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Les corticosurrenalomes ont un pronostic heterogene. Recemment, les etudes de genomique ont identifie 3 sous-groupes de tumeurs caracterises par des alterations moleculaires specifiques. La classification moleculaire peut etre determinee en routine par des marqueurs cibles et ameliore l’evaluation du pronostic. Objectif Evaluer l’heterogeneite intra-tumorale des alterations moleculaires. Patients et methodes Analyse des mutations de 20 genes drivers (NGS cible) et des alterations chromosomiques (puces SNP) dans 2 echantillons tumoraux differents pour 14 patients operes d’un corticosurrenalome : primitif et metastase (n = 9 dont 5 atteintes metachrones), 2 echantillons de volumineux primitif (n = 2) ou 2 echantillons de metastases (n = 3). Resultats Nous avons observe entre 0 et 4 alterations par echantillon parmi les 20 genes drivers, notamment ZNRF3 (25 %), TP53 (21 %), CTNNB1 (18 %), CDKN2A (21 %) et TERT (21 %). Certaines alterations (CDKN2A, CTNNB1, ZNRF3) n’etaient presentes que dans une metastase (n = 3) ou dans un des deux echantillons du primitif (n = 1). L’heterogeneite intra-tumorale n’etait pas associee au stade au diagnostic ou au grade tumoral. Nous avons identifie des profils d’alterations chromosomiques « bruite » (nombreuses cassures anarchiques) pour 67 % et « chromosomal » (pertes d’heterozygotie etendues) pour 33 % des echantillons, similaires pour les 2 echantillons de chaque patient. Discussion Pour 4/14 patients, l’heterogeneite des mutations somatiques evoque la presence de sous-clones tumoraux d’agressivite differente. Cependant, le profil global des alterations chromosomiques reste identique, suggerant une stabilite genetique lors de la progression tumorale dans les corticosurrenalomes par comparaison a d’autres cancers.

Les lesions corticosurrenaliennes benignes regroupent un large eventail de maladies avec des morphologies ainsi que des secretions de steroides distinctes. Contrairement au corticosurrenalome, aucune vision globale moleculaire des alterations moleculaires n’est disponible pour ces tumeurs. Objectifs Fournir une classification moleculaire des tumeurs corticosurrenaliennes benignes, en utilisant une serie de mesures non biaisees pan-genomiques dans une cohorte incluant tous les types de tumeurs corticosurrenaliennes benignes. Methodes L’etude effectuee rapporte l’analyse pan-genomique incluant transcriptome, miRNome, methylome, mutations et alterations chromosomiques de 146 lesions adrenocorticales benignes. Resultats Le transcriptome, le methylome, le miRNome et le statut mutationnel convergent en une seule classification avec quatre groupes principaux : (i) les tumeurs productrices de cortisol, regroupant differents types partageant une activation commune de la voie AMPc/PKA par des mecanismes distincts. Le transcriptome a permis d’identifier une signature steroidogene ; (ii) des adenomes corticosurrenaliens (ACA) sans ou avec une secretion legere de cortisol, associes a des mutations de la beta-catenine ; (iii) des hyperplasies macronodulaires primaires avec des mutations ARMC5, montrant une signature d’expression ovarienne ; (iv) des ACA produisant de l’aldosterone, en dehors d’autres tumeurs benignes. Les alterations epigenetiques et la steroidogenese semblent associees, incluant l’hypomethylation des ilots CpG dans les tumeurs sans ou avec une secretion legere de cortisol, les profils des miARN definissant des groupes moleculaires specifiques, et la regulation directe de l’expression des enzymes steroidogenes par la methylation. Conclusion Cette premiere caracterisation pan-genomique a grande echelle des lesions corticosurrenaliennes benignes represente une nouvelle ressource importante pour l’etude de la tumorigenese corticosurrenalienne et de la steroidogenese.

