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Rhabdomyolysis is defined as the breakdown of skeletal muscle leading to the release of muscle contents into the extracellular fluid. Patients with rhabdomyolysis can be asymptomatic or have myalgia symptoms, weakness, myoglobinuria with dark urine, significant electrolyte imbalance, and acute kidney injury. Here we describe a case on acute kidney injury associated to rhabdomyolysis in a patient with COVID-19.

Rhabdomyolysis is defined as the breakdown of skeletal muscle leading to the release of muscle contents into the extracellular fluid. Patients with rhabdomyolysis can be asymptomatic or have myalgia symptoms, weakness, myoglobinuria with dark urine, significant electrolyte imbalance, and acute kidney injury. Here we describe a case on acute kidney injury associated to rhabdomyolysis in a patient with COVID-19. Resumo A rabdomiólise é definida como a lise da musculatura esquelética levando à liberação do conteúdo muscular para o fluido extracelular. Pacientes com rabdomiólise podem ser assintomáticos ou apresentar sintomas de mialgia, fraqueza, mioglobinúria com urina escura, desequilíbrio eletrolítico significativo e lesão renal aguda. Aqui descrevemos um caso de lesão renal aguda associada à rabdomiólise em um paciente com COVID-19.

Rhabdomyolysis is defined as the breakdown of skeletal muscle leading to the release of muscle contents into the extracellular fluid. Patients with rhabdomyolysis can be asymptomatic or have myalgia symptoms, weakness, myoglobinuria with dark urine, significant electrolyte imbalance, and acute kidney injury. Here we describe a case on acute kidney injury associated to rhabdomyolysis in a patient with COVID-19. Resumo A rabdomiólise é definida como a lise da musculatura esquelética levando à liberação do conteúdo muscular para o fluido extracelular. Pacientes com rabdomiólise podem ser assintomáticos ou apresentar sintomas de mialgia, fraqueza, mioglobinúria com urina escura, desequilíbrio eletrolítico significativo e lesão renal aguda. Aqui descrevemos um caso de lesão renal aguda associada à rabdomiólise em um paciente com COVID-19.

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Rhabdomyolysis is defined as the breakdown of skeletal muscle leading to the release of muscle contents into the extracellular fluid. Patients with rhabdomyolysis can be asymptomatic or have myalgia symptoms, weakness, myoglobinuria with dark urine, significant electrolyte imbalance, and acute kidney injury. Here we describe a case on acute kidney injury associated to rhabdomyolysis in a patient with COVID-19.

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Background: Cestoda is a class of endoparasitic worms in the flatworm phylum (Platyhelminthes). During the course of their evolution cestodes have evolved some interesting aspects, such as their increased reproductive capacity. In this sense, they have serial repetition of their reproductive organs in the adult stage, which is often associated with external segmentation in a developmental process called strobilation. However, the molecular basis of strobilation is poorly understood. To assess this issue, an evolutionary comparative study among strobilated and non-strobilated flatworm species was conducted to identify genes and proteins related to the strobilation process. Results: We compared the genomic content of 10 parasitic platyhelminth species; five from cestode species, representing strobilated parasitic platyhelminths, and five from trematode species, representing non-strobilated parasitic platyhelminths. This dataset was used to identify 1813 genes with orthologues that are present in all cestode (strobilated) species, but absent from at least one trematode (non-strobilated) species. Development- related genes, along with genes of unknown function (UF), were then selected based on their transcriptional profiles, resulting in a total of 34 genes that were differentially expressed between the larval (pre-strobilation) and adult (strobilated) stages in at least one cestode species. These 34 genes were then assumed to be strobilation related; they included 12 encoding proteins of known function, with 6 related to the Wnt, TGF-β/BMP, or G-protein coupled receptor signaling pathways; and 22 encoding UF proteins. In order to assign function to at least some of the UF genes/proteins, a global gene co-expression analysis was performed for the cestode species Echinococcus multilocularis. This resulted in eight UF genes/proteins being predicted as related to developmental, reproductive, vesicle transport, or signaling processes. Conclusions: Overall, the described in silico data provided evidence of the involvement of 34 genes/proteins and at least 3 developmental pathways in the cestode strobilation process. These results highlight on the molecular mechanisms and evolution of the cestode strobilation process, and point to several interesting proteins as potential developmental markers and/or targets for the development of novel antihelminthic drugs.

