Titel und Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1 2. Material und Methode 21 3. Ergebnisse 50 4. Diskussion 92 5. Zusammenfassung 110 6. Summary 112 7. Literaturverzeichnis 114 8. Anhang 129, Epithelien und Endothelien bilden in multizellulären Organismen Barrieren, die für die Funktion dieser Organe essentiell sind, jedoch die Wirkstoffpermeation einschränken können. Um die freie Diffusion wasserlöslicher Moleküle durch die Zwischenräume von Epithel- und Endothelzellen zu begrenzen, ist der parazelluläre Spalt zwischen diesen Zellen durch Tight junctions (TJ) abgedichtet. TJs erscheinen in der Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie als intramembranöse Netzwerke aus Strängen im apikalen Bereich der lateralen Plasmamembran. Strukturelles Rückgrat der TJs der besonders dichten Blut- Hirnschranke sind die Claudine (Cld) 3 und 5. Cld5 dichtet die TJs der Blut- Hirnschranke für Moleküle kleiner als 800 Da ab. Hypothese dieser Arbeit ist, dass die Strangbildung und der Verschluss des parazellulären Spalts auf homo- und heterophile cis\- und trans-Interaktionen der Claudine zurückzuführen ist, deren molekularer Interaktionsmechanismus bisher ungeklärt gewesen ist. Mit dieser Arbeit wurde eine direkte homophile Selbstassoziation der zweiten extrazellulären Schleife (2.EZS) der Claudine 3 und 5 mit Größenausschlusschromatographie nachgewiesen. Eine Beteiligung der 2.EZS an der trans-Interaktion, nicht jedoch an der cis-Interaktion, wurde durch systematische Aminosäuresubstitutionen der 2.EZS von Cld5 bewiesen. Zudem wurden molekulare Determinanten identifiziert, die in die trans-Interaktion involviert sind. Dazu wurden TJ-lose HEK-293-Zellen verwendet, in denen die homophile cis\- und trans-Interaktion sowie die Strangbildung von Cld5 frei vom Einfluss endogener Claudine untersucht wurde. Die Analyse der trans- Interaktionsfähigkeit mittels konfokaler Mikroskopie sowie die Ermittlung der subzellulären Lokalisation der Cld-Mutanten durch Zelloberflächen- Biotinylierung und konfokale Mikroskopie führten zu strukturellen Modellen eines Cld5-Monomers und eines Cld5-trans-Dimers. Dazu wurde auf die 2.EZS von Cld5 die sequenzhomologe Teilstruktur eines hypothetischen, bakteriellen Proteins (BB2244) übertragen. Die 2.EZS von Cld5 ist demnach eine Helix-turn- Helix-Struktur, deren turn-Konformation durch ein Netzwerk aus Wasserstoffbrücken, die Proline P150 und P153 sowie durch hydrophobe Seitenketteninteraktionen zwischen V152 und L160 stabilisiert wird. Nach dem Dimer-Modell trans-dimerisiert die 2.EZS durch eine Wechselwirkung von drei aromatischen Seitenketten (F147, Y148, Y158) zweier Schleifen miteinander. Eine potentielle Bindungsstelle der ebenfalls an der trans-Interaktion beteiligten Aminosäuren Q156 und E159 konnten bisher nicht identifiziert werden. Die Strukturmodelle lassen sich auf Claudine mit hoher Sequenzhomologie übertragen, die dadurch erstmals als klassische Claudine 1-10, 14, 15, 17 und 19 definiert werden. Weiterhin wurde das Zusammenspiel von Claudinen bei der Strangbildung hinsichtlich cis\- und trans-Interaktionen untersucht. Mutanten mit gestörter trans-Interaktion zeigten in der Gefrierbruch-Elektronenmikrospkopie eine stark verringerte Zahl intramembranöser Stränge, obwohl die cis-Interaktion unbeeinträchtigt blieb. Es wird ein Schema postuliert, das die Morphologie von Claudin-5-gebildeten diskontinuierlichen Strängen erklärt. Die Partikelkomplexe der diskontinuierlichen Stränge von Cld5 müssen demnach mit den Partikelkomplexen einer benachbarten Zelletrans-interagieren, um TJ- Stränge zu bilden. Bei den Partikelkomplexen handelt es sich möglicherweise um Cld5-Hexamere. Ein weiterer Aspekt der Arbeit ist die Analyse der Wechselwirkungen zwischen der 2.EZS von Claudinen und Clostridium perfringens Enterotoxin (CPE). Durch die Analyse von membrangebundene Peptidbibliotheken wurde die Interaktion von CPE mit Peptiden der 2.EZS der Claudine 3, 6, 7, 9 und 14, nicht jedoch der Claudine 1, 2, 4, 5, 6, 8, 10-13, 15, 18, 19, 20 und 22 aufgezeigt. Substitutionsanalysen mit membrangebundenen Peptidbibliotheken identifizierten das turn-Motiv NPLVP als essentiell für die Interaktion zwischen CPE und den isolierten 2.EZS von Claudinen. Im Gegensatz dazu scheint das turn-Motiv für die Interaktion von CPE mit nativen Cld-Molekülen auf der Zelloberfläche von Cld-exprimierenden Zellen ohne Bedeutung zu sein. Das deutet darauf hin, dass die bindungsrelevante Struktur der 2.EZS von Cld5 stark von der Membrantopologie der Claudine abhängt. Durch CPE-Bindungsstudien an transfizierten HEK-293-Zellen wurden zwei bindungsrelevante Aminosäuresubstitutionen, T151A und Q156E, in der 2.EZS von Cld5 identifiziert. Weiterhin wurde gezeigt, dass CPE an Cld-Moleküle außerhalb der TJs von Cld3- bzw. Cld5-exprimierenden HEK-293-Zellen bindet. Die CPE- induzierte Öffnung der TJs durch eine Störung des Polymerisations -/Depolymerisations-Gleichgewichts der Cld-Stränge ist daher wahrscheinlich. Insgesamt tragen die durchgeführten Untersuchungen zu einem besseren Verständnis der TJ-Struktur bei. Zudem ermöglicht die Charakterisierung der CPE-Cld- bzw. Cld-Cld-Interaktion die Entwicklung von Peptiden oder niedermolekularen Substanzen, die gezielt TJs modulieren, um so z. B. die Wirkstoffzufuhr ins Gehirn zu verbessern., In multicellular organisms, epithelia and endothelia form barriers to maintain the function of organs, but also to prevent the passage of drugs. To prevent diffusion of water soluble molecules through the paracellular pathway, the intercellular space between adjacent epithelial or endothelial cells is sealed by tight junctions (TJ). TJs appear in freeze-fracture replicas as intramembranous networks of strands on the apical end of the lateral surface of the cells. Structural backbone of the TJs in the specifically tight blood- brain barrier are the claudins (cld) 3 and 5. Cld5 is sealing the TJs of the blood-brain barrier for molecules