Search

The structural complexity of bacterial life makes most of it impossible to culture. Functional metagenomics approaches overcome the limitations of a culture-based approach in exploring and assessing the genetic materials of uncultured microbes. The objective of this study was to identify clones with cold-active proteases through functional metagenomics. In this work, the environmental DNA (eDNA) isolated directly from Antarctic soils was ligated into the pCC1FOS fosmid vector, transformed into EPI300-T1R E. coli host cells, and screened for proteolytic enzymes. Positive protease-producing clones were identified and isolated on skim milk agar supplemented with chloramphenicol and arabinose. This clone harbored a fosmid, pCC1FOS, which has a 48.5 kb insert that has been completely sequenced in both directions. Further analysis of the insert showed 70 NODEs. The NODE_42 encoded hypothetical protein of 297 amino acids showed a significant match to Peptidase M23 and PG-binding 1 proteins families. A three-dimensional model of the predicted protease was generated based on the known mesophilic protease of Neisseria meningitides (PDB: 3SLU). The structural alignment showed 27.07 % similarity with RMSD value of 0.402 Å based on 58 aligned residues. The active site residues were identical, but major deletions were observed in the predicted proteases. This predicted protease showed higher activity at -20 °C and 20 °C than the positive control (protease from bovine pancreas). Functional metagenomics is a promising approach in the discovery of cold-active protease with low homology to the known sequences and expressed in the host cell that has the potential for bioprospecting in low-temperature applications. ABSTRAK: Kesukaran struktur kehidupan bakteria menyebabkan kebanyakan bakteria sukar dikultur. Saringan fungsi metagenomik dapat mengatasi kekangan saringan berasaskan kultur dalam meneroka dan menilai bahan genetik mikrob tidak kultur. Objektif kajian ini adalah bagi mengenal pasti klon protease aktif sejuk melalui saringan fungsi metagenomik. Kajian ini mencadangkan DNA alam sekitar (eDNA) yang diasingkan secara langsung dari tanah Antartika, dan dimasukkan ke dalam vektor fosmid pCC1FOS, ditransformasikan ke dalam sel hos EPI300-T1R E. coli, dan disaring untuk enzim proteolitik. Klon yang menghasilkan protease ini dikenal pasti dan diasingkan daripada agar susu skim. Agar telah ditambah dengan kloramfenikol dan arabinosa. Klon ini mengandungi fosmid pCC1FOS, di mana sisipan sebesar 48.5 kb telah disusun berturut-turut sepenuhnya dari kedua-dua arah. Analisis lanjut pada sisipan ini menunjukkan terdapat 70 NODE. NODE_42 mengandungi 297 asid amino protein hipotetis, iaitu sangat serasi dengan protein Peptidase M23 dan PG-binding 1. Model tiga dimensi protease yang diramalkan ini dihasilkan berdasarkan protease mesofilik Neisseria meningitides (PDB: 3SLU). Susunan struktur menunjukkan 27.07% persamaan nilai RMSD sebanyak 0.402 Å berdasarkan 58 sisa sejajar. Sisa tapak aktif kedua-duanya adalah sama, tetapi terdapat pemotongan besar telah berlaku dalam protease ramalan. Protease ini menunjukkan aktiviti enzim lebih tinggi pada suhu -20 °C dan 20 °C berbanding kawalan positif (protease dari pankreas lembu). Saringan fungsi metagenomik berhasil menemukan protease aktif sejuk berhomologi rendah terhadap susunan yang diketahui dan diekspresi dalam sel hos. Ia berpotensi bagi bioprospeksi dalam aplikasi bersuhu rendah.