Alcohol dehydrogenases belong to the large superfamily of medium-chain dehydrogenases/reductases, which occur throughout the biological world and are involved with many important metabolic routes. We considered the phylogeny of 190 ADH sequences of animals, fungi, and plants. Non-class III Caenorhabditis elegans ADHs were seen closely related to tetrameric fungal ADHs. ADH3 forms a sister group to amphibian, reptilian, avian and mammalian non-class III ADHs. In fishes, two main forms are identified: ADH1 and ADH3, whereas in amphibians there is a new ADH form (ADH8). ADH2 is found in Mammalia and Aves, and they formed a monophyletic group. Additionally, mammalian ADH4 seems to result from an ADH1 duplication, while in Fungi, ADH formed clusters based on types and genera. The plant ADH isoforms constitute a basal clade in relation to ADHs from animals. We identified amino acid residues responsible for functional divergence between ADH types in fungi, mammals, and fishes. In mammals, these differences occur mainly between ADH1/ADH4 and ADH3/ADH5, whereas functional divergence occurred in fungi between ADH1/ADH5, ADH5/ADH4, and ADH5/ADH3. In fishes, the forms also seem to be functionally divergent. The ADH family expansion exemplifies a neofunctionalization process where reiterative duplication events are related to new activities.

Developmental genes are believed to contribute to major changes during plant evolution, from infrageneric to higher levels. Due to their putative high sequence conservation, developmental genes are rarely used as molecular markers, and few studies including these sequences at low taxonomic levels exist. WUSCHEL-related homeobox genes (WOX) are transcription factors exclusively present in plants and are involved in developmental processes. In this study, we characterized the infrageneric genetic variation of Petunia WOX genes. We obtained phylogenetic relationships consistent with other phylogenies based on nuclear markers, but with higher statistical support, resolution in terminals, and compatibility with flower morphological changes.

The mangroves are among the most productive and biologically important environments. The possible presence of cellulolytic enzymes and microorganisms useful for biomass degradation as well as taxonomic and functional aspects of two Brazilian mangroves were evaluated using cultivation and metagenomic approaches. From a total of 296 microorganisms with visual differences in colony morphology and growth (including bacteria, yeast and filamentous fungus), 179 (60.5%) and 117 (39.5%) were isolated from the Rio de Janeiro (RJ) and Bahia (BA) samples, respectively. RJ metagenome showed the higher number of microbial isolates, which is consistent with its most conserved state and higher diversity. The metagenomic sequencing data showed similar predominant bacterial phyla in the BA and RJ mangroves with an abundance of Proteobacteria (57.8% and 44.6%), Firmicutes (11% and 12.3%) and Actinobacteria (8.4% and 7.5%). A higher number of enzymes involved in the degradation of polycyclic aromatic compounds were found in the BA mangrove. Specific sequences involved in the cellulolytic degradation, belonging to cellulases, hemicellulases, carbohydrate binding domains, dockerins and cohesins were identified, and it was possible to isolate cultivable fungi and bacteria related to biomass decomposition and with potential applications for the production of biofuels. These results showed that the mangroves possess all fundamental molecular tools required for building the cellulosome, which is required for the efficient degradation of cellulose material and sugar release.

