Search

…

Amaç: Gen ekspresyonunun transkripsiyonel regülasyonunda anahtar role sahip STAGA protein kompleksinin katalitik alt birimlerinin protein-protein etkileşimlerinin belirlenmesi amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Tez kapsamında belirlenmesi amaçlanan protein-protein etkileşimleri ilk olarak maya 2 hibrit teknoloji kullanılarak in vivo analizlenmiştir. Çalışılan proteinler insan proteinleri olduğu için maya 2 hibrit yöntemi ile maya hücrelerinde belirlenen etkileşimlerin doğrulanması amacıyla insan hücre hatlarında spesifik antikorlar varlığında eş-immün çöktürme analizleri yapılmıştır. Fiziksel olarak etkileşimleri test edilen proteinlerin aynı hücre kompartmanında bulunduklarının incelenmesi için floresan mikroskop altında eş-lokalizasyonları görüntülenmiştir.Bulgular ve Sonuçlar: Tez kapsamında STAGA kompleksi histon asetiltransferaz modülü alt birim proteini ADA3'ün etkileşim partner proteinleri; AATF, PHF21A, PPP2R5D ve PPP1R7'nin modülün enzimatik aktivitesinden sorumlu GCN5 ile etkileşimleri ve etkileşimlerden sorumlu gen bölgeleri maya 2 hibrit yöntemi ile belirlenmiştir. Memeli hücrelerinde ADA3 partner proteinlerinin kompleksin deubikütinaz enzimatik aktivitesine sahip diğer modülünün alt birimleri USP22, ATAXIN7L3 ve ENY2 ile etkileştikleri gözlenmiş ve floresan mikroskopi ile eş-lokalizasyonları görüntülenmiştir. STAGA'nın kompleks içindeki etkileşimlerinin spinoserebellar ataksi 7 hastalığındaki rollerini anlamak için ADA3'ün ATAXIN7'nin yabanıl tip ve mutant formu ile etkileşimleri maya 2 hibrit yöntemi ile analizlenmiş ve belirlenen etkileşimler memeli hücrelerinde incelenerek doğrulanmıştır.Anahtar Sözcükler: Transkripsiyonel regülasyon, histon asetil transferazlar, maya 2 hibrit, protein-protein etkileşimleri, eş-immün çöktürme. Aim: It is aimed to determine the protein-protein interactions of the catalytic subunits of STAGA protein complex, which has a key role in the transcriptional regulation of gene expression.Material Methods: The protein-protein interactions to be determined in the context of the thesis were first in vivo analyzed using yeast two hybrid technology. Since the proteins studied are human proteins, co-immuneprecipitation analyses were performed in the presence of specific antibodies using human cell lines to confirm the interactions determined in yeast cells by the yeast two hybrid method. Co-localizations were visualized under the fluorescence microscope to analyze the physically interacting proteins that were tested in the same cell compartment.Results and Conclusion: The interaction partner proteins of STAGA complex histone acetyltransferase module subunit protein ADA3 which are AATF, PHF21A, PPP2R5D and PPP1R7 with GCN5 responsible for the enzymatic activity of the module and gene regions responsible for interactions were determined by yeast two hybrid method within the scope of the thesis. ADA3 partner proteins were observed to interact with subunits USP22, ATAXIN7L3 and ENY2 of the other module of the complex with deubiquinase enzymatic activity, and their co-localization were monitorized by fluorescence microscopy in mammalian cells. To understand the role of the internal interactions of the STAGA in spinocerebellar ataxia 7 disease, the interactions of ADA3 with the wild-type and mutant form of ATAXIN7 were analyzed by yeast-two hybrid method and the determined interactions were verified in mammalian cells.Keywords: Transcriptional regulation, histone acetyl transferases, yeast two hybrid, protein-protein interactions, co-immunoprecipitation. 166

