Search

L´apoptosi, o mort cel.lular programada, és un procés actiu que mobilitza els recursos cel.lulars amb l´objectiu de mantenir l´homeostasi de l´organisme a expenses del suïcidi de cèl.lules individuals. Diferents estudis han mostrat un increment de l´activiat d´algunes cdk, especialment Cdk1 i Cdk2, en correlació amb la progressió dels primers estadis apoptòtics. En el nostre laboratori l´estudi de l´apoptosi en timòcits, els quals no tenen una activitat cdk significativa degut a l´aturada del cicle cel.lular en G1, demostren que la inducció de l´activitat de Cdk2 després del tractament amb radiació gamma o amb glucocorticoides és necessària per l´inici de l´apoptosi. Mentre cap de les ciclines conegudes sembla ser la proteïna activadora de Cdk2 en apoptosi, en el nostre laboratori hem identificat un nou membre de la família de les ciclines, denominada Ciclina O, capaç d´activar aquesta kinasa in vivo en línies cel.lulars. L´expressió d´aquesta nova ciclina en el timus, i altres teixits, s´indueix ràpidament després del tractament amb radiació gamma i coincideix amb l´aparició de l´apoptosi. Aquests resultats posicionen la Ciclina O com a millor candidat a ser l´activador de Cdk2 necessari per induïr la mort cel.lular programada en el timus, i probablement també en altres òrgans., The apoptosis, also called programmed cell death, is an active process able to use the cellular mechanisms to kill individual cells in order to keep the functional homeostasis of the whole organism. Different studies had shown a correlation between the first apoptotic events and the induction of some cdk proteins, particularly Cdk1 and Cdk2. The studies of thymocytes in our laboratory, wich lacks the most amount of cdk activity related to the cell cycle because of its arrest in G1, had shown that the induction of Cdk2 activity after the treatment with gamma radiation or glucocorticoids is a necessary step for the apoptosis induction. While any of the cyclins described at the moment seems to be the Cdk2 activator for apoptosis a new member of the cyclin family able to activate the kinase Cdk2 in vivo in cell lines has been identified in our laboratory. The expresion of this cyclin, known as Cyclin O, is quickly induced in the thymus after the treatment with gamma radiation and correlates with the induction of apoptosis. These results position Cyclin O as the best candidate to activate Cdk2 and inuce the programmed cell death in the thymus, and probably other tissues.

La via canònica de Wnt és essencial pel desenvolupament embrionari i per la proliferació cel·lular. A més, la desregulació d’aquesta via causa diferents malalties, com per exemple el càncer. La unió del lligand Wnt als receptors específics promou la fosforilació de Dvl-2 per una quinasa directament associada a p120-catenina, la CK1ε, i indueix una cascada d’activació que inhibeix l’activitat de la quinasa GSK-3 sobre la β-catenina. Com a resultat, la β-catenina s’estabilitza i es transloca al nucli on activa l’expressió de gens diana. Els nostres resultats expliquen com la CK1ε és activada ràpidament en Wnt i permet els diferents esdeveniments que acumulen la β-catenina. Prèviament s’havia descrit que la CK1ε presenta un domini autoregulador que inhibeix l’activitat quinasa de la CK1ε quan aquest està fosforilat, suggerint que es necessita una fosfatasa encara no descrita perquè s’activi la senyalització de Wnt. En aquest treball es mostra que la PP2A permet la defosforilació de la CK1ε en Wnt, i també s’ha identificat la PR61ε com la subunitat reguladora de la PP2A que controla l’activació de CK1ε. A més, la PR61ε interacciona directament amb el receptor Fz i s’associa al complex LRP5/6-p120-catenina-CK1ε després de l’activació de Wnt. En global, aquests resultats suggereixen que la PR61ε regula específicament la defosforilació de la CK1ε mediada per la PP2A, i té un paper essencial en la senyalització de Wnt. Un altre pas determinant de l’activació de la via de Wnt és la inhibició de l’activitat de la GSK-3, tot i que el mecanisme pel qual s’inactiva la quinasa encara és matèria de debat. S’han proposat dos models per explicar-ho, un dependent del reclutament de la GSK-3 al correceptor LRP5/6 fosforilat, que