Les corticosurrenalomes ont un pronostic heterogene. Recemment, les etudes pangenomiques ont decrit des alterations specifiques : transcriptome « C1A » (expression de genes de la proliferation/cycle cellulaire) versus « C1B », methylome « CIMP » (hypermethylation des ilots CpG) versus « non-CIMP », alterations chromosomiques « bruite » (nombreuses cassures anarchiques) versus « chromosomal » (pertes d’heterozygotie etendues) et « calme » (alterations limitees), mutations somatiques recurrentes dans 20 genes. Ces alterations convergent en une classification en 3 groupes correlant avec le pronostic. Objectif Developper et valider des marqueurs moleculaires cibles refletant ces groupes genomiques. Patients et methodes Deux cent quarante-cinq corticosurrenalomes de 21 centres francais (COMETE) et europeens (ENSAT) ont ete inclus. Nous avons analyse l’expression differentielle BUB1B-PINK1 par RT-qPCR sur l’ARN (n = 135), les alterations chromosomiques par puces SNP (n = 238), les mutations de 20 genes drivers par NGS cible (n = 251) et la methylation des ilots CpG de 4 genes (PAX5, GSTP1, PYCARD, PAX6) par MS-MLPA (n = 221) sur l’ADN tumoral. Resultats Les marqueurs cibles identifiaient : – 50 % « C1A », 38 % « C1B » et 12 % indetermine ; – 44 % « CIMP » et 56 % « non-CIMP » ; – 55 % « chromosomal », 32 % « bruite » et 13 % « calme » ; – mutations ou deletions : 21 % ZNFR3, 17 % TP53, 11 % CTNNB1 et 10 % CDKN2A. L’ensemble des marqueurs cibles etaient disponibles pour 107 tumeurs. Au total, 87/107 (81 %) refletaient de maniere concordante les 3 groupes identifies par la genomique : 37 « C1A/CIMP », 18 « C1A/non-CIMP » et 32 « C1B/non-CIMP ». On observait 34/37, 7/18 et 1/32 deces dans ces 3 groupes respectifs (Fisher p Conclusion Les marqueurs moleculaires cibles peuvent resumer la classification genomique des corticosurrenalomes et sa valeur pronostique.

Le cortex surrenalien produit des hormones steroides, principalement le cortisol, l’aldosterone et des androgenes. Le cortex surrenalien peut etre le siege de tumeurs –adenomes ou cancers-, hyperplasies et dysplasies. Ces lesions sont dans leur grande majorite benignes. Elles peuvent etre associes a une hypersecretion d’hormone steroide, le plus souvent de cortisol (syndrome de Cushing) ou d’aldosterone. Il existe aussi des tumeurs non secretantes. Si des classifications moleculaires ont ete etablies pour les carcinomes, a ce jour il n’existe pas de classification pangenomique des tumeurs benignes corticosurrenaliennes, qui pourrait renseigner sur les mecanismes de secretion autonome et de proliferation de ces lesions. Enfin le determinisme genetique des dysplasies et hyperplasies n’est que partiellement connu. Au cours de ma these, j’ai pu analyser un jeu de donnees « omics » complet des lesions benignes corticosurrenaliennes pour plus d’une centaine d’echantillons, incluant du sequencage haut-debit (exome/cible pour les mutations, RNA-seq pour l’analyse des microARNs), des puces transcriptome et methylome, et des puces SNP pour la recherche d’alterations chromosomiques. J’ai pu identifier une classification moleculaire pangenomique relativement convergente entre les differentes « omics », qui concorde avec les types tumoraux et secretoires, mais identifie egalement des sous-groupes nouveaux au sein de ces lesions. Il ressort notamment que les mutations dans ces lesions sont des determinants essentiels de la classification moleculaire. Ainsi sont regroupees les lesions selon la voie de signalisation ou le gene altere, notamment la voie PKA/AMPc pour les lesions produisant du cortisol, la voie Wnt/beta-catenine pour les adenomes ne secretant pas ou peu de cortisol, et ARMC5 pour un sous-groupe d’hyperplasies macronodulaires. Ces groupes tres distincts contiennent egalement des lesions sans mutation identifiee, avec vraisemblablement des mecanismes alternatifs d’alteration de ces voies de signalisation. Dans le groupe des hyperplasies macronodulaires mutees ARMC5, la comparaison avec l’ensemble des autres lesions benignes fait ressortir une signature d’expression ovarienne forte, marquee par l’expression de FOXL2 et de ses cibles CYP19A1 et PTHLH. Cette marque de differentiation specifiquement gonadique au sein de la surrenale fait discuter une anomalie de developpement. Cette analyse genomique integree identifie egalement des alterations epigenetiques de la steroidogenese. Notamment les tumeurs secretant beaucoup de cortisol sont globalement hypermethylees dans leurs ilots CpG. Par ailleurs l’hypermethylation de CYP21A2 est vraisemblablement un mecanisme de deficits en 21-hydroxylase intratumoral. Des signatures de miRNA semblent egalement avoir un impact sur la steroidogenese. Au cours de ma these j’ai egalement analyse l’exome des hyperplasies macronodulaires non mutees ARMC5. Je n’ai pas identifie de nouvelle mutation somatique recurrente. Au niveau de l’exome germinal, j’ai identifie plusieurs genes candidats recurrents, qui ouvrent la voie a des analyses genetiques (extension de cohorte) et de biologie cellulaire complementaires. Ce travail est la premiere caracterisation genomique d’envergure des lesions benignes de la corticosurrenale. Meme si tous les mecanismes ne sont pas elucides dans le detail, ces donnees representent une ressource importante pour orienter les recherches a venir dans la tumorigenese surrenalienne benigne et la steroidogenese.

