Search

The universal energy source adenosine triphosphate (ATP)is reduced by approximately 30 % in the retinal pigment epithelium (RPE) of elderly persons. Increased oxidative stress and decreased antioxidative capacity, such as glutathione in aging eyes cause impairment of energy-dependent RPE processes and lead to loss of visual function. We developed a cell culture model of aging RPE using atractyloside to inhibit mitochondrial ATP synthesis and tert-butyl hydroperoxide as oxidant. The ATP levels were reduced by 30 % and oxidative damaged proteins and DNA increased whereas antioxidative glutathione decreased. Autophagy as an internal cellular repair mechanism and phagocytosis of photoreceptors were impaired. Antioxidative and mitochondria-activating Ginkgo biloba extract EGb 761 increased the intracellular ATP level and antioxidative glutathione. This cell culture model seems to be suitable to investigate in vitro the effect of protective substances and their compounds on aging processes in RPE.

Hintergrund Untersuchung von Sicherheit und Effektivitat von intravitrealem Bevacizumab bei choroidaler Neovaskularisation infolge pathologischer Myopie (mCNV).

Untersucht wird ein OCT-abhangiges individuelles Reinjektionsprozedere mit intravitrealem Bevacizumab bei neovaskularer AMD. 32 Patienten mit aktiver subfovealer okkulter CNV bei AMD wurden einmalig mit 1,25 mg Bevacizumab intravitreal behandelt und nur reinjiziert bei im OCT persistierender bzw. erneut auftretender sub- bzw. intraretinaler Flussigkeit. Kontrolluntersuchungen erfolgten in 6–8-wochigen Abstanden. Nach einmaliger Injektion war bei 74% der Patienten die sub- und intraretinale Flussigkeit komplett resorbiert. 44% dieser Patienten blieben wahrend eines Follow-up von 30±13 Wochen trocken, 56% benotigten nach durchschnittlich 19±8 Wochen eine 2. Injektion, wonach bei 82% der Befund erneut abtrocknete und sich der initiale Visusgewinn wieder einstellte. 32% dieser Patienten blieben daraufhin stabil trocken (Follow-up 32±12 Wochen). Von den Patienten, die nach der 1. Injektion nicht abtrockneten (26%), zeigte sich bei 44% nach der 2. Injektion ein trockener Befund. Bei allen Patienten konnte uber die Behandlungsdauer eine Visusstabilisierung erzielt werden, bei 30% ein signifikanter Visusanstieg ≥3 Linien. Bevacizumab-Reinjektionen in Abhangigkeit vom OCT-Befund fuhren bei exudativer AMD neben einer Reduktion der Injektionsanzahl zu einer anatomischen und funktionellen Befundstabilisierung.

Hintergrund Das Makulaodem (MO) infolge venoser retinaler Verschlusse lasst sich durch intravitreales Bevacizumab gut beeinflussen. Unklar ist, wann und nach welchen Kriterien Reinjektionen erfolgen sollten.

Untersucht wurde der Effekt von intravitreal appliziertem Bevacizumab als Off-Label-Therapie bei verschiedenen angiographischen Subtypen der neovaskularen altersabhangigen Makuladegeneration (AMD). 75 Patienten mit neovaskularer AMD und „recent disease progression“ wurden angiographischen Subtypen zugeordnet und mit intravitrealem Bevacizumab (1,25 mg/0,05 ml) in 6-wochigen Abstanden therapiert. Bei subfovealer klassischer choroidaler Neovaskularisation (CNV) erfolgte zusatzlich eine photodynamische Therapie. ETDRS-Visus, ophthalmologische Untersuchungen und optische Koharenztomographien (OCT) wurden vor Therapie, nach einer Woche und in 6-wochigen Intervallen durchgefuhrt. Weiterhin erfolgen Fluoreszenzangiographien und internistische Kontrolluntersuchungen. Bei allen angiographischen Subtypen fuhrte die Bevacizumab-Therapie wahrend einer Nachbeobachtungszeit von 37±13 Wochen im Mittel zu einer Visusstabilisierung (Verlust von weniger als 15 Buchstaben). Patienten mit okkulter extrafovealer CNV (n=6) erzielten den hochsten Visusanstieg (2±2 Linien). Die Bevacizumab-Therapie wurde von allen Patienten ohne systemische oder intraokulare Nebenwirkungen sehr gut vertragen. In einem Fall kam es zum Riss des retinalen Pigmentepithels. Intravitreale Bevacizumab-Injektionen wirken bei allen angiographischen CNV-Subtypen im Sinne einer Makulaodemreduktion und fuhren zu einer Visusstabilisierung bzw. -besserung.

