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OBJECTIVE: To compare three methods: Biochemical tests, high-performance liquid chromatography (HPLC) and polymerase chain reaction-restriction fragments length polymorphism (PCR-RFLP), for the identification of mycobacteria, and to perform a cost-benefit analysis to define an optimum identification algorithm. MATERIAL AND METHODS: One-hundred-and-seven mycobacteria isolates were identified by the three methods at Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos, between February of 1999 and January of 2000 and the results were compared with those of a reference laboratory using the Q-Cochran statistical test. RESULTS: PCR-RFLP was the most rapid and specific procedure but also the most expensive; biochemical tests excelled for identification of Mycobacterium tuberculosis, but were lengthy and expensive for other mycobacteria; HPLC ranked in the middle for price, speed and specificity. CONCLUSIONS: Considering the expected proportion of M. tuberculosis, the following algorithm was proposed: Initially, biochemical tests should be performed; if the results indicate a non-tuberculous mycobacteria, the isolate should be analyzed with HPLC; if results are unclear, the isolate should be analyzed using PCR-RFLP. Isolates showing a previously undescribed PCR-RFLP pattern should be characterized by DNA sequencing.OBJETIVO: Comparar tres métodos: pruebas bioquímicas, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por sus siglas en inglés) y reacción en cadena de la polimerasa-polimorfismo del tamaño de fragmentos de restricción (PCR-RFLP) para identificar micobacterias a nivel especie, analizando costo-beneficio y proponiendo un algoritmo de identificación. MATERIAL Y MÉTODOS: Entre febrero de 1999 y enero de 2000, en los laboratorios del Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos se tipificaron 107 aislados de micobacterias y los resultados se compararon con los obtenidos en un laboratorio de referencia utilizando la prueba estadística Q de Cochran. RESULTADOS: Se encontró que el PCR-RFLP fue el método más específico y rápido pero también el más caro. Las pruebas bioquímicas fueron confiables para la identificación de Mycobacterium tuberculosis, pero lentas e inespecíficas para otras micobacterias. El HPLC estuvo en un nivel medio tomando en cuenta costo, tiempo y especificidad. CONCLUSIONES: Considerando la proporción esperada de M. tuberculosis, se propone el siguiente algoritmo: si las pruebas bioquímicas indican una micobacteria no tuberculosa, el aislado será analizado por HPLC; si la identificación no es clara, el aislado será analizado usando PCR-RFLP. Si el aislado no pertenece a un patrón descrito, se identificará por secuenciación de ADN.