A álcool desidrogenase é uma família gênica classicamente conhecida como pertencente à via glicolítica, dimérica em animais e plantas, mas tetramérica em fungos e alguns invertebrados. A proteína ADH (álcool desidrogenase) possui dois domínios principais: o domínio de ligação da coenzima, formado por um motivo estrutural conhecido como Rossman fold (seis fitas betas paralelas ligadas por alfa hélices); e o domínio catalítico. Análises filogenéticas mostraram que essa família estrutura-se formando três clusters principais, correspondentes a sequências de animais, plantas e fungos. As classes 1 e 2 de ADH de Caenorhabditis elegans agruparam-se próximas ao cluster monofilético das ADHs de fungos, muito provavelmente porque também são tetraméricas. Em animais e plantas, houve a formação de clados de acordo com o tipo de ADH, já em fungos os agrupamentos devem-se ao tipo de ADH e gênero do organismo. O padrão de evolução dessa família gênica pode ser explicado através do modelo por nascimento e morte. Estudos teóricos de divergência funcional conduzidos nos três grupos de organismos previamente citados indicaram os sítios que, provavelmente, estão submetidos a processos de surgimento de novidades funcionais após a duplicação gênica. As regiões onde foram encontrados os maiores números de aminoácidos divergentes incluem a região de ligação do segundo átomo de zinco, o segmento de interação entre os monômeros e o sítio ativo. Foram construídos dezessete modelos da estrutura tridimensional de ADH em plantas pertencentes a quatro famílias botânicas, a partir da modelagem molecular comparativa. Os resíduos funcionalmente divergentes foram localizados nas estruturas modeladas, tendo sido também encontradas diferenças no potencial eletrostático e no pI (ponto isoelétrico). Alcohol dehydrogenase (ADH) is a gene family known to function in the glycolytic pathway, being dimeric in animals and plants, but tetrameric in fungi and some invertebrates. This protein presents two main domains: one which binds to the coenzyme, formed by a structural motif known as Rossman fold (six parallel beta sheets connected by alpha helices); and the catalytic domain. Phylogenetic analyses showed that this family is structured in three main clusters, corresponding to animal, plant, and fungi sequences. Caenorhabditis elegans ADHs 1 and 2 are placed near the fungi ADH monophyletic cluster, probably because they are also tetrameric. In mammals and plants clade formation occurs by ADH type, while in fungi it follows ADH type and organism genera. The evolutionary pattern of this gene family can be explained by the birth and death model. Theoretical functional divergence studies conducted in the three previously cited groups of organisms indicated the sites that probably are being submitted to processes involving the emergence of functional novelties after gene duplication. The largest numbers of sites of divergent amino acids were found in the second zinc binding region, the monomer interacting segment, and the active site. Seventeen models of ADH tridimensional structure in plants from four botanical families were built by Comparative Molecular Modeling. The functionally divergent residues were located in the modeled structures and electrostatic and pI (isoelectric point) differences found.

As proteínas glicolíticas em plantas são codificadas por pequenas famílias multigênicas, que fornecem um interessante contraste às famílias multigênicas com um grande número de cópias estudadas até o momento. Os genes Adh codificam enzimas glicolíticas, conhecidas como álcool desidrogenase, as quais têm sido caracterizadas em várias famílias de plantas. Embora as seqüências de aminoácios das cadeias longas de ADH, que contêm zinco como cofator, sejam altamente conservadas, a função metabólica dessa enzima é variável. Além disso, elas têm diferentes padrões de expressão e estão submetidas a diferentes taxas não-sinônimas entre as diferentes cópias gênicas. É possível que as cópias de Adh tenham sido mantidas como conseqüência da substituição adaptativa de aminoácidos que conferiu uma mudança em sua função. Neste estudo, estendemos análises prévias dessa família gênica, utilizando técnicas de filogenia e modelagem molecular, com o objetivo de entender o processo de diversificação envolvido na evolução dessa família multigênica. As análises filogenéticas indicaram que têm havido eventos separados de duplicação dentro de angiospermas, ou seja, genes identificados como Adh1, Adh2 e Adh3 em diferentes grupos podem não ser homólogos. Nenhuma indicação de seleção positiva foi encontrada para a família gênica Adh em plantas. Entretanto, os coeficientes de divergência funcional ( ) estimados entre os grupos de genes Adh1 e Adh2 indicaram mudanças sítio-específicas, estatisticamente significativas, na taxa evolutiva entre os mesmos, bem como entre aqueles genes Adh de diferentes famílias botânicas, sugerindo que alterações nas restrições funcionais podem ter ocorrido em alguns resíduos de aminoácidos depois da especiação. Modelos teóricos da estrutura tridimensional da enzima álcool desidrogenase de 17 espécies de plantas foram construídos e validados estereoquimicamente. Os resíduos de aminoácidos importantes para a divergência funcional dessa enzima foram identificados na estrutura tridimensional da mesma. The glycolytic proteins in plants are coded by small multigene families, which provide an interesting contrast to the high copy number gene families studied to date. The alcohol dehydrogenase (Adh) genes encode glycolytic enzymes that have been characterized in some plant families. Although the amino acid sequences of zinccontaining long-chain (LC) ADHs are highly conserved, the metabolic function of this enzyme is variable. Besides this, they have different patterns of expression and are submitted to differences in nonsynonymous substitution rates between gene copies. It is possible that the Adh copies have been retained as a consequence of adaptative amino acid replacement which has conferred a subtle change in function. We extend previous studies of this gene family, with the goal of using phylogenetic approach and molecular modeling tools to understand the process of diversification involved in the evolutionary process of this multigene family. The phylogenetic analysis indicate that there have been a number of separate duplication events within angiosperms, that is to say genes labeled Adh1, Adh2 and Adh3 in different groups may not be homologous. No indication of positive selection was encountered for the plant Adh gene family. However, the coefficients of functional divergence ( ) estimated between the Adh1 and Adh2 gene groups indicate statistically significant site-specific shift of evolutionary rate between them, as well as between those of different botanical families, suggesting that altered functional constraints may take place at some amino acid residues after speciation. Theoretical tridimensional models of seventeen plant alcohol dehydrogenase were constructed and verified to be stereochemically valid. The amino acids residues important for the functional divergence of this enzyme were identified in the ADH tridimensional structure.

