Search

Connexin 43 (Cx43) is essential for cardiac electrical coupling, but its effects on myocardial fibrosis is controversial. Here, we analyzed the role of Cx43 in myocardial fibrosis caused by angiotensin II (AngII) using Cx43fl/fl and Cx43Cre-ER(T)/fl inducible knock-out (Cx43 content: 50%) mice treated with vehicle or 4-hydroxytamoxifen (4-OHT) to induce a Cre-ER(T)-mediated global deletion of the Cx43 floxed allele. Myocardial collagen content was enhanced by AngII in all groups (n = 8&ndash, 10/group, p &lt, 0.05). However, animals with partial Cx43 deficiency (vehicle-treated Cx43Cre-ER(T)/fl) had a significantly higher AngII-induced collagen accumulation that reverted when treated with 4-OHT, which abolished Cx43 expression. The exaggerated fibrotic response to AngII in partially deficient Cx43Cre-ER(T)/fl mice was associated with enhanced p38 MAPK activation and was not evident in Cx43 heterozygous (Cx43+/-) mice. In contrast, normalization of interstitial collagen in 4-OHT-treated Cx43Cre-ER(T)/fl animals correlated with enhanced MMP-9 activity, IL-6 and NOX2 mRNA expression, and macrophage content, and with reduced &alpha, SMA and SM22&alpha, in isolated fibroblasts. In conclusion, our data demonstrates an exaggerated, p38 MAPK-dependent, fibrotic response to AngII in partially deficient Cx43Cre-ER(T)/fl mice, and a paradoxical normalization of collagen deposition in animals with an almost complete Cx43 ablation, an effect associated with increased MMP-9 activity and inflammatory response and reduced fibroblasts differentiation.

La mort cel·lular que ocorre durant un episodi d’oclusió coronària és directament proporcional a la durada de la isquèmia. Per això, el tractament d’elecció enfront l’infart de miocardi és la ràpida reobertura de l’arteria afectada. Ara bé, el restabliment del flux sanguini s’associa amb un dany addicional, conegut com a dany per reperfusió, degut, en part, a una excessiva producció de radicals lliures d’oxigen (ROS). Per tal de reduir l’efecte deleteri d’aquest estrès oxidatiu s’han testat diferents molècules antioxidants, amb resultats contradictoris. Una nova aproximació podria ser la inhibició directa de la producció de ROS, modulant la funció mitocondrial. Estudis recents han suggerit que part dels ROS produïts durant la reperfusió són deguts a transferència reversa d’electrons des del complex II (o succinat deshidrogenasa) de la cadena de transport mitocondrial cap al complex I. L’objectiu de la present tesi ha estat investigar els efectes de la inhibició reversible de la succinat deshidrogenasa mitocondrial amb malonat disòdic, administrat en el moment de la restauració del flux, sobre el dany miocàrdic per reperfusió, així com estudiar els mecanismes involucrats. En cors aïllats de ratolí, perfosos en un sistema de Langendorff, l’administració de malonat sota condicions normòxiques va produir una reducció concentració-depenent de la pressió desenvolupada del ventricle esquerre, corroborant el seu efecte depressor de la respiració mitocondrial. Posteriorment, cors aïllats de ratolí addicionals van ser sotmesos a isquèmia-reperfusió, sent tractats o no amb malonat 3 mM durant els primers 15 minuts de la reperfusió. L’administració de malonat va reduir de forma significativa la mida de l’infart, efecte associat amb una menor alliberació de LDH durant la reperfusió i amb una millor recuperació funcional. Estudis de ressonància magnètica nuclear van demostrar l’existència de canvis en el perfil metabòlic dels cors tractats amb malonat, amb una augment en la concentració de succinat. Mitjançant tècniques d’immunofluorescència i marcatge amb MitoSOX Red de mostres de teixit miocàrdic es va demostrar que el tractament redueix la producció de ROS. Aquesta disminució també es va observar en mitocondris aïllats de cors de ratolí, tractats in vitro tant amb succinat com amb malonat, juntament amb una reducció en l'obertura del porus de transició mitocondrial. Seguidament, vam analitzar si els efectes protectors del malonat persisteixen en un model animal clínicament més rellevant, com el model porcí d’oclusió coronària transitòria. En aquest model l’administració de malonat es va realitzar de manera intracoronària. En condicions basals, tan sols una concentració de malonat de 50 mmol/L, però no inferiors, va reduir l'escurçament miocàrdic a la regió irrigada per l'artèria d’interès, però no en regions distants. Per estudiar els efectes de la inhibició reversible de la succinat deshidrogenasa sobre el dany per reperfusió, els animals van ser sotmesos a oclusió coronària de l'artèria coronària descendent anterior (40 min), seguida de reperfusió, i van ser tractats o no amb malonat 10 mmol/L, durant els 5 minuts