crea un lloc d’inhibició, i l’altre basat en el segrest de la quinasa dins de cossos multivesiculars (MVBs). Degut a que el nostre grup ha descobert una connexió directa entre les cadherines i la p120-catenina (dues proteïnes involucrades en les unions adherents) amb el correceptor LRP5/6, es va hipotetitzar que les cadherines podrien estar involucrades en l’endocitosi de la GSK-3 dependent dels factors Wnt. Els nostres resultats demostren que el complex receptor de Wnt que conté la GSK-3, s’internalitza dins de MVBs, i que aquesta endocitosi depèn de la dissociació prèvia de la p120-catenina-cadherina del correceptor LRP5/6. La disrupció de la interacció cadherina-LRP5/6 és regulada per la fosforilació de la cadherina i requereix de la separació prèvia de la p120-catenina. D’aquesta manera, mutants de la p120-catenina i de la cadherina que no es dissocien del complex bloquegen el segrest de la GSK-3 dins de MVBs. Aquests mutants inhibeixen l’acumulació de β-catenina, tot i que no de forma total. Aquests resultats expliquen com es segresta la GSK-3 dins dels MVBs i suggereixen que aquest mecanisme d’internalització, juntament amb la inhibició de la GSK-3 per la interacció directa amb l’LRP5/6 fosforilat, són necessaris per la completa estabilització de la β-catenina en Wnt., Canonical Wnt signalling is essential for embryonic development and cell proliferation. Deregulation of this pathway leads to some diseases, such as cancer. Binding of extracellular Wnt ligands to specific receptors induces the phosphorylation of Dvl-2 protein by CK1ε- associated-p120-catenin kinase, and a cascade of events that inhibit the activity of GSK3 kinase on β-catenin. As a result, β-catenin is stabilized and translocated to the nucleus where it activates the expression of target genes. Our results explain how CK1ε is quickly activated in Wnt signalling, allowing the cascade of events that accumulate β-catenin. It was previously described that CK1ε presents an autoregulation domain which strongly inhibits CK1ε kinase activity when it is phosphorylated, suggesting that a phosphatase is required to activate Wnt signalling. However, which phosphatase dephosphorylates CK1ε in Wnt and how this phosphatase regulates the pathway were not clear. In this study, we have described that PP2A permits the dephosphorylation of CK1ε upon Wnt, and we have also identified PR61ε as the regulatory subunit of PP2A that controls this CK1ε activation. PR61ε directly interacts with Fz receptor, and associates with LRP5/6-p120-catenin-CK1ε complex upon Wnt activation. Taken together, these results suggest that PR61ε specifically regulates PP2A-mediated CK1ε dephosphorylation and plays an essential role in Wnt signaling. Another key step in the pathway is the local inhibition of GSK3 activity on β-catenin, although the mechanism of this inactivation remains unclear. Two models have been proposed, one dependent on the recruitment and subsequent block of GSK3 by phosphorylated LRP5/6 coreceptor that creates an inhibitory site, and another one based on its sequestration into multivesicular bodies (MVBs). Since our group has uncovered a physical link between cadherins and p120-catenin (two proteins involved in adherens junctions) with the Wnt coreceptor LRP5/6, we wonder whether cadherins may be involved in the endocytosis of GSK3 triggered by Wnt factors. Our results demonstrate that Wnt receptor complexes containing GSK3 are internalized into multivesicular bodies and this endocytosis depends on the previous dissociation of p120-catenin and cadherin from LRP5/6 coreceptor. Thus, disruption of cadherin-LRP5/6 interaction is regulated by cadherin phosphorylation and requires the previous release of p120-catenin. Accordingly, p120-catenin and cadherin mutants unable to dissociate from the complex block GSK3 sequestration into MVBs. These mutants substantially inhibit, but do not completely prevent, the β-catenin accumulation caused by Wnt. These results elucidate how GSK3 is sequestered into MVBs and suggest that this mechanism of internalization together with the inhibition of GSK3 by direct interaction with phosphorylated LRP5/6, are both required for complete β-catenin stabilization upon Wnt stimulation.