The growth conditions of bacteria producing cold-active protease isolated from an Antarctic sample were screened using one-factor-at-time (OFAT). Then, crude protease of the strain was extracted during the late logarithmic phase for enzymatic assay. A strain that showed the highest enzyme activity was selected for optimization via response surface method (RSM). The parameters studied were incubation temperature (4 – 36 °C), pH media (4 – 10) and NaCl concentration (0 – 8%). Based on the OFAT results, all eight strains showed the highest growth rate at 20 °C, pH 7 and 4% (w/v) NaCl. The assay showed that the crude enzyme extracted from strain SC8 exhibited significantly higher activity (0.20 U and 0.37 U) than the positive control (0.11 U and 0.31 U) at -20 °C and 20 °C. RSM suggested that the optimized setting for growth of SC8 were at 20.5 °C, pH 6.83 and 2.05% (w/v) of NaCl with the results of the bacterial growth rate value was 3.70 ± 0.06 x 106 cells/hr. Optimal growth conditions of SC8 from this study are useful for the large-scale production of cold-active protease in future. ABSTRAK: Keadaan pertumbuhan bakteria yang menghasilkan enzim protease aktif sejuk daripada sampel Antartika disaring menggunakan satu faktor pada masa (OFAT). Kemudian, enzim protease ini diekstrak pada lewat fasa logaritma untuk ujian enzimatik. Strain yang menunjukkan aktiviti enzim tertinggi telah dipilih untuk tujuan pengoptimuman melalui kaedah permukaan tindak balas (RSM). Parameter yang dikaji ialah suhu pengeraman (4 – 36 °C), pH media (4 – 10) dan kepekatan NaCl (0 – 8%). Berdasarkan OFAT, kesemua lapan bakteria menunjukkan kadar pertumbuhan tertinggi pada 20 °C, pH 7 dan 4% NaCl. Hasil ujian enzimatik menunjukkan bahawa enzim protease yang diekstrak daripada SC8 mempamerkan aktiviti yang jauh lebih tinggi (0.20 U dan 0.37 U) daripada kawalan positif (0.11 U dan 0.31 U) pada -20 °C dan 20 °C. RSM mencadangkan tetapan optimum untuk pertumbuhan SC8 adalah pada 20.5 °C, pH 6.83 dan 2.05% NaCl dengan keputusan kadar pertumbuhan bakteria ialah 3.70 ± 0.06 x 106 sel/jam. Keadaan pertumbuhan optimum SC8 daripada kajian ini bermanfaat untuk menghasilkan produk protease aktif sejuk secara besar-besaran pada masa hadapan. The growth conditions of bacteria producing cold-active protease isolated from an Antarctic sample were screened using one-factor-at-time (OFAT). Then, crude protease of the strain was extracted during the late logarithmic phase for enzymatic assay. A strain that showed the highest enzyme activity was selected for optimization via response surface method (RSM). The parameters studied were incubation temperature (4 – 36 °C), pH media (4 – 10) and NaCl concentration (0 – 8%). Based on the OFAT results, all eight strains showed the highest growth rate at 20 °C, pH 7 and 4% (w/v) NaCl. The assay showed that the crude enzyme extracted from strain SC8 exhibited significantly higher activity (0.20 U and 0.37 U) than the positive control (0.11 U and 0.31 U) at -20 °C and 20 °C. RSM suggested that the optimized setting for growth of SC8 were at 20.5 °C, pH 6.83 and 2.05% (w/v) of NaCl with the results of the bacterial growth rate value was 3.70 ± 0.06 x 106 cells/hr. Optimal growth conditions of SC8 from this study are useful for the large-scale production of cold-active protease in future. ABSTRAK: Keadaan pertumbuhan bakteria yang menghasilkan enzim protease aktif sejuk daripada sampel Antartika disaring menggunakan satu faktor pada masa (OFAT). Kemudian, enzim protease ini diekstrak pada lewat fasa logaritma untuk ujian enzimatik. Strain yang menunjukkan aktiviti enzim tertinggi telah dipilih untuk tujuan pengoptimuman melalui kaedah permukaan tindak balas (RSM). Parameter yang dikaji ialah suhu pengeraman (4 – 36 °C), pH media (4 – 10) dan kepekatan NaCl (0 – 8%). Berdasarkan OFAT, kesemua lapan bakteria menunjukkan kadar pertumbuhan tertinggi pada 20 °C, pH 7 dan 4% NaCl. Hasil ujian enzimatik menunjukkan bahawa enzim protease yang diekstrak daripada SC8 mempamerkan aktiviti yang jauh lebih tinggi (0.20 U dan 0.37 U) daripada kawalan positif (0.11 U dan 0.31 U) pada -20 °C dan 20 °C. RSM mencadangkan tetapan optimum untuk pertumbuhan SC8 adalah pada 20.5 °C, pH 6.83 dan 2.05% NaCl dengan keputusan kadar pertumbuhan bakteria ialah 3.70 ± 0.06 x 106 sel/jam. Keadaan pertumbuhan optimum SC8 daripada kajian ini bermanfaat untuk menghasilkan produk protease aktif sejuk secara besar-besaran pada masa hadapan.