Acquired resistance to anti-cancer therapy is common and is a major clinical issue. Functional DNA repair pathways provide a common mechanism for drug resistance, but it can also result from mutations or reduced expression of the targeted protein. The overexpression or nuclear localisation of the multifunctional Y-box binding protein (YB-1) is considered as a prognostic marker for drug resistance in tumours. YB-1 has several interaction partners in cells; in this study, we have focused on its interaction with the human DNA repair enzyme NTH1 (hNTH1) and human DNA topoisomerase I (hTopoI), two enzymes that have been shown to be stimulated by YB-1. The abundance of the hNTH1/YB-1 complex was shown to increase in cisplatin-resistant tumour cells. Human TopoI is an essential enzyme involved in cellular regulation of DNA supercoiling and is the target of several anti-cancer agents. YB-1 enhances the activity of hTopoI and its sensitivity to hTopoI inhibitor, camptothecin in tumour cells. We have characterised the YB-1/hNTH1 and YB-1/hTopoI complexes in vitro and in vivo using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements to identify and develop new strategies for the treatment of drug-resistant tumours. We also designed and optimised an original FRET-based biosensor to screen two medium-sized chemical libraries in order to find potential inhibitors of the hNTH1/YB-1 complex. Several "hits" were identified that significantly reduced the FRET level of our biosensor. For some of these compounds, we have reproduced these results starting from powders, have performed dose-response curves and have validated their actions as inhibitors of the hNTH1/YB-1 interface using alternative binding assays. Taken together, our results demonstrate that YB-1 directly interacts and stimulates a DNA repair and a DNA relaxing enzyme and targeting the YB-1/hNTH1 interface represents an interesting new strategy for the development of anti-cancer drugs., Anti-kanser tedavisine karşı kazanılan direnç yaygın ve önemli bir klinik sorundur. Fonksiyonel DNA onarım yolları, ilaç direnci için yaygın bir mekanizma sağlamaktadır, ancak aynı zamanda, hedeflenen proteinin mutasyonlarından veya ekspresyonunun azalmasından da kaynaklanabilmektedir. Çok işlevli Y-box bağlanma proteinin (YB-1) aşırı ekspresyonu veya nükleer lokalizasyonu, tümörlerde ilaç direnci için bir prognostik belirteç olarak kabul edilmektedir. YB-1'in hücrelerde birkaç etkileşim partneri vardır; bu çalışmada, YB-1 ile aktiviteleri uyarıldığı gösterilen insan DNA onarım enzimi NTH1 (hNTH1) ve insan DNA topoizomeraz I (hTopoI) ile olan etkileşimleri üzerine odaklandık. Cisplatin-dirençli tümör hücrelerinde hNTH1/YB-1 kompleks oluşumunun arttığı gösterilmiştir. İnsan TopoI, DNA süpersarmallarının hücresel regülasyonunda yer alan ve birkaç anti-kanser ajanının hedefi olan önemli bir enzimdir. YB-1, hTopoI aktivitesini ve tümör hücrelerinin hTopoI inhibitörü Campthotecin'e olan duyarlılığını artırmaktadır. Bu çalışmada YB-1/hNTH1 ve YB-1/hTopoI komplekslerini in vitro ve in vivo olarak, ilaca dirençli tümörlerin tedavisi için yeni stratejiler tanımlamak ve geliştirmek için Fluoresans Rezonans Enerji Transferi (FRET) ölçümlerini kullanarak karakterize ettik. Ayrıca, hNTH1/YB-1 kompleksinin potansiyel inhibitörlerini bulmak için iki orta ölçekli kimyasal kütüphaneyi taramak üzere orijinal bir FRET-bazlı biyosensör tasarladık ve optimize ettik. Biyosensörümüzün FRET seviyesini önemli ölçüde azaltan birkaç "hit" tespit ettik. Bu bileşiklerin bazıları için, toz bileşiklerden başlayarak bu sonuçları tekrar ürettik, doz-cevap eğrileri gerçekleştirdik ve alternatif bağlama deneyleri kullanarak hNTH1/YB-1 arayüzünün inhibitörleri olarak onayladık. Birlikte ele alındığında, sonuçlarımız YB-1'in DNA onarımı ve DNA relakse edici enzimleriyle doğrudan etkileşime girip uyardığını ve YB-1/hNTH1 arayüzünü hedef almanın, anti-kanser ilaçlarının geliştirilmesi için ilginç yeni bir stratejiyi temsil ettiğini göstermektedir.