La proteïna CK2 és una serina/treonina quinasa present en tots els organismes eucariotes i que actua sobre una àmplia varietat de substrats cel·lulars, implicats en una àmplia gamma de funcions diferents, moltes de les quals són essencials per la cèl·lula. De fet, CK2 ha estat considerada com una proteïna quinasa essencial per la viabilitat de les cèl·lules eucariotes. Les alteracions de CK2 en una àmplia varietat de tumors malignes s’han confirmat en diversos estudis, mostrant-se una activitat quinasa i nivells de subunitats catalítiques incrementades en diferents tipus de tumors humans. Curiosament el paper de CK2 en el carcinoma renal de cèl·lules clares (ccRCC) –un càncer altament agressiu i que constitueix la major part de càncers renals humans- ha estat poc estudiada, malgrat el fet que un informe preliminar indicava que en aquest tipus de tumor la subunitat reguladora CK2β augmentava fins i tot en quantitats superiors que la subunitat catalítica CK2α. L’objectiu d’aquest treball ha estat profunditzar en el coneixement de la situació de CK2 en el ccRCC i estudiar com alteracions i desregulacions entre les seves subunitats poden afectar a la progressió del ccRCC. Amb aquesta finalitat s’han usat d’extractes de teixits i Tissue MicroArrays (TMAs) de biòpsies de pacients amb ccRCC i amb línies renals humanes derivades de túbul proximal silenciades de forma estable per les subunitats reguladores CK2β o les catalítiques CK2α de CK2, les quals han estat usades com a model ex vivo per l’estudi de la patologia. Els resultats obtinguts en aquest treball indiquen que en el ccRCC, no només apareixen alteracions en l’expressió dels nivells de CK2β (donant lloc a relacions CK2α/CK2β diferents en funció del grau i estadiatge tumoral) sinó que hi ha també canvis significatius en les localitzacions d’aquestes subunitats en les etapes més primerencs del tumor. D’altra banda, la disminució de l’expressió mitjançant el silenciament estable de les subunitats reguladores o catalítiques en línies renals humanes, fa que les línies adquireixin un fenotip EMT parcial, presentant característiques pròpies de cèl·lules mesenquimàtiques tals com la pèrdua del marcador epitelial E-cadherina, així com canvis en la morfologia i capacitat de creixement independent d’ancoratge. El fet que alteracions en les relacions de les subunitats de CK2 donin lloc a aquestes propietats mesenquimàtiques, acompanyades per canvis en les seves propietats migratòries i proliferatives, suggereix que alteracions en les relacions entre les subunitats durant el procés neoplàsic participarien en les diferents etapes de la progressió tumoral., Protein kinase CK2 is a serine /threonine kinase present in all eukaryotes which acts on a wide variety of cellular substrates involved in a wide range of different functions, many of which are essential for the cell. In fact, CK2 has been considered as a protein kinase essential for the viability of eukaryotic cells. The alterations of CK2 in a wide variety of malignancies have been confirmed in different studies, showing increased kinase activity and catalytic subunit levels in different types of human tumours. Interestingly, the involvement of CK2 in clear cell Renal Cell Carcinoma (ccRCC) -a highly aggressive cancer that constitutes most of the human renal cancers- has been little studied despite the fact that a preliminary report indicated that in this type of tumour the regulatory CK2β subunit increased even in higher amounts than the catalytic CK2α subunit. The aim of this work was to deepen in the knowledge of the status of CK2 in ccRCC tumours and to study how alterations and deregulations between its subunits can affect ccRCC progression. To this purpose we have made use of tissue extracts and Tissue MicroArrays (TMAs) from biopsies of ccRCC human tumours and human renal proximal tubular cell lines stably silenced either for the regulatory CK2β or the catalytic CK2α subunits of CK2, which have been used as an ex vivo model for the study of this pathology. The results obtained in this study indicate that in ccRCC, CK2 shows not only alterations in the CK2β expression levels (resulting in different CK2α/CK2β ratios depending on tumour grading and staging) but there are also significant changes in the localizations of these subunits in the early stages of this tumour. Moreover, the decrease in expression through the stable silencing of the catalytic or regulatory subunits of CK2 in human renal cell lines, provokes the acquisition of a partial-EMT phenotype, showing mesenchymal cell properties such as the loss of epithelial marker E-cadherin, as well as changes in their morphology and anchorage independent growth capacity. The fact that changes in CK2 subunits ratios give rise to those mesenchymal properties, accompanied by changes in their proliferative and migratory properties, suggest that alterations in the ratios between these subunits during the neoplasic process participates at different stages of tumour progression.