Le pronostic des corticosurrenalomes est heterogene. Les etudes pan-genomiques ont etabli une classification moleculaire distinguant des groupes de corticosurrenalomes de pronostic different. Objectif Valider la valeur pronostique de marqueurs moleculaires cibles utilisables en routine. Materiel et methodes Deux cent quarante-quatre corticosurrenalomes, issus de centres francais (COMETE) et europeens (ENSAT), ont ete inclus. Nous avons analyse l’expression differentielle de 2 genes (BUB1B-PINK1) par RT-qPCR sur l’ARN (n = 135), les alterations chromosomiques par puces SNP (n = 183), les mutations de 20 genes drivers par NGS cible (n = 136) et la methylation des ilots CpG de 4 genes (PAX5, GSTP1, PYCARD, PAX6) par MS-MLPA (n = 221) sur l’ADN tumoral. Resultats Cinquante pour cent des tumeurs presentaient un marqueur ARN defavorable (BUB1B-PINK1 > 5,90), associe a un risque eleve de deces (HR = 10,2 [3,6–28,6], cox p 25 %). En combinant ces differents marqueurs, nous retrouvons les deux groupes moleculaires de corticosurrenalomes : – premier groupe : marqueur ARN defavorable, mutations, profil bruite, hypermethylation ; – deuxieme groupe : marqueur ARN favorable, absence de mutations, profil calme/chromosomal, absence d’hypermethylation. Les deces etaient plus frequents dans le premier groupe (Khi2, p = 0,046). Conclusion L’analyse de marqueurs cibles sur l’ADN et l’ARN tumoral permet de distinguer deux groupes de corticosurrenalomes de pronostic different.

Les corticosurrenalomes presentent des alterations somatiques recurrentes de certains genes (principalement ZNRF3 , CTNNB1 , TP53 , CDKN2A , RB1 , TERT ). Ce sont le plus souvent des mutations. Cependant certains genes ( ZNRF3 , CDKN2A , RB1) peuvent etre inactives par de larges deletions homozygotes. Objectif Evaluer la possibilite de detecter les deletions larges par sequencage cible haut debit. Methode Soixante-quinze corticosurrenalomes ont ete analyses a la fois par puce SNP (Illumina), et sequencage haut debit (IonTorrent, LifeTechnologies) ciblant 15 genes mutes dans les corticosurrenalomes, apres capture par PCR (AmpliSeq, LifeTechnologies). Un programme specifique developpe en R, analyse : – le sequencage : nombre de sequences pour tous les amplicons de chaque gene (profondeur) ; – les SNP : nombre de copies d’ADN et ratio allelique. Resultats En sequencage cible, 11 deletions homozygotes sont identifiees (4 pour ZNRF3, 4 pour CDKN2A, 2 pour RB1, et 1 pour BAI1). 8/11 de ces deletions homozygotes sont identifiables par puce SNP, et 3 deletions homozygotes (ZNRF3, CDKN2A et BAI1) ne le sont pas (probable resolution insuffisante des puces). Parmi les 51 pertes chromosomiques identifiables en puce SNP (deletions heterozygotes), 26 sont detectees en sequencage cible. Parmi les 28 gains chromosomiques larges identifies en puce SNP, 23 sont detectes en sequencage cible. Cependant la detection des gains par sequencage est peu specifique (70 faux positifs). Conclusion Au-dela de l’information de sequence, la profondeur du sequencage haut debit identifie les deletions homozygotes, et probablement les deletions heterozygotes. Ceci permettra le developpement d’outils de classification moleculaire des corticosurrenalomes par sequencage cible.