DNA topoizomerazlar replikasyon, transkripsiyon, rekombinasyon gibi hayati öneme sahip hücresel basamaklarda fonksiyonlara sahip olan enzimlerdir. Bu enzimler, DNA üzerinde geçici kırıklar oluşturarak molekülün kimyasal yapısını etkilemeden üç boyutlu yapısını değiştirirler. Tek zincir üzerinde veya çift zincir üzerinde kırık oluşturmalarına göre tip I ve tip II olarak iki alt sınıfa ayrılan bu enzim grubu, antikanser tedavilerde önemli hedef moleküller olarak nitelendirilmektedir. Özellikle tip II sınıfına ait topoizomeraz II enzimi proliferasyonda oynadığı rol sebebiyle tümör hücrelerinin büyümesini engellemek adına uygulanan tedavilerde kimyasal ajanların öncelikli hedefi durumundadır. Çalışmamızda antikanser etkinliği kanıtlanmış eliptisin maddesinin sentetik türevlerinin topoizomeraz enzimleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Enzimlerin temel reaksiyonları olan relaksasyon ve dekatenasyon reaksiyonlarına etkileri ayrı ayrı irdelenmiş, inhibisyon mekanizmalarını aydınlatmak amacıyla DNA üzerinde enzim-aracılı kırık oluşumuna neden olup olmadıkları test edilmiştir. Ardından maddelerin interkalatör özellikleri incelenerek çalışmamız ayrıntılandırılmıştır., DNA topoisomerases are among the most important group of enzymes having vital cellular roles in replication, transcription and recombination. These enzymes change the three dimensional structure of DNA without affecting chemical structure through transient breaks. Topoisomerases, which are classified as type I and type II according to whether they produce single or double strand breaks in their reaction mechanisms are qualified as popular targets for anticancer drugs. In particular, topoisomerase II enzyme that belongs to type II class comprises preferential targets in chemotherapy due to their roles in cellular proliferation. In this study, newly synthesized ellipticine derivatives were investigated to assess their effects on topoisomerases. Their effects on main reactions of topoisomerases, relaxation and decatenation, have been examined with the experiments to reveal whether they affect the rate of DNA cleavage by topoisomerases. Our study was detailed by investigating their intercalative properties.

DNA topoizomerazlar hücrede replikasyon, transkripsiyon ve rekombinasyon gibi yaşamsal fonksiyonlarda görev alan enzimlerdir. Bu enzimler, DNA zincirlerinde düzenli kırıklar oluşturup bu kırıkları tekrar birleştirerek DNA?da kimyasal yapıyı değiştirmeden konformasyonel dönüşümleri katalizlerler. Reaksiyon mekanizmalarının farklı olması temelinde tip I ve tip II topoizomerazlar olarak iki gruba ayrılırlar. Topoizomerazlar son yıllarda anti-kanser ilaç geliştirilmesi çalışmalarında yaygın hücresel hedefler olarak rapor edilmektedirler. Ancak bu enzimleri hedefleyen bileşiklerin biyolojik önemleri hakkında güvenilir sonuçlar elde etmek için DNA-enzim kompleksi ile etkileşimleri kapsamlı analizlerle incelenmelidir. Çalışmamızda, DNA metilleyici anti-kanser ajanı olan Temozolomid?in topoizomeraz enzimleri üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Hipotezimiz, Temozolomid ile muamele edilmiş DNA?nın metillenmesi sonucunda oluşan yapının topoizomeraz enzimlerinin aktivitelerini değiştirerek etkili olabileceğidir. Bileşiğin, memeli tip I ve tip II topoizomeraz ile etkileşimleri, sırasıyla süpersarmal relaksasyon ve dekatenasyon reaksiyonları ile incelenmiştir. Çalışmamız Temozolomid bileşiğinin kovalent kompleks, ayrıştırma kinetiği ve kırık oluşturma analizleriyle topoizomeraz I ve II?nin bağlanma bölgelerindeki etkisi incelenerek zenginleştirilmiştir. Çalışmamızın son bölümü bileşiğin topoizomerazlarla etkileşimi için ökaryotik model oluşturan S. cerevisiae ile gerçekleştirilen hassasiyet ve spot testlerinden oluşmuştur. DNA topoisomerases are the enzymes involved in vital functions such as replication, transcription and recombination in the cell. These enzymes catalyze conformational changes in DNA topology without altering the chemical structure of