Venose retinale Gefasverschlusse konnen durch eine erhohte intravitreale VEGF-Konzentration zur Ausbildung eines Makulaodems fuhren. Wir berichten uber anatomische und funktionelle Ergebnisse nach intravitrealer Bevacizumab-Injektion bei venosen retinalen Verschlussen. 18 Patienten mit Zentralvenen- und 22 Patienten mit Venenastverschluss und persistierendem Makulaodem (>300 μm) wurden in einer prospektiven Studie mit 2,5 mg Bevacizumab intravitreal behandelt. EDTRS-Visus, ophthalmologische Untersuchung und OCT erfolgen vor Therapiebeginn, 1 Woche nach Injektion und in monatlichen Intervallen. Reinjektionen wurden bei persistierendem bzw. erneutem Makulaodem in 6-wochigen Abstanden durchgefuhrt. Bei keinem der 40 Patienten kam es zu einer subjektiven oder objektiven Befundverschlechterung. Die Injektionen (im Mittel 2,6±1,4 Injektionen) wurden bei einem mittleren Follow-up von 23±13 Wochen ausnahmslos sehr gut vertragen. Bei 73,3% der Patienten mit Zentralvenen- und bei 76,5% der Patienten mit Venenastverschluss kam es bei letzter Vorstellung zu einem signifikanten Visusanstieg (Visusgewinn um mindestes 3 Zeilen). Gleichzeitig hat sich die mittlere Netzhautdicke bei Patienten mit Zentralvenenverschluss von 921±264 μm auf 239±66,2 μm, und bei Patienten mit Venenastverschluss von 678±221 auf zuletzt 236±78 μm reduziert. In dieser Studie konnten nach intravitrealen Bevacizumab-Injektionen in einer Konzentration von 2,5 mg bislang keine intraokularen oder systemischen Nebenwirkungen beobachtet werden. Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass die intravitreale Anti-VEGF-Therapie eine viel versprechende Option bei Makulaodem infolge venoser retinaler Verschlusse ist.

Hintergrund. Lipofuszin akkumuliert in postmitotischen retinalen Pigmentepithelzellen (RPE) mit dem Alter und in Assoziation mit verschiedenen Makula-/Netzhautdegenerationen. Wir konnten zeigen, dass der Lipofuszinretinoid-Bestandteil A2-E (N-Retinyliden-N-Retinyl-Ethanolamin) lysosomale Funktionen hemmt. Um weitere Wirkungsmechanismen fur toxische Effekte von A2-E zu evaluieren, untersuchten wir nach Etablierung einer Methode zur Isolation intakter Lysosomen aus RPE-Zellkulturen Detergenzieneffekte auf lysosomale und andere zellulare Membranen mittels Latenzmessungen. Methoden. Zur Isolation intakter Lysosomen wurde der postnukleare Uberstand humaner RPE-Zellen mittels sequenzieller Dichtegradientenzentrifugation fraktioniert. Die Ruptur der lysosomalen Membran wurde durch Latenzmessungen des lysosomalen Leitenzyms β-Hexosaminidase an mit A2-E inkubierten isolierten Lysosomen erfasst. Latenzen der Markerenzyme Succinatdehydrogenase and UDP-Galactosyltransferase zeigen Effekte des A2-E auf Membranen isolierter Mitochondrien und Mikrosomen. Nach Zugabe von A2-E in das Kulturmedium konnten durch Messung der Laktatdehydrogenase Schaden der Plasmamembran erfasst werden. Ergebnisse. Bis auf eine geringe Restaktivitat mitochondrialer Leitenzyme konnte eine 100fache Anreicherung der lysosomalen Fraktion erzielt werden. Eine Kontamination mit anderen Zellfraktionen wurde nicht beobachtet. In geeigneten isotonischen Puffern besitzen die Lysosomen eine ausreichende Stabilitat, um mogliche Detergenzieneffekte des A2-E auf lysosomale Membranen nachzuweisen. Bei Konzentrationen uber 2 μM A2-E kam es zur Leckage des lysosomalen Leitenzyms. Leckage des mitochondrialen Leitenzyms erfolgte bereits ab 1 μM A2-E, wahrend ER/Golgi-Membranen und Plasmamembranen relativ resistent gegenuber Detergenzieneffekten von A2-E waren. Schlussfolgerung. Die beschriebene Methode zur Isolation intakter Lysosomen aus RPE-Zellen ist auch fur zukunftige Untersuchungen fur lysosomale Effekte verschiedener Biomolekule nutzbar. A2-E induziert bereits in niedriger Konzentration eine Desintegration der lysosomalen Membran. Detergenzieneffekte an der mitochondrialen Membran stellen offensichtlich einen weiteren Pathomechanismus dar, wodurch Reaktionskaskaden, die letztlich zum Zelltod fuhren konnen, induziert werden. Unsere Beobachtungen sprechen fur einen Detergenzieneffekt von A2-E an verschiedenen zellularen Membranen, der bei allen retinalen Erkrankungen mit exzessiver Lipofuszinakkumulation, wie der AMD, von Bedeutung sein konnte. Ein besseres Verstandnis dieser molekularen Mechanismen eroffnet neue therapeutische Perspektiven.