The genes encoding 13 classes of pathogenesis-related (PR) proteins were examined for positive selection using maximum-likelihood (ML) models of codon substitution. The study involved 194 sequences from 54 species belonging to 37 genera. Although the sizes of the sequences examined varied from 237 bp for PR12 to 1,110 bp for PR7, most classes (9 out of 13) contained sequences made up of more than 400 nucleotides. Signs of positive selection were obtained for sites in PR proteins 4, 6, 8, 9 and 15 using an ML-based Bayesian method and likelihood ratio tests. These results confirm the importance of positive selection in proteins related to defense mechanisms already observed in a wide array of organisms.

Background: Concerns for arsenic exposure are not limited to toxic waste sites and massive poisoning events. Chronic exposure continues to be a major public health problem worldwide, affecting hundreds of millions of persons. Objectives: We reviewed recent information on worldwide concerns for arsenic exposures and public health to heighten awareness of the current scope of arsenic exposure and health outcomes and the importance of reducing exposure, particularly during pregnancy and early life. Methods: We synthesized the large body of current research pertaining to arsenic exposure and health outcomes with an emphasis on recent publications. Discussion: Locations of high arsenic exposure via drinking water span from Bangladesh, Chile, and Taiwan to the United States. The U.S. Environmental Protection Agency maximum contaminant level (MCL) in drinking water is 10 µg/L; however, concentrations of greater than 3,000 µg/L have been found in wells in the United States. In addition, exposure through diet is of growing concern. Knowledge of the scope of arsenic-associated health effects has broadened; arsenic leaves essentially no bodily system untouched. Arsenic is a known carcinogen associated with skin, lung, bladder, kidney, and liver cancer. Dermatological, developmental, neurological, respiratory, cardiovascular, immunological, and endocrine effects are also evident. Most remarkably, early-life exposure may be related to increased risks for several types of cancer and other diseases during adulthood. Conclusions: These data call for heightened awareness of arsenic-related pathologies in broader contexts than previously perceived. Testing foods and drinking water for arsenic, including individual private wells, should be a top priority to reduce exposure, particularly for pregnant women and children, given the potential for life-long effects of developmental exposure.