DNA. These enzymes are classified as type I and type II topoisomerases according to the reaction mechanisms. Over the last years, topoisomerases have been reported as the popular cellular targets in anti-cancer drug development studies. However, reliable results about the biological importance of topoisomerase targeting drugs require comprehensive analyses of the interactions between DNA-enzyme complex and them. In our study, we investigated the effect of DNA methylating anti-cancer agent Temozolomide on topoisomerase enzymes. We hypothesized that the sturucture which occurs as a result of treated DNA with Temozolomide, could interfere with the completion of the activity of topoisomerase enzymes. The interaction of the compound with mammalian type I and type II topoisomerases were investigated using supercoil relaxation and mini-circle decatenation reactions, respectively. Our study was enriched with the investigation of the effect of Temozolomide on topoisomerase I and II binding regions with covalent-complex and strand cleavage analyses. Finally, our study was extended to cover yeast sensitivity and spot tests which performed with S. cerevisiae forms an eukaryotic model for the interaction of compound with topoisomerases. 79

Ökaryotik hücrelerde DNA, histon proteinleriyle etkileşimler oluşturarak kromatin yapısında paketlenmekte ve bu yapılanma gen ekspresyonunun regülasyonu üzerinde önemli etkiler oluşturmaktadır. Hücrede kromatinin yeniden modelleme/modifikasyon aktiviteleri sonucu değiştirilen kromatin yapısı trankripsiyon mekanizmasının bileşenleri tarafından kolaylıkla tanınabilmektedir. Genellikle `adaptör' adı verilen bir protein ailesi, transkripsiyonel aktivatörlerin genel transkripsiyon mekanizması ile etkileşimlerine yardımcı olarak transkripsiyonu kolaylaştırmaktadır. Bu mekanizma içerisinde yer alan ve temel olarak ADA2, ADA3 ve GCN5 proteinlerinden oluşan ADA transkripsiyonel ko-aktivatör kompleksi gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli roller üstlenmektedir. Bu çalışma, ADA kompleksinin temel bileşeni olan insan ADA3 (human ADA3: hADA3) proteini ile diğer transkripsiyonel regülatörler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesini amaçlamış ve sonuçlarımız ilgilendiğimiz proteinin dört yeni etkileşim partneri olduğunu göstermiştir. In vivo sonuçlar vermesi ile öne çıkan bir yöntem olan maya 2 hibrit (Yeast 2 Hybrid: Y2H) yöntemi ile fetal insan beyin cDNA kütüphanesi tarayarak gerçekleştirdiğimiz bu çalışmamız kapsamında hADA3 proteininin etkileşim bölgeleri belirlenmiş ve biyolojik/biyokimyasal deneylerle etkileşimler teyid edilmiştir. Bu etkileşim partnerlerinin analizi, RNA pol II aracılı transkripsiyon mekanizmasında görev alan transkripsiyon komplekslerinin karakterizasyonu konusunda yeni bilgiler kazandırmış olması bakımından önemlidir. In eukaryotes, DNA is packaged into chromatin by extensive interactions with histone proteins, a phenomenon known to have significant impacts on the regulation of gene expression. In response to this phenomenon, chromatin remodelling and chromatin modifying activities within the cell give rise to an altered chromatin structure accessible to, and recognized by the components of the transcriptional machinery. One family of these proteins, often referred as adaptors, mediators or co-activators facilitate transcription possibly by promoting the interactions between transcriptional activators and general transcriptional machinery. One of the component of this mechanisims ADA transcriptional co-activator complex, composed of ADA2, ADA3, and GCN5 proteins. The aim of this study was to identify new interaction partners of hADA3 protein, a key component of ADA complex, and our results showed four new interaction partners for the protein of our interest. Unlike the conventional techniques, our study employed Yeast 2 Hybrid (Y2H) methodology that differs from the others by detecting in vivo interactions, for screening a human fetal brain cDNA library; we located the regions of importance for interactions and provided biological biochemical data to verify the detected interactions. The analysis of hADA-interacting partners is important in the sense of characterizing the transcriptional complexes which have a function in RNA pol II mediated transcriptional regulation. 142