EN CATALÀ :Les proteïnes morfogenètiques òssies (BMPs) són membres de la superfamília del TGF-beta i s'ha demostrat que participen en la determinació i especificació de varis teixits i òrgans durant el desenvolupament dels vertebrats i que regulen la proliferació, l'apoptosi i la diferenciació de múltiples tipus cel·lulars. Les BMPs van ser originàriament identificades per a la seva habilitat d'induir la formació ectòpica d'os i entre ells, BMP-2, -4 and -7 resulten essencials perquè tingui lloc un adequat desenvolupament ossi. Les BMPs també s'ha descrit que participen en el control de la migració cel·lular durant la morfogènesis embrionària. Malgrat s'han publicat alguns treballs en relació a la participació de BMPs en la regulació de la migració de progenitors mesenquimals i osteoblasts, els mecanismes moleculars mitjançant els quals les BMPs regulen aquests processos són poc coneguts. Tenint en compte aquests precedents, ens varem proposar estudiar la participació de BMP-2 en la regulació de la migració de les cèl·lules mioblàstiques C2C12. Els resultats presentats en aquest treball demostren que BMP-2 indueix la migració cel·lular quimiotàctica en cèl·lules C2C12. Les evidències experimentals que ens permeten arribar a aquesta conclusió són: i) l'anàlisi de la migració cel·lular mitjançant l'assaig de ferida indica que en presència de BMP-2 la ferida és repoblada més eficientment i que aquest efecte és independent de la síntesis proteica de novo i de la proliferació cel·lular; ii) els resultats obtinguts en l'aproximació experimental basada en l'ús de la Càmera de Boyden mostren que la migració induïda per BMP-2 té caràcter quimiotàctic a favor de gradient de concentració. Tenint en compte que la resposta inicial de la cèl·lula a un agent quimiotàctic consisteix en la polarització i extensió de protrusions en la direcció de la migració, es va analitzar posteriorment l'efecte de BMP-2 en la organització del citoesquelet d'actina. El resultats mostraven que BMP-2 induïa la formació d'acumulacions d'actina cortical, i que es tractava d'un efecte ràpid, transitori i que tenia lloc en diferents tipus cel·lulars, independentment de la distribució basal dels seus filaments d'actina. En relació a l'estudi dels mecanismes moleculars implicats en els efectes de BMP-2 en la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular, els resultats obtinguts demostren que BMP-2 regula aquests efectes a través de l'activació de vies de senyalització que involucren Cdc42, PI3K i p38MAPK, que estan implicades en la regulació de proteïnes que tenen un impacte directe sobre la polimerització d'actina. Concretament, BMP-2 indueix l'activació de Cdc42 i la isoforma α de PI3K de manera paral·lela i independent, i ambdues rutes estan implicades en la regulació de l'activitat de varis membres de la família de proteïnes PAK, que alhora regulen la LIMK1, proteïna implicada en el control de la polimerització dels filaments d'actina a través de la fosforilació de la cofilina. Per altra banda, l'activitat de la MAPK p38α també resulta imprescindible en la regulació de la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular dependent de BMP-2, a través d'una via de senyalització que involucra la quinasa MK2 i hsp27, proteïna que té la capacitat de regular directament la polimerització dels filaments d'actina. En conjunt, les dades presentades suggereixen noves vies de senyalització activades en resposta BMP-2 que relacionen els receptors de membrana amb la dinàmica del citoesquelet d'actina i la migració cel·lular., The main focus of the research is to study in depth the effects of Bone Morphogenetic Protein 2 (BMP-2) in the actin cytoskeleton reorganization and cell migration, as well as the study of the signalling pathways implicated in these effects.BMPs have been shown to participate in the patterning and specification of several tissues and organs during vertebrate development and to regulate cell growth, apoptosis and differentiation in different cell types. We have reported that exposure of C2C12 cells to BMP-2 leads to an increase in cell migration and a rapid rearrangement of the actin filaments into cortical protrusions. These effects required independent and parallel activation of the Cdc42 small GTPase, the α-isoform of the PI3K and the p38α MAPK. Furthermore, we demonstrate that BMP-2 activates different group I and II PAK isoforms as well as LIMK1, and that these activations measured by either kinase activity or with antibodies against phosphorylations at their activation loops, were abolished by blocking PI3K and Cdc42 signalling pathways. Moreover, we have described that BMP-2 induces MK2 and hsp27 activation in a p38-dependent manner and that both proteins are implicated in the effects of BMP-2 on cell migration. Altogether, these findings suggest that Cdc42, PI3K and p38 signals emanated from BMP receptors are involved into specific regulation of actin assembly and cell migration. We are at the moment studying the possible relationship between Cdc42/PI3K-PAK-LIMK1 and p38-MK2-hsp27 pathways. Preliminary results suggest that these pathways are independent; however we are still working on it.