Hintergrund. Die exzessive Akkumulation von Lipofuszin in retinalen Pigmentepithelzellen ist sowohl bei der altersabhangigen Makuladegeneration (AMD) als auch bei verschiedenen erblichen Makuladystrophien von pathogenetischer Bedeutung. Wir haben gezeigt, dass der Lipofuszinfluorophor A2-E (N-Retinyliden-N-Retinyl-Ethanolamin) speziell den lysosomalen Stoffwechsel humaner retinaler RPE-Zellen hemmt und phototoxische Eigenschaften besitzt. Hier wurden neben der vorher gezeigten intralysosomalen pH-Wert-Erhohung weitere Mechanismen der Hemmung lysosomaler Enzyme untersucht. Methoden. RPE-Zellen wurden durch Potter-Elvejem-Homogenisation aufgeschlossen und in den resultierenden RPE-Zellhomogenaten mithilfe spezieller Enzymtests die Aktivitaten 24 lysosomaler Enzyme vor und nach Inkubation mit A2-E gemessen. Ergebnisse. In humanen RPE-Zellen wurde erstmals ein breites Spektrum lysosomaler Hydrolasen, das Proteasen, Lipasen, Glykosidasen, Nukleasen, Sulfatasen und Phosphatasen umfasst, gemessen. Lysosomale Enzymaktivitaten konnen hierbei in RPE-Zellen exakt und reproduzierbar bestimmt werden. Selbst hohe Konzentrationen von A2-E (10 μM) zeigten keine hemmende Wirkung auf lysosomale Hydrolasen im RPE. Schlussfolgerung. Mit den hier verwendeten Methoden lassen sich reproduzierbar lysosomale Enzymaktivitaten in humanen RPE-Zellen bestimmen. Die A2-E bedingte Hemmung des lysosomalen Stoffwechsels wird offensichtlich nicht durch eine direkte Enzymhemmung vermittelt. Ursachlich scheint ein intralysosomaler pH-Anstieg mit konsekutivem Verlust der lysosomalen Enzymaktivitat zu sein. Fur diese pH-Verschiebung konnte eine inhibitorische Wirkung auf die membranstandige Protonenpumpe verantwortlich sein. Das genaue Verstandnis der Hemmungsmechanismen von A2-E auf die Funktion von RPE-Zellen kann neue Wege der gezielten pharmakologischen Intervention bei Erkrankungen mit exzessiver Lipofuszinakkumulation aufzeigen.