Böbrek yetmezliği ülkemizde ve tüm dünyada önemli bir sağlık sorunudur. Bu nedenle iskemik akut böbrek yetmezliği için etkin tedavi yöntemleri geliştirilmelidir. İskemi, hücrede enerji düzeyinin düşmesine ve toksik metabolitlerin dokuda birikmesine yol açarak hücre disfonksiyonu ve sonrasında hücre ölümüne kadar gidebilen bir dizi biyokimyasal reaksiyonu başlatır. Özellikle reperfüzyon sonrası ortama gelen nötrofiller ve açığa çıkan medyatörlerin zararlı etkileri de eklenince organ veya doku ölümü kaçınılmaz olmaktadır. Bu tez çalışmasında Wistar albino türü erkek sıçanda oluşturulan böbrek iskemi-reperfüzyon hasarında poliferatif, nekrotik ve apoptotik hücre oranları belirlendi ve telomerik devamlılığı araştırıldı. Tez kapsamında ilk olarak sıçan sol böbrek dokularında 60 dakika boyunca iskemi oluşturuldu ve sağ böbrekler kontrol grubu olarak kullanıldı. Bu çalışmaya paralel olarak iskemi öncesi antioksidan ajan enjekte edilen sıçanlarda aynı işlemler tekrar edilerek kullanılan NAC antioksidan ajanın apoptoz üzerine etkisi belirlendi. Telomerik restriksiyonel fragmantasyon (TRF) yöntemi ile telomerik tekrar devamlılığı apoptoz ilişkisi incelendi. Kidney failure is an important health issue in both our country and the world. Therefore effective treatment strategies need to be emerged to cure acute kidney failure. Ischemia initiates a series of biochemical reactions that may end up with cellular dysfunction and ultimate cell death by causing to diminish cellular energy level and accumulation of toxic subtances. Tissue and organ death is therefore an inevitable result due to added harms exerted by neutrophils, which arose following reperfusion and liberated mediators. This thesis covered the estimation of the percentage apoptotic cell death and telomeric maintenance in kidney ischemia/reprfusion model to be established in Wistar albino rats. First of all, ischemia was made in rat left kidney and the irght was was used as a control. And then the presence of the apoptotic cell was investaigated in reperfused kidney. On the other side, antioxidant agent was injected to rats before ischemia and the effect of N-acetylcystein was tested on the apoptosis as a antioxidant agent. Finally, the realtionship between apoptosis and telomeric repeat persistance was examined using telomeric restrictional fragmentation (TRF) method. 62

DNA topoizomerazlar, DNA yapısında konformasyonel değişiklikleri düzenleyerek önemli hücresel faaliyetlerin gerçekleşmesini sağlayan enzimlerdir ve çok sayıda anti-kanser ilacın hücre içi hedefi olarak karakterize edilmişlerdir. Topoizomeraz hedefleyen bileşiklerin biyolojik önemleri hakkında güvenilir sonuçların alınabilmesi için DNA-enzim kompleksi ile etkileşimleri ile ilgili kapsamlı analizlere ihtiyaç duyulmaktadır. Bu çalışmada bazı kanser türlerinin tedavisinde etkili olan Bortezomib bileşiğinin topoizomeraz enzimleri ile etkileşimleri araştırılmıştır. Hipotezimize temel olan yaklaşım rapor edilen hücre kültürü çalışmalarında Bortezomib ile gözlenen etkilerin hücre proliferasyonunda önemli rolleri ile tanınan DNA topoizomeraz enzimleri aracılığı ile gerçekleşiyor olabileceğidir. Bileşiğin topoizomeraz enzimleri ile etkileşimi insan tip I ve tip II topoizomeraz enzimleri kullanılarak sırasıyla süpersarmal relaksasyon ve dekatenasyon reaksiyonları ile incelenmiştir. Çalışmamızda topoizomerazların Bortezomib varlığında substrat-ürün dönüşümü profilleri bileşiğin DNA kırıkları oluşturma potansiyelinin incelenmesi ile zenginleştirilmiştir. Testlerimizin son aşaması ise S. cerevisiae hücreleri ile yapılan hassasiyet ve spot testlerini kapsamış, elde edilen sonuçlar etkilerini topoizomeraz reaksiyonlarını