La insulina estimula la captació de MeAIB, àcid alfa-(metil)aminoisobutíric, en el múscul esquelètic. Aquest compost és un anàleg aminoacídic no metabolitzable que és transportat, juntament amb un ió Na+, pel sistema A de transport d'aminoàcids.La insulina estimula la captació a través del sistema A de manera ràpida (max. als 60 min) i independent de síntesi protèica. Des d'un punt de vista cinètic, la insulina provoca una estimulació en la Vmax del transport, sense alterar la Km, per la qual cosa es pot pensar que o bé la insulina provoca un augment en el nombre de transportadors en la membrana plasmàtica, o bé la insulina activa la velocitat de transport intrínseca a cada transportador. En aquesta acció de la insulina no participen microtúbuls ni microfilaments a nivell del múscul esquelètic. La insulina també activa la captació de MeAIB al fetge, però en aquest teixit l'efecte és dependent de síntesi protèica i hi participen els microtúbuls.El sistema A pot activar-se per un dejuni aminoacídic, fenomen que rep el nom de "regulació adaptativa". La regulació adaptativa activa el sistema A de manera dependent de síntesi protèica, i en aquest cas també hi participen els microtúbuls.La insulina no activa el sistema A a través de la producció d'alteracions en el gradient electroquímic de Na(+).En l'estudi dels mecanismes transductors de l'acció de la insulina sobre el sistema A observem que aquesta acció requereix d'una adequada activitat tirosina quinasa del receptor de la insulina. En la transducció del senyal no semblen participar les proteïnes G sensibles a toxina colèrica o a toxina pertúsica, ni tampoc la proteïna quinasa C. La fosfolipasa C administrada exògenament, mimetitza parcialment l'acció de la insulina sobre el sistema A; els productes de la reacció catalitzada per aquest enzim són els diacilgliceroIs, els quals podrien tenir algun paper en el mecanisme de transducció de la insulina, en ]a seva acció sobre el sistema A.Respecte als mecanismes que regulen negativament l'acció de la insulina sobre el sistema A, hem observat que la proteïna quinasa C inhibeix parcialment la captació de MeAlB estimulada per la insulina; el nivell al que interactua la proteïna quinasa C és posterior al receptor de la insulina, ja que aquest no resulta afectat, ni en activitat de "binding", ni en activitat tirosina quinasa, per coneguts activadors de la proteïna quinasa C, els esters de forbol.La fosfolipasa C també provoca una inhibició de l'acció de la insulina sobre el sistema A. Donat que els diacilglicerols activen la proteïna quinasa C, pot especular-se que indirectament la fosfolipasa e també inhibeix l'acció de la insulina a través d'una estimulació de la proteïna quinasa C.Comparativament hem realitzat estudis de l'acció de la insulina sobre la captació d'anàlegs no metabolitzables de la glucosa, la 3-O-metilglucosa, en el múscul esquelètic. Així, mentre que Ja proteïna quinasa C podria participar en la transducció d'aquesta acció de la insulina, l'activació d'aquest enzim pels esters de forbol no provoca alteracions en la captació de glucosa estimulada per la insulina. La fosfolipasa C reprodueix igualment aquesta situació, marcant les diferències respecte al que succeeix amb el transport d'aminoàcids. Malgrat aquestes diferencies, la transducció de l'acció de la insulina sobre el transport de glucosa tampoc requereix de proteïnes G sensibles a toxina pertúsica o a toxina colèrica mentre sí que requereix d'una adequada funcionalitat del receptor de la insulina.Agents que activen la producció intracel.lular de cAMP no alteren l'acció de la insulina sobre la captació de MeaIB o de 3-O-metilglucosa, la qual cosa és índex d'una no participació de la proteïna quinasa A en la regulació negativa de l'acció de la insulina., Insulin stimulates amino acid uptake through the system A in skeletal muscle. This stimulation is maximal at 60 min or insulin addition, and is independent of protein synthesis and microtubules or microfilaments activity. Insulin action on system A in muscle is characterized by an increased Vmax without changes in Km. In this regard, the effect of insulin on muscle broadly differs from the stimulatory action on system A in liver which is dependent on protein synthesis and on microtubular function.System A co-transports amino acids and Na(+) ions. Insulin does not stimulate system A through changes in electrochemical gradient of Na(+).This action of insulin requires an adequate tyrosine kinase activity of the insulin receptor. In the transduction of the insulin action, there are not G proteins sensitive to pertussis toxin or cholera toxin. Protein kinase C is not involved in the biochemical pathway that lead to activation of system A in skeletal muscle.It has been previously reported that some of insulin effects can be negatively regulated by activation of protein kinases such as protein kinase C or cAMP-dependent protein kinase. In this regard, we have found that activation of protein kinase C with TPA or by addition or PL-C inhibits insulin action of system A. However cAMP-inducing agents such isoproterenol, a beta-adrenergic agonist, cholera toxin -which activates Gs- or forskolin -which stimulates adenilate ciclase-, did not modify insulin action on system A in skeletal muscle.Thus protein kinase A does not seem to play a role in the regulation of insulin effect on amino acid uptake in muscle.