ABSTRACT: The ability of microalgae to utilize CO2 during photosynthesis and grow rapidly shows their potential in CO2 bio-fixation to capture and store the gas. However, CO2 capture by this biological approach is very slow compared to chemical reaction-based processes such as absorption using amine or aqueous ammonia. Integration between chemical (aqueous ammonia) and biological (microalgae) aspects might enhance the capturing process and at the same time the microalgae can assimilate CO2 for beneficial bioproduct formation. Thus, it is important to assess the growth of the microalgae in various concentrations of ammonia with CO2 supply. Hence, the main objective of this study is to investigate Chlorella vulgaris growth and its kinetics in aqueous ammonia. To achieve that, C. vulgaris was cultivated in various concentrations of aqueous ammonia between 0 to 1920 mg/L at room temperature (i.e. 27 °C) and supplied with 15% (v/v) of CO2 under illumination of 3500 lux of white fluorescent light. Result shows that the maximum growth capacity (Xmax) of C. vulgaris is deteriorating from 1.820 Au to 0.245 Au as the concentration of aqueous ammonia increased. However, no significant change in maximum specific growth rate (µmax) was observed. The growth data was then fitted into the logistic growth model. The model coefficient of determination (R2) is decreasing, which suggests modification of the model is required. ABSTRAK: Keupayaan alga-mikro untuk menggunakan CO2 semasa proses fotosintesis dan pembiakannya yang pesat menunjukkan potensi dalam penggunaan dan penyimpanan gas ketetapan-biologi. Walau bagaimanapun, penggunaan CO2 melalui cara ini adalah sangat perlahan berbanding proses tindak balas kimia melalui penyerapan amina ataupun cecair ammonia. Percampuran antara tindak balas kimia (cecair ammonia) dan tindak balas biologi, memungkinkan penambahan proses percampuran dan pada masa sama alga-mikro akan menyerap CO2 bagi kepentingan pembentukan hasil biologi. Dengan itu, adalah sangat penting untuk mengawasi pertumbuhan alga-mikro dalam pelbagai ketumpatan ammonia bersama kandungan CO2. Oleh itu, objektif utama penyelidikan ini adalah untuk menyiasat pertumbuhan Chlorella vulgaris dan proses kinetik dalam cecair ammonia. Bagi memperoleh hasil tersebut, C. vulgaris telah dikulturkan pada ketumpatan cecair berbeza antara 0 ke 1920 mg/L pada suhu bilik (iaitu 27 °C) dan dibekalkan dengan 15% (v/v) CO2 di bawah cahaya putih flurosen 3500 lux. Keputusan menunjukkan kapasiti pertumbuhan terbanyak (Xmax) C. vulgaris telah berkurang daripada 1.820 Au kepada 0.245 Au apabila ketumpatan cecair ammonia dikurangkan. Walau bagaimanapun, tiada perubahan ketara pada kadar pertumbuhan (µmax) dapat dilihat. Data kadar pertumbuhan kemudiannya dikemas kini pada model pertumbuhan logistik. Model pekali penentu (R2) telah direndahkan di mana cadangan untuk mengubah model adalah diperlukan.