hedefleyerek gösterdikleri bilinen yapılarla karşılaştırılmıştır. DNA topoisomerases regulate conformational changes in DNA topology during cellular processes and have been characterized as the cellular targets of a number of anti-cancer drugs. Reliable results about the biological importance of topoisomerase targeting drugs require comprehensive analyses of the interactions between DNA-enzyme complexes and topoisomerase targeting drugs. In this study, interactions between topoisomerase and Bortezomib, a clinically significant compound with reported anti-proliferative efects in some types of cancer cells was investigated. The rationale of our approach is based on the results obtained with Bortezomib could be mediated via topoisomerase reactions as these enzymes have important roles in cell proliferation. The interaction of the compound with human type I and type II topoisomerases were investigated using supercoil relaxation and mini-circle decatenation reactions, respectively. Both reaction types have been intensively employed in literature. The substrate to product conversion profiles of the enzymes in the presence of Bortezomib were enriched with the investigation of the potential of the compound to generate strand breaks. Finally, our study was extended to cover yeast sensitivity and spot tests, the results were compared to the compounds known to exert their effects through topoisomerase enzymes. 76

Transmissible spongiform ensefalit (TSE) olarak da bilinen Prion hastalığı sığırlarda Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE), insanlarda Creutfeld-Jakob Disease (CJD), koyunlarda scrapie olarak isimlendirilen bir grup ölümcül nörodejeneratif hastalıklar olarak tanımlanır. Prion hastalıkları, prion proteinlerinin (Prpc) normal hücresel formlarının yanlış katlanmış patojenik forma (Prpsc) dönüşmesi ile ilişkilidir. Prion genlerinin keşfedilmesi ile birlikte bu alanda yoğun çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. SPRN (Shadow of Prion Protein) geni, dört farklı üyeden oluşan prion gen ailesinin bir üyesidir. SPRN erişkin merkezi sinir sisteminde yüksek derecede, testislerde az miktarda eksprese edilen Shadoo (sho) proteinini kodlar. SPRN aynı zamanda atasal bir gendir. Bu çalışmanın amacı cinsiyete bağlı olarak Türk koyunlarında ve koçlarında muhtemel polimorfizmleri saptamak ve bu polimorfizmlerin fenotip üzerindeki etkilerini belirlemektir.

Ökaryotik hücrelerde DNA, histon proteinleriyle etkileşimler oluşturarak kromatin yapısında paketlenmekte ve bu yapılanma gen ekspresyonunun regülasyonu üzerinde önemli etkiler oluşturmaktadır. Hücrede kromatinin yeniden modelleme/modifikasyon aktiviteleri sonucu değiştirilen kromatin yapısı trankripsiyon mekanizmasının bileşenleri tarafından kolaylıkla tanınabilmektedir. Genellikle 'adaptör' adı verilen bir protein ailesi, transkripsiyonel aktivatörlerin genel transkripsiyon mekanizması ile etkileşimlerine yardımcı olarak transkripsiyonu kolaylaştırmaktadır. Bu mekanizma içerisinde yer alan ve temel olarak ADA2, ADA3 ve GCN5 proteinlerinden oluşan ADA transkripsiyonel koaktivatör kompleksi gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli roller üstlenmektedir. Bu çalışma, ADA kompleksinin temel bileşeni olan insan ADA3 (human ADA3: hADA3) proteini ile diğer transkripsiyonel regülatörler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesini amaçlamış ve sonuçlarımız ilgilendiğimiz proteinin dört yeni etkileşim partneri olduğunu göstermiştir. In vivo sonuçlar vermesi ile öne çıkan bir yöntem olan maya 2 hibrit (Yeast 2 Hybrid: Y2H) yöntemi ile fetal insan beyin cDNA kütüphanesi tarayarak gerçekleştirdiğimiz bu çalışmamız kapsamında hADA3 proteininin etkileşim bölgeleri belirlenmiş ve biyolojik/biyokimyasal deneylerle etkileşimler teyid edilmiştir. Bu etkileşim partnerlerinin analizi, RNA pol II aracılı transkripsiyon mekanizmasında görev alan transkripsiyon komplekslerinin karakterizasyonu konusunda yeni bilgiler kazandırmış olması bakımından önemlidir.