Hintergrund. A2-E, ein fluoreszierender Bestandteil von Lipofuszin, beeintrachtigt den lysosomalen Stoffwechsel humaner retinaler Pigmentepithel- (RPE-)Zellen. Als weiterer moglicher Schadigungsmechanismus wurde hier das phototoxische Potenzial des Retinoidanteils untersucht. Methode. Die A2-E-Akkumulation wurde durch Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse erfasst. Mittels Acridine-Orange-Farbungen wurden die lysosomale Stabilitat und der intralysosomale pH untersucht. A2-E beladene RPE-Zellen sowie Kontrollen ohne A2-E wurden kurzwelligem sichtbaren Licht (400–500 nm) ausgesetzt, und die Uberlebensrate der RPE-Zellen wurde gemessen. Ergebnisse. Fluoreszenzmikroskopie und FACS-Analyse zeigten eine intralysosomale Akkumulation von A2-E. Acridine-Orange-Farbungen bestatigten die lysosomale Speicherung und pH-Steigerung nach A2-E-Applikation. A2-E beladene und belichtete RPE-Zellen zeigten eine signifikante Reduktion der Uberlebensrate im Vergleich zu ausschlieslich belichteten oder A2-E beladenen Zellkulturen. A2-E-Exposition fuhrt zu einem Verlust lysosomaler Stabilitat. Schlussfolgerung. A2-E schadigt RPE-Zellen offensichtlich durch eine Vielzahl von Mechanismen einschlieslich einer Hemmung des lysosomalen Abbaus, Verlust der Integritat von Zellmembranen und Phototoxizitat. Diese Mechanismen konnten bei der Pathogenese retinaler Erkrankungen eine Rolle spielen, die mit exzessiver Lipofuszinakkumulation im RPE einhergehen einschlieslich altersabhangiger Makuladegeneration, Morbus Best und Morbus Stargardt.

Hintergrund: Lipofuszin akkumuliert in postmitotischen retinalen Pigmentepithelzellen altersabhangig und im Rahmen zahlreicher Netzhauterkrankungen. Um einen moglichen Effekt von Lipofuszinbestandteilen auf die Zellfunktion und damit die pathophysiologische Bedeutung in vitro zu untersuchen, ist eine spezifische Beladung des lysosomalen Kompartiments erforderlich. Wir untersuchten, inwieweit dies mit einer Ankopplung des Lipofuszin-Fluorophors N-Retinyliden-N-Retinylathanolamin (A2-E) an LDL-Partikel erreicht werden kann. Material und Methode: A2-E wurde aus Retinal und Athanolamin synthetisiert und in einen Komplex mit LDL-Partikeln gebracht. Primare humane RPE-Zellkulturen wurden mit dem A2-E/LDL-Komplex uber 4 Wochen inkubiert. Anschliesend wurden die Zellen mittels Stickstoff-Kavitation eroffnet und durch Ultrazentrifugation fraktioniert. Der postnukleare Uberstand wurde hinsichtlich der Markerenzymaktivitaten der verschiedenen zellularen Kompartimente analysiert. Ergebnisse: Im Percoll-Gradienten zeigten sich ubereinstimmende Peaks des lysosomalen Markerenzyms s-Hexosaminidase und der relativen A2-E-Fluoreszenz. Ein Anteil von A2-E korrespondierte mit der Verteilung der Phosphodiesteraseaktivitat als Hinweis fur eine in der Plasmamembran verbliebene geringe Menge von A2-E. Das lysosomale Markerenzym s-Hexosaminidase trat nicht in das zytosolische Kompartiment aus. Schlusfolgerung: Durch die Kopplung von A2-E an LDL-Partikel ist eine effektive Einschleusung eines Retinoid-Bestandteils von Lipofuszin in das lysosomale Kompartiment humaner RPE-Zellen moglich. Das Verfahren kann somit fur Untersuchungen zur Wirkung von A2-E auf pigmentepitheliale Zellfunktionen und damit fur die Klarung der Frage hilfreich sein, inwieweit der Lipofuszinakkumulation im retinalen Pigmentepithel eine pathophysiologische Bedeutung bei Netzhauterkrankungen, die mit einer exzessiven Lipofuszinakkumulation einhergehen, einschlieslich der altersabhangigen Makuladegeneration, zukommt. Die Befunde sprechen gegen eine Detergentienwirkung von A2-E auf die lysosomale Membran.