Objectif L’hyperplasie macronodulaire bilaterale des surrenales (HMBS) entraine des tumeurs corticosurrenaliennes bilaterales avec hypercortisolisme. Nous avons identifie de frequentes alterations d’un nouveau gene suppresseur de tumeur, ARMC5, dans l’HMBS (Assie et al., NEJM 2014 ; Espiard et al., JCEM 2015). La proteine ARMC5 contient des domaines Armadillo et BTB impliques dans des interactions proteine-proteine, mais ses mecanismes d’actions sont inconnus. L’objectif de notre etude est de caracteriser les partenaires de ARMC5 et les voies de signalisation dans lesquelles il est implique. Materiel et methodes Un screening des partenaires liant ARMC5 sauvage et deux mutants ponctuels de ARMC5 a ete realise par spectrometrie de masse. L’interaction a ete confirmee par co-IP et bioluminescence resonance energy transfert (BRET). L’impact de l’invalidation de ARMC5 (siRNA) sur l’activite PKA a ete etudie par differentes approches [substrat synthetique de la PKA, FRET (senseur AKAR), Western-blot (phosphorylation des substrats de la PKA) et systeme rapporteur CRE-luciferase]. Resultats Nous avons initialement identifie 16 proteines liant ARMC5 sauvage. L’interaction entre ARMC5 et les sous-unites catalytique Cα et regulatrice R1A de la PKA a ete retrouvee en co-IP et par BRET. L’invalidation de ARMC5 entraine une diminution du niveau proteique de Cα associee a une diminution de l’activite PKA. Discussion ARMC5 semble donc un regulateur important de la voie de signalisation AMPc/PKA, participant a la physiologie et pathophysiologie de la corticosurrenale. La comprehension des mecanismes d’action de ARMC5 sur la voie PKA nous permettra de mieux apprehender l’impact des mutations identifiees dans le gene ARMC5 chez les patients atteints de HBMS.

Introduction La secretion de cortisol par les adenomes corticosurrenaliens (AC) est variable. Cette variabilite pourrait etre liee a une physiopathologie differente. Le transcriptome identifie deux groupes d’AC, differents par leur secretion. La secretion de cortisol est liee a la voie Proteine Kinase A (PKA), et des mutations activatrices de la sous unite catalytique alpha de la PKA (PRKACA) ont ete identifiees recemment. Enfin 30 % des AC presentent une mutation activatrice de β-catenine (CTNNB1). L’objectif est de preciser le lien entre le transcriptome, la secretion et le statut mutationnel des adenomes. Methodes Au total, 39 AC etudies par transcriptome (Affymetrix) ont ete inclus (19 Cushing, 9 non secretants et 11 Cushing subclinique). PRKACA et β-catenine ont ete analyses par sequencage Sanger. Resultats La classification non supervisee retrouve deux groupes d’adenomes differents par leur secretion : un groupe « secretant » d’adenomes de Cushing (15/15), et un groupe « mixte » de non secretants (9/24), de Cushings infracliniques (11/24) et de Cushings francs (4/24) (Fisher p Les mutations de PRKACA sont retrouvees exclusivement dans les AC du groupe secretant (8/15) et aucun des 24 AC du groupe mixte (Fisher p Conclusion Il existe deux types d’AC, un lie a l’activation de la voie PKA et responsable d’un Cushing franc, l’autre liee a l’activation de la voie Wnt-βcatenine et associe a des niveaux de secretion variable.

Introduction Les cancers presentent de nombreuses mutations somatiques, identifiables par le sequencage d’exomes. Certains genes sont egalement inactives par deletion homozygote ou actives par amplification genique dans la tumeur. L’objectif etait d’identifier les genes alteres dans les corticosurrenalomes. Materiel et methodes L’exome de 45 corticosurrenalomes a ete compare a l’ADN non tumoral correspondant. Neuf genes recurrents ont ete sequences sur 77 autres couples tumeurs/leucocytes. Le genome de ces tumeurs a ete egalement analyse par puce SNP. Resultats Les corticosurrenalomes presentent une mediane de 30 mutations somatiques, sauf deux corticosurrenalomes hypermutes (517 et 1364 mutations). Le taux de mutation est correle a la survie a 5 ans (Wilcoxon p = 0,003) et au score de Weiss (ANOVA p = 0,02). Neuf genes sont alteres dans au moins 3/45 corticosurrenalomes passes en exome et en puce SNP : ZNRF43, CTNNB1, TP53, RB1, MEN1, CDKN2A, TERT, DAXX et MED12. Parmi ces genes, ZNRF3, est un nouveau gene suppresseur de tumeurs identifie par cette etude. Il est altere dans 26 des 122 corticosurrenalomes (21 %). ZNRF3 semble moduler la voie Wnt-βcatenine. Dans la meme voie, CTNNB1 est mute dans 20/122 des corticosurrenalomes (16 %). Les alterations de ZNRF3 et CTNNB1 sont mutuellement exclusives. Enfin TP53 est altere dans 20/122 corticosurrenalomes (16 %). Les mutations recurrentes sont retrouvees principalement dans les corticosurrenalomes « agressif » tels que definis par la classification non supervisee du transcriptome. Conclusion Il existe deux types de corticosurrenalomes, l’un de mauvais pronostic avec des mutations specifiques (voie Wnt-βcatenine et voie p53 principalement), l’autre sans mutation recurrente.