Em dezembro de 2019, um novo coronavírus foi detectado em pacientes com síndrome respiratória aguda grave em Wuhan, China. Este Betacoronavirus, denominado Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), espalhou-se rapidamente pelo mundo, de modo que a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou estado de pandemia em março de 2020. Após o sequenciamento do primeiro genoma completo do vírus, esforços internacionais sem precedentes foram estabelecidos por meio do banco de dados GISAID, permitindo o acompanhamento em tempo real da evolução viral, bem como seu espalhamento geográfico em níveis locais, regionais, nacionais e globais. Nesse sentido, este trabalho objetivou realizar análises genômicas de amostras isoladas de SARS-CoV-2 a fim de compreender a distribuição de mutações e linhagens virais em nível municipal (Esteio, Rio Grande do Sul [RS], Brasil), estadual (RS) e nacional (Brasil). Para este fim, sequenciamos 21 amostras do município de Esteio na primeira fase da epidemia (maio a outubro de 2020), demonstrando a presença principal das linhagens B.1.1.28 e B.1.1.33, a caracterização inicial da linhagem P.2 no estado e a contribuição principal da região Sudeste para a difusão destas linhagens para o sul do Brasil. Subsequentemente, analisamos 56 genomas de 13 municípios do RS em período de aumento de hospitalizações e mortes (março de 2021), demonstrando a rápida difusão da variante P.1 (Gama) para o estado a partir de múltiplas introduções vindas principalmente do Norte, bem como descrevendo as mutações e a difusão geográfica da sublinhagem P.1.2. Finalmente, utilizamos 2.732 genomas de todo o território brasileiro no primeiro ano da epidemia (entre fevereiro de 2020 e 2021), descrevendo esforços de sequenciamento heterogêneos temporal e espacialmente, a rápida substituição das linhagens B.1.1.28 e B.1.1.33 por P.1 e P.2 e complexos padrões filogeográficos, nos quais algumas linhagens se espalham principalmente de modo intra-estadual e, outras, interestadual. Portanto, ao utilizar dados epidemiológicos e genomas completos do SARS-CoV-2 dos pacientes locais e de um conjunto representativo da diversidade viral mundial, caracterizamos as mutações virais observadas, a abundância de linhagens, bem como compreendemos padrões de espalhamento geográfico no território Brasileiro. In December 2019, a novel coronavirus was detected in patients with severe acute respiratory syndrome in Wuhan, China. This Betacoronavirus, named Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), has spread rapidly around the world leading the World Health Organization (WHO) to declare a pandemic state in March 2020. Following the sequencing of the virus' first complete genome, unprecedented international efforts have been established through the GISAID database, allowing real-time tracking of viral evolution as well as its geographic spread at local, regional, national, and global levels. In this context, this work aimed to perform genomic analyses of SARS-CoV-2 samples in order to understand the distribution of mutations and viral lineages at municipal (Esteio, Rio Grande do Sul [RS], Brazil), state (RS) and national (Brazil) levels. To this end, we sequenced 21 samples from the municipality of Esteio in the first epidemic phase (May to October 2020), demonstrating the prominent presence of the B.1.1.28 and B.1.1.33 lineages, the initial characterization of the P.2 lineage in the state, and the major contribution of the Southeast region to the spread of these strains to Southern Brazil. Subsequently, we analyzed 56 genomes from 13 municipalities in RS during a period of increased hospitalizations and deaths (March 2021), demonstrating the rapid diffusion of the P.1 (Gamma) variant into the state from multiple introductions mainly from the Northern region of Brazil, as well as describing the mutations and geographic diffusion of the P.1.2. Finally, we used 2732 genomes from across Brazil in the first year of the epidemic (between February 2020 and 2021), describing temporally and spatially heterogeneous sequencing efforts, the rapid replacement of the B.1.1.28 and B.1.1.33 lineages for P.1 and P.2, and complex phylogeographic patterns in which some lineages spread primarily intrastate and others interstate. Therefore, by using epidemiological data and complete SARS-CoV-2 genomes from local patients and a set of genomes representative of worldwide viral diversity, we characterized viral mutations, lineage abundance, as well as understood patterns of geographic spread in the Brazilian territory.