Bu tezde C.reinhardtii P.A.Dang 'de ışığın algılanmasında görevli, cis-trans bir protein olduğu ve enzimatik etkisi olduğu düşünülen fakat günümüzde hala hangi koşullar altında potansiyel enzim aktivitesi gösterdiği bilenmemekte olan, Chlamyopsin-5 sensory rhodopsin (Cop5) proteininin (XM_001701571) cDNA dizisine spesifik primerler dizayn ederek mRNA düzeyinde bu genin ekspresyonunun ışık değişimine bağlı olarak nasıl değiştiği incelenmiştir. Bu inceleme sürecinde de DNA izolasyonu, RNA izolasyonu, mRNA seçilimi, cDNA sentezi ve PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) işlemleri yapılmış, bu işlemlerde karşılaşılan güçlükler, olası çözüm yolları ve sonuçlar da belirtilmiştir. In this thesis, Chlamyopsin-5 sensory rhodopsin (Cop5) (XM_001701571) protein which is considered to be functionary at light sensation as a cis-trans protein and has enzymatic activity in C.reinhardtii P.A.Danger. However, contemporary it is not clear in which conditions this protein has potential enzymatic activity. Specific primers are designed with regard to cDNA sequence then the light dependency gene expression is investigated in level of mRNA. During this process, DNA, RNA and mRNA was isolated, cDNA synthesis and PCR (Polymerase Chain Reaction) analysis were done. In this study, the potential problems to occur are discussed and prospective solutions and results are showed. 93

Sitokrom CYP450 enzimleri, yapısında demir grubu içeren ilaçlar ve bir çok karsinojen maddeler dahil, geniş bir aralığa ait zenobiyotik metabolizmasında görev alan bir enzim süper ailesidir. CYP enzimlerinin aile ve alt aileleri aminoasit dizilimi yönünden benzerliklerine göre değerlendirilmektedirler. Son yıllarda CYP' lerin kanserle ilişkisi hakkında çok sayıda araştırma yapılmıştır. Bu enzimlere ait genler genellikle karaciğerde eksprese olmaktadır. Ekspresyonları ise genellikle doku spesifikliği göstermektedir. 20 CYP enzimi insan dokularında tanımlanmakla birlikte mide dokusunda CYP ekspresyonu çalışması yeterli sayıda yapılmamıştır. Bu enzimlerin gastrointestinal sistemdeki ekspresyonuna bağlı endojen ve zenobiyotik enzim metabolizmasını daha iyi anlayabilmek için revers transkriptaz RT-PCR yöntemi ile mide dokusunda mRNA ekspresyonunu inceledik. Kullandığımız spesifik primerler yardımı ile CYP -1A1, -1A2, -2B6, -2C, -2D6, -2E1, ve -3A5' in doku spesifik mRNA ekspresyonunu araştırdık. Doku spesifik CYP ekspresyonunun incelenmesi ile bir çok kimyasal karsinojenin doku spesifikliği ve ayrıca ilgili terapötik ajanların vücudu zenobiyotiklere karşı potansiyel koruma görevinin etkileri daha iyi açıklanabilecektir.Anahtar kelimeler : Sitokrom P450, Mide dokusu, ilaç metabolize eden enzimler. Cytochrome P450 (CYP) is a heme-containing enzyme superfamily metabolizing a wide variety of xenobiotics, including drugs and carcinogens. The CYP families and subfamilies are defined on the basis of their amino acid sequence similarities. Over the past years there have been an increased number of researches on the relationship between CYPs and cancer. The majority of these genes are expressed most abundantly in liver. The regulation of CYP expression is, in part, tissue-specific. Approximately 20 individual CYPs have been identified in human, however relatively little is known about the individual CYP forms present in stomach tissues. To understand more thoroughly the function of CYP systems in human gastrointestinal system and their significance in the metabolism of xenobiotics and endogenous compounds, we analyzed the mRNAs for the CYPs in stomach tissue samples using reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) method. The mRNA detections were made by using specific primers for CYPs -1A1, -1A2, -2B6, -2C, -2D6, -2E1, and -3A5. The tissue specificity of CYP expression may possibly underlie the organ specificity of chemical carcinogens and their potential roles in the protection of the body against xenobiotics as well as influence in the bioavailability of therapeutic compounds.Key Words: Cytochrome P450, stomach tissue, drug metabolizing enzymes. 72

