curtes de RNA, recentment descrites, que participen en la regulació post-transcripcional de l’expressió génica. Els microRNA participen en gran quantitat de processos fisiològics i patològics, entre els quals el desenvolupament de fibrosi en diferents teixits. Tanmateix, es desconeix la seva participació en el desenvolupament del substrat de la fibril.lació auricular. En aquesta tesis, s’estudia la participació de miR-21 en el remodelat auricular post-infart de miocardi ventricular. S’usa un model en rata en el que objectivem una elevada inducibilitat de fibril.lació auricular. Es demostra que miR-21 participa en el desenvolupament de fibrosi miocàrdica auricular, i que la seva inhibició és capaç de prevenir-ne el desenvolupament i la inducibilitat de fibril.lació auricular. Es postul.la miR-21 com a possible diana terapéutica en el tractament de la fibril.lació auricular. El tractament anticoagulant constitueix la base de la prevenció del risc embòlic en la fibril.lació auricular. Ocasionalment, els pacients diagnosticats de fibril.lació auricular pateixen malaltia coronària com a comorbilitat, i requereixen tractament antiplaquetari amb aspirina i tienopiridines. El risc hemorràgic i trombòtic de la triple combinació d’anticoagulació, aspirina i tienopiridina roman desconeguda. En aquesta tesi estudiem aquest problema en pacients sotmesos a intervencionisme coronari i mostrem que es presenta en un de cada vuit pacients. En el seguiment, els pacients als que se’ls prescriu la triple combinació antitrombòtica presenten una incidència significativament menor d’esdeveniments trombòtics que els que no la van rebre, amb una major incidència d’hemorràgies no greus com a contrapartida., Atrial fibrilliation is the most common cardiac arrhythmia, with a high morbidity, mortality and economic burden. An aging population in the upcoming years will likely increase its incidence and intensificate its epidemiological importante. This doctoral thesis approaches the pathology and therapy of atrial fibrillation through clinical and experimental studies. Very high intensity exercise is an emerging cause of atrial fibrillation in young and middle-aged individuals. However, its pathophysiology is unknown, yet. Here, a rat model of endurance, very high intensity exercise is used to study its mechanisms. By mean of in vivo and in vitro techniques, vagal enhancement is shown to be key factor in the development of exercise-induced atrial fibrillation. Moreover, exercise-induced arrhythmogenic atrial substrate is reversible, particularly concerning vagal enhancement. In contrast, structural remodeling (atrial fibrosis and dilatation) slowly or uncompletely reversed. MicroRNAs are recently discovered short RNA sequences that regulate post-transcriptional gene expression. MicroRNAs are involved in a large number of physiological and pathological processes, including fibrosis development. However, it is unknown whehter they participate in atrial fibrillation substrate. In this thesis, miR-21 involvement in post-left ventricle myocardial infarction atrial remodeling is explored. A left ventricle myocardial infarction rat model with a high burden of atrial fibrillation inducibility is used. We show that miR-21 is involved in atrial fibrosis pathology, and its inhibition may prevent its development and atrial fibrillation inducibility. Mir-21 is postulated as a potential therapeutic target in the treatment of atrial fibrillation. Anticoagulant therapy is on the basis of thrombo-embolic risk prevention in atrial fibrillation patients. Occasionally, patients diagnosed with atrial fibrillation are also diagnosed of ischemic cardiomyopathy and require antiplatelet therapy with aspirin and tienopiridines. The hemorrhagic risk of triple thrombotic combination of anticoagulation, aspirin and thienopiridines is unknown. In this thesis we study this problem in patients undergoing coronary intervention and show that this occurs in one out of eight patients in the cath lab. At follow-up patients who were prescribed triple combination antithrombotic had a significantly lower incidence of thrombotic events than those who did not receive it. A higher risk of non-serious bleeding balanced its benefits.