inicials de la mateixa. L'administració selectiva de malonat a l'àrea en risc va reduir la mida de l’infart, sense afectar a la incidència d’arrítmies ventriculars malignes durant la reperfusió, així com tampoc la contractilitat del miocardi distant. Aquest efecte protector es va associar amb una reducció en la producció de ROS (MitoSOX Red). En conclusió, la inhibició reversible de la succinat deshidrogenasa amb malonat disòdic a l’inici de la reperfusió és cardioprotectora enfront l’infart de miocardi, tant en cors aïllats de ratolins com en un model porcí d’oclusió coronària transitòria. Aquest efecte és degut a una menor acumulació tissular de succinat, amb la consegüent reducció en la transferència reversa d’electrons cap al complex I mitocondrial, en la producció de ROS i en l’obertura del porus de transició mitocondrial. Cell death that occurs during an episode of coronary occlusion is directly proportional to the duration of ischemia. Therefore, the treatment of choice against myocardial infarction is the rapid reopening of the affected artery. However, the restoration of blood flow is associated with an additional damage, known as reperfusion injury, due to excessive production of reactive oxygen species (ROS). As a way to reduce deleterious effects of oxidative stress, different antioxidant molecules have been tested, but with contradictory results. A new approach could be to inhibit directly ROS production, by mitochondrial function modulation. Recent studies have suggested that some of ROS produced during reperfusion are due to reverse electron transfer from complex II (or succinate dehydrogenase) of the mitochondrial electron transport chain to complex I. The objective of this thesis has been to investigate the effects of reversible inhibition of mitochondrial succinate dehydrogenase with disodium malonate, administered at the moment of the restoration of the flow, on reperfusion injury, as well as to study the mechanisms involved. Administration of malonate, under normoxic conditions in isolated mice hearts perfused in a Langendorff system, induced a concentration-dependent reduction in left ventricular developed pressure, confirming an inhibitory action on mitochondrial respiration. Thereafter, additional isolated mice hearts were subjected to ischemia-reperfusion and were treated or not with 3 mM malonate, given during the first 15 minutes of reperfusion. Administration of malonate significantly reduced infarct size that was associated with a lower LDH release during reperfusion and with a better functional recovery. Nuclear magnetic resonance studies demonstrated the existence of differences in the metabolic profile between hearts treated with malonate, with increased succinate concentration. In addition, MitoSOX Red staining of myocardial tissue samples revealed that malonate treatment was associated with a reduction in ROS production. This decrease was also observed in isolated mitochondria obtained from mice hearts, treated in vitro with both succinate and malonate, that also depicted a reduction in mitochondrial permeability transition pore opening. Moving forward, we analyzed whether the protective effects of malonate persist in a more clinically relevant animal model, the porcine model of transient coronary occlusion. In this model we selectively administer malonate with intracoronary infusion. Under baseline conditions, only malonate of 50 mmol/L, but not lower concentrations, resulted in a significant reduction in systolic segment shortening in the myocardial region irrigated by the artery of interest, but not in distant regions. To analyze the effects of reversible inhibition of succinate dehydrogenase on reperfusion injury, animals were subjected to left anterior descending coronary artery occlusion (40 minutes), followed by reperfusion, and they were treated or not with malonate 10mmol/L, during the first 5 minutes of the same. Selective administration of malonate into the risk area significantly reduced infarct size, without changes in the incidence of malignant ventricular tachyarrhythmias during reperfusion, or in the contractility of remote myocardium. This cardioprotective effect was associated with a reduction in ROS production (MitoSOX Red). In conclusion, reversible inhibition of succinate dehydrogenase with disodium malonate at the onset of reperfusion has cardioprotective effects against myocardial infarction, both in isolated mice hearts and in a porcine model of transient coronary occlusion. This effect is due to a lower succinate accumulation in the tissue, resulting in a reduction of reverse electron transfer to complex I, reduced ROS production and mitochondrial permeability transition pore opening.