Os cestódeos são os agentes etiológicos de doenças (cestodíases) que causam grave morbidade humana. Um aspecto interessante da biologia de cestódeos é a sua alta capacidade reprodutiva, que é essencial para a manutenção dos seus ciclos de vida. Cestódeos se reproduzem sexualmente por um processo chamado estrobilização, em vermes adultos. A estrobilização se dá através do crescimento seriado e contínuo de segmentos corporais (proglótides) contendo os órgãos sexuais, que podem ser fecundadas e liberar os ovos independentemente. Dessa forma, proteínas envolvidas na estrobilização representam interessantes alvos para fármacos anti-helmínticos, podendo interferir na capacidade reprodutiva desses animais para controle de sua transmissão. Porém, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na estrobilização. Nesse trabalho, foram utilizados métodos ômicos para identificação de genes associados ao desenvolvimento estrobilar de cestódeos, considerando aspectos de conservação evolutiva de sequências ou mecanismos de regulação da expressão gênica. Primeiramente, uma abordagem de genômica comparativa e funcional foi utilizada para a identificação de genes altamente conservados em cestódeos e ausentes em outros táxons evolutivamente relacionados. Foram evidenciados 34 genes relacionados à estrobilização, sendo 22 deles de função desconhecida (genes UF). Para avaliar o envolvimento de alguns dos genes UF na estrobilização, a segunda abordagem utilizada foi a análise por hibridização in situ de quatro genes UF em duas espécies-modelo de cestódeos, Hymenolepis microstoma e Mesocestoides corti. Dois genes tiveram sua associação à estrobilização corroborada, estando, possivelmente, envolvidos no amadurecimento de testículos. Adicionalmente, um gene foi identificado como potencialmente expresso em células indiferenciadas e outro gene possivelmente envolvido na modulação da resposta imune do hospedeiro. A terceira abordagem inclui transcritômica comparativa para a identificação de genes com o mesmo padrão de expressão diferencial em estágios não-estrobilados (larvas) e estrobilados (adultos) em ortólogos das três espécies de cestódeos (Echinococcus multilocularis, H. microstoma e M. corti). Foram identificados 84 grupos de ortólogos com padrão de expressão diferencial conservado, sendo 5 mais expressos em larvas e 79 mais expressos em adultos. Em seu conjunto, os resultados obtidos por meio das três abordagens utilizadas permitiram evidenciar diversos genes e vias metabólicas associados à estrobilização e sugerem que os mecanismos envolvidos na estrobilização derivaram de mecanismos ancestrais da segmentação de lofotrocozoários, com especialização para a execução de processos exclusivos de cestódeos. Foi identificada uma conservação evolutiva de, pelo menos, alguns mecanismos de regulação gênica entre as três espécies de cestódeos E. multilocularis, H. microstoma e M. corti, além da possível ocorrência de mecanismos de processamento pós-transcricionais ou pós-traducionais específicos das diferentes fases do desenvolvimento de cestódeos. Os estudos realizados destacam a importância de análises comparativas entre espécies relacionadas para a identificação de genes e mecanismos moleculares associados a processos de desenvolvimento como a estrobilização. Os dados gerados servirão de ponto de partida para estudos mais aprofundados sobre aspectos de Evo-Devo de cestódeos e, do ponto de vista aplicado, muitos dos genes associados à estrobilização poderão ser avaliados como alvos interessantes para o desenvolvimento de novos fármacos e tratamentos anti-helmínticos. Cestodes are the etiologic agents of some diseases (cestodiasis) that cause severe human morbidity. An interesting aspect of cestodes biology is the high reproductive capacity, which is essential for the maintenance of their life cycles. Adult cestodes reproduce sexually by a process called strobilation. Strobilation occurs through the serial and continuous growth of body segments (proglottids) containing the sexual organs, which can be independently fertilized and release eggs. Thus, proteins involved in strobilation are interesting targets for anthelmintic drugs, which may interfere in the reproductive capacity of these animals to control their transmission. However, little is known about the strobilation molecular mechanisms. In this work, omics methods were used to identify genes associated with the development mechanisms of strobilation through sequences evolutionary conservation or mechanisms of gene expression regulation analysis. First, comparative and functional genomics was used to identify highly conserved genes of cestodes that were absent in other evolutionarily related taxa. As a result, 34 strobilation related genes were found, being 22 of unknown function (UF genes). To assess the involvement of some UF genes in the strobilation, the second approach was the in situ hybridization analysis of four UF genes in two cestodes model species, Hymenolepis microstoma and Mesocestoides corti. Two genes had their association with strobilation corroborated, possibly being involved in the testicles maturation. In addition one UF gene is potentially expressed in undifferentiated cells and another UF gene is possibly involved in the host's immune response modulation. The third approach includes comparative transcriptomics to identify genes with the same pattern of differential expression in the orthologs of non-strobilated (larvae) and strobilated (adult) stages of three cestode species (Echinococcus multilocularis, H. microstoma and M. corti). Thus, we identified 84 groups of orthologs genes with conserved differential expression pattern, among these 5 are more expressed in larvae and 79 are more expressed in adults. Taken together, the results obtained with these three approaches show several genes and metabolic pathways associated with Strobilation. Also suggest that some mechanisms involved in strobilization were derived from lofotrocozoans segmentation ancestral ones, that were specialized to execute exclusive processes of cestode. It was also evidenced an evolutionary conservation of at least some gene regulation mechanisms among the three cestode species E. multilocularis, H. microstoma and M. corti. In addition, the possible occurrence of specific post-transcriptional or post-translational processing mechanisms specific of the different developmental stages of cestodes is shown. This work highlight the importance of comparative assessments between related species for the identification of genes and molecular mechanisms associated with developmental processes, such as strobilation. This results will serve as a starting point for more in-depth studies on Evo-Devo aspects of cestodes. From the applied point of view, many of the genes associated with strobilization can be evaluated as interesting targets for the development of new drugs and anthelmintic treatments.