A zinc-laccase biofuel cell adapting the zinc-air cell design features is investigated. A simple cell design configuration is employed: a membraneless single chamber and a freely suspended laccase in a quasi-neutral buffer electrolyte. The cell is characterised according to its open-circuit voltage, polarization profile, power density plot and discharge capacity at constant current. The biocatalytic role of laccase is evident from the polarization profile and power output plot. Performance comparison between a single chamber and dual chamber cell design is also presented. The biofuel cell possessed an open-circuit voltage of 1.2 V and delivered a maximum power density of 0.9 mW/cm2 at current density of 2.5 mA/cm2. These characteristics are comparable to biofuel cell utilising a much more complex system design. KEY WORDS (keyword)): Biofuel cell, Bioelectrochemical cell, Zinc anode, Laccase and Oxidoreductase. ABSTRAK: Sel bio-bahan api zink-laccase dengan adaptasi daripada ciri-ciri rekabentuk sel zink-udara telah dikaji. Sel dengan konfigurasi rekabentuk yang mudah digunapakai: ruangan tunggal tanpa membran dan laccase diampaikan secara bebas di dalam elektrolit pemampan quasi-neutral. Sel dicirikan berdasarkan voltan litar terbuka, profil polarisasi, plot ketumpatan kuasa dan kapasiti discas pada arus malar. Peranan laccase sebagai bio-pemangkin adalah amat ketara daripada profil polarisasi dan plot ketumpatan kuasa. Perbandingan prestasi di antara sel dengan rekabentuk ruangan tunggal and dwi-ruangan turut diketengahkan. Seperti dijangkakan, sel dengan rekabentuk ruangan tunggal menunjukkan kuasa keluaran yang lebih rendah jika dibandingkan dengan rekabentuk dwi-ruangan kemungkinan disebabkan fenomena cas bocor. Sel bio-bahan api ini mempunyai voltan litar terbuka 1.2 V dan memberikan ketumpatan kuasa maksima 0.9 mW/cm2 pada ketumpatan arus 2.5 mA/cm2. Ciri-ciri ini adalah sebanding dengan sel bio-bahan api yang menggunapakai rekabentuk sel yang jauh lebih rumit.

Phytase gene obtained from Bacillus subtilis ASUIA243 was cloned into a medium vector and transformed into E. coli. Restriction enzyme digestion was conducted to get blunt-ended phytase gene and ligated into the Pichia expression vector, pPICZαA. The recombinant vector, pPICZαA-243HPp was then linearized with PmeI and transformed into P. pastoris strain X33. Screening for multi copy gene number of transformants was done by re-plating the selected colonies on increasing concentration of zeocin. One positive clone, X243HPp#2 was then grown in BMGY media as the starting culture, followed by induction in BMMY media for protein expression study. The supernatant was then analysed by SDS-PAGE and Western blot method to check the protein expression. ABSTRAK: Gen fitase yang didapati daripada Bacillus subtilis ASUIA243 diklonkan sebagai vektor perantara dan berubah menjadi E. coli. Sekatan pencernaan enzim dijalankan untuk mendapatkan gen fitase berhujung tumpul dan diligatkan dengan vektor ekspresi Pichia, pPICZαA. Vektor rekombinan, pPICZαA-243HPp kemudian dilinearkan dengan PmeI dan berubah menjadi P. pastoris strain X33. Penyaringan untuk nombor gen berbilang salinan yang menjalani transformasi genetik dijalankan dengan menyalur semula koloni terpilih dengan penambahan kepekatan zeocin. Satu klon positif, X243HPp#2 kemudian dibiarkan hidup dalam perantara BMGY sebagai kultur permulaan, diikuti dengan aruhan dalam perantara BMMY untuk kajian penglahiran protein. Supernatan kemudian dikaji dengan SDS-PAGE dan kaedah sap Western untuk menyemak penglahiran protein. KEYWORDS: phytase, Bacillus subtilis, Pichia pastoris, gene cloning.