Telomerler ökaryotik kromozom uçlarında bulunan, DNA ve proteinden olusanyapılardır. Kanser ve insan esey hücreleri de dahil olmak üzere ölümsüz ökaryotikhücrelerde telomer devamlılıgı telomeraz enzimi ile saglanır. Ancak telomer boylarınındevamlılıgının saglanmasında telomeraz enzimi dısında ?Alternatif Telomer Uzaması? olarakadlandırılan baska mekanizmaların da var oldugu düsünülmekte, ancak bu mekanizmalarhakkında çok az sey bilinmektedir. Çalısmamız, insan telomerik yapılarına benzerligi ilebilinen Kluyveromyces lactis modeliyle telomerazdan bagımsız telomer devamlılıgını vebunun farmasötik önemini arastırmayı amaçlamıstır. Telomer, telomeraz ve bu enziminetkilesimde bulundugu telomerik proteinler, umut verici antikarsinojenik ilaç hedefleri olarakdegerlendirildiginden, sonuçlarımız, alternatif telomer uzaması mekanizmalarının, antikansertedavi stratejilerinin hedefi olarak kullanılması konusunda yeni tartısmalar açacaktır.Anahtar sözcükler: Telomer, rekombinasyon, alternatif telomeruzaması, antikanser ilaç hedefi.E-posta: bilge.debelec@ege.edu.tr Telomeres are the DNA-protein complexes found at the ends of eukaryoticchromosomes. Most immortal cells, including cancer cells and human germinal cellsmaintain the telomeric length by the enzyme, telomerase. However, the telomeric lengthmaintenance is also thought to be carried out by the pathways called ?AlternativeLengthening of Telomeres /ALT? other than telomerase but little is known about themechanism of these alternative pathways. This thesis aimed to study telomeraseindependenttelomere maintenance pathway and its pharmaceutical significance using theyeast Kluyveromyces lactis, as a model organism, with considerable similarity to humantelomeres. Because of the telomere, telomerase and a number of telomerase-interactingproteins are currently considered as the potential targets of anticancer drugs, our results willtrigger new discussions in relation to employment of these alternative telomere maintenencemechanisms as the targets of anti-cancer therapy strategies.Keywords: Telomere, recombination, Alternative lengthening oftelomeres, anticancer drug target.E-mail: bilge.debelec@ege.edu.tr 77

73 ÖZET ORAL DOKU ÖRNEKLERİNDE SİTOKROM P450 (CYP450) ENZİM EKSPRESYONUNUN BELİRLENMESİ Ekzojenik ve endojenik çok sayıda kimyasalın metabolik aktivasyonu, Sitokrom P450 (CYP) enzimleri tarafından katalizlenir. Bu çalışmada, CYP -2A6, - 2B6, -2C, -2D6, -2E1, -3A3/4 ve -3A5 spesifik primerlerinin kullanıldığı RT-PCR temelli ekspresyon profili altı bireyden alınan yedi adet oral buccal doku örneklerinde analiz edilmiştir. Tek bir molekül içindeki hedef CYP'lerin tamamım amplifiye etmek için gerekli olan primer sekanslarını kapsayan, bilinen kopya sayısındaki bir kompetitör RNA referans olarak kullanılmıştır ve sonuçlar yapısal genlerinin ekspresyonunun yanısıra karaciğer dokusundaki CYP ekspresyonu ile karşdaştırılmıştır. Sonuçlarımız oral dokuda, CYP -2A6, -2C, -2E1 ve -3A5'in devamlı ekspresyonunu göstermiştir. Homozigot delesyonlu genotipte azaltılmış oral kanser riski hakkındaki önceki raporumuza dayanarak, CYP2A6 ekspresyonunun dikkate değer bir öneme sahip olduğunu söyleyebiliriz çünkü bu enzim nitrozarninler tarafından katalitize edilmektedir. Sonuçlarımız CYP'lerin ksenobiyotik aktivasyonundaki rolleriyle de ilişkilendirilerek, kantitatif ekspresyon oranlarıyla tartışılmıştır. 74 ABSTRACT COMPARATIVE CYTOCHROME P450 (CYP450) EXPRESSION IN ORAL BUCCAL TISSUE SAMPLES Metabolic activation of numerous exogenous and endogenous chemicals are catalyzed by Cytochrome P450 enzymes (CYPs). In this study, an RT-PCR based expression profile using CYPs -2A6, -2B6, -2C, -2D6, -2E1, -3A3/4 and -3A5 specific primers were analyzed in a total seven homogenized oral buccal tissue samples from six individuals. An RNA competitor of known copy number covering the primer sequences necessary to amplify the entire object CYPs within a single molecule was used as the reference and results were compared to the CYP expression in liver tissue as well as the expression of a housekeeping gene, GAPDH. Our results demonstrated a consistent expression of the CYPs -2A6, -2C, 2E1 and -3A5. Based on our previous report on the reduced oral cancer risk in homozygote deletion genotype, CYP2A6 expression is of particular importance as this enzyme is characteristic of its catalytic properties to nitrosamines. Our results were discussed in quantitative ratios of the expressed CYP members in relation to their roles in xenobiotic activation. 90