Water bath stunning is a common practice in commercial slaughterhouses. Such treatment is economic and in line with animal welfare practice. However, the conditions applied for the stunning process may vary from a slaughterhouse to another slaughterhouse. Such a loose regulation on the stunning procedure has opened up doors for food adulteration such as over dose stunning. In this study, a simple and reliable approach using proteomics have been developed to study the effect of different currents and voltages in stunning on the protein expression of the chickens. Protein profiles of the chickens were constructed in order to detect any differences in protein expression and modifications. The different voltage studied were 10 V, 40 V and 70 V while the values for current studied were 0.25 A, 0.5 A, and 0.75 A. After the proteomics analyses using 2D Platinum ImageMaster 6.0 and Matrix-assisted laser desorption ionization- time of flight (MALDI TOF) spectrometry identification, Voltage dependent anion channel 2 (VDAC2) was identified to be over expressed in the muscle sample of over stunned chicken. The over expression of VDAC2 was confirmed at the transcriptional level of RNA expression. Real Time PCR showed that all over stunned samples contained higher mRNA expression level for VDAC2 genes. The mRNA level of VDAC2 was up-regulated by 59.87 fold change when normalized with housekeeping gene. In conclusion, VDAC2 could serve as potential biomarkers for identification of electrically stimulated chickens. The existence of these biomarkers will help to monitor the slaughtering and stunning process in the future. It will revolutionize the food authentication field and give a new breathe to the meat industry. ABSTRAK: Kaedah "waterbath stunning" merupakan amalan biasa di pusat-pusat penyembelihan. Kaedah ini adalah ekonomik dan selari dengan amalan kebajikan haiwan. Walaubagaimanapun, syarat-syarat yang digunakan untuk proses kejutan tersebut mungkin berbeza antara sebuah pusat sembelihan dengan pusat sembelihan yang lain. Sebarang peraturan yang longgar semasa proses kejutan tersebut membuka ruang kepada adulterasi makanan seperti lebihan dos kejutan elektrik. Dalam kajian ini, satu pendekatan yang mudah dan boleh dipercayai menggunakan proteomik telah dibangunkan untuk mengkaji kesan arus dan voltan yang berbeza dalam proses kejutan elektrik terhadap ekspresi protin di dalam ayam. Profil protein ayam telah dibuat untuk mengesan sebarang perbezaan terhadap ekspresi dan modifikasi protin. Nilai voltan berbeza yang dikaji ialah 10 V, 40 V dan 70 V manakala nilai arus yang dikaji 0.25 A, 0.5 A, dan 0.75 A. Selepas analisis proteomik menggunakan Platinum 2D ImageMaster 6.0 dan Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight (MALDI TOF) Spectrometry Identification, Voltage Dependent Anion Channel 2 (VDAC2) dikenal pasti terlebih ekspres di dalam sampel otot ayam yang terlebih dos kejutan elektrik. Lebihan ekspresi VDAC2 disahkan di peringkat transkripsi ekspresi RNA. Real Time PCR menunjukkan bahawa kesemua sampel yang terlebih dos kejutan mengandungi tahap ekspresi mRNA yang lebih tinggi di dalam gen VDAC2. Tahap mRNA VDAC2 dikawal oleh 59.87 perubahan kali ganda apabila dinormalkan dengan gen housekeeping. Kesimpulannya, VDAC2 boleh bertindak sebagai penanda biologi yang berpotensi untuk mengenal pasti ayam yang dirangsang elektrik. Kewujudan penanda biologi ini akan membantu memantau proses penyembelihan dan kejutan pada masa akan datang. Ia akan merevolusikan bidang pengesahan makanan dan memberi nafas baru kepada industri daging. Keywords Stunning, Slaughtering, Proteomics, Voltage dependent anion channel 2, Chicken muscle