A família Pr1 de proteases tem papel importante na patogenicidade e virulência de artropatógenos como Metarhizium anisopliae. Esses fatores de virulência geralmente atuam na penetração da cutícula do hospedeiro, etapa essencial do processo infectivo. Há 11 proteoformas de Pr1 (Pr1A a Pr1K) descritas. Essa família é dividida em duas classes, sendo que a Classe II (tipo-proteinase K) inclui 10 parálogos subdivididos em três subfamílias. Essas proteoformas agem em sinergia e com outros fatores de virulência, conferindo patogenicidade a diferentes hospedeiros. À medida em que a virulência coevolui por seleção recíproca com os hospedeiros, a seleção positiva pode levar à evolução de novas famílias de proteases ou parálogos das existentes que possam superar as defesas do hospedeiro. Essa hipótese é suportada por proteínas Pr1 da Classe II, pois evidenciamos: (i) seleção positiva em seis dos dez parálogos de Pr1 (em maioria no domínio proteolítico); (ii) divergência funcional Tipo I em comparações intra-subfamília, com suporte a uma potencial nova proteoforma de Pr1J; (iii) localizações projetadas em estrutura terciária próximas ao sítio catalítico, com potencial impacto na catálise. Uma abordagem mista computacional-experimental foi desenvolvida para caracterizar essa nova proteoforma de Pr1J e identificar os efeitos de sua evolução, utilizando simulações comparativas por dinâmica molecular e expressão heteróloga em Escherichia coli. Até o momento, diferentes elementos estruturais e comportamentos conformacionais podem ser observados entre ambas as proteoformas de Pr1J. Ademais, as construções de vetores plasmidiais foram bem-sucedidas, embora a sua expressão não tenha sido possível. Em conjunto, essa abordagem mista pode apontar os efeitos da duplicação e diversificação proteica nas capacidades proteolíticas de M. anisopliae. Até o momento, os resultados implicam a existência de pressão seletiva diferencial em genes pr1 e uma potencial nova proteoforma, provavelmente afetando especificidade de hospedeiros, virulência ou ainda adaptando o organismo a diferentes estilos de vida independentes do hospedeiro. The Pr1 family of proteases plays an important role in pathogenicity and virulence of arthropathogens such as Metarhizium anisopliae. These virulence factors are active during the penetration of the host cuticle, an essential step in the infective process of this fungus, which possesses 11 Pr1 proteoforms (Pr1A through Pr1K). This family is divided in two classes, with Class II (proteinase K-like) comprising 10 paralogs further split into three subfamilies. These proteoforms act synergistically and with other virulence factors, conferring pathogenicity to multiple hosts. As virulence coevolves by reciprocal selection with hosts, positive selection may lead to the evolution of new protease families or paralogs of extant ones that can withstand host defenses. This hypothesis is supported in Class II Pr1 proteins, as we have evidenced: (i) positive selection in six out of ten Pr1 paralogs (mostly located on the proteolytic domain); (ii) Type I functional divergence in intra-subfamily pairwise comparisons, also supporting a potential novel Pr1J proteoform; (iii) tertiary structure projected locations being closely located to the enzyme’s catalytic cleft, potentially impacting catalysis. A mixed computational-experimental approach was developed in order to characterize this novel Pr1J protein proteoform and identify the effects of positively selected sites and residues related to functional divergence, by means of comparative molecular dynamics simulations and heterologous expression in bacterial vectors. While these analyses are currently underway, different structural elements and conformational behaviors can already be observed among both Pr1J proteoform. Furthermore, plasmidial vector constructions have been successful, although their expression is yet to be accomplished. In conjunction, this mixed approach should provide a comprehensive view of the effects of protein duplication and diversification regarding proteolytic capabilities in M. anisopliae. So far, our results imply the existence of differential selective pressure acting on pr1 genes and a potential novel proteoform, likely affecting host specificities, virulence or even adapting the organism to different host-independent lifestyles.

O fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae é amplamente empregado comercialmente como agente biocontrolador de artrópodes em pragas na agricultura e pecuária, abrangendo vasta gama de hospedeiros. Para que o processo infectivo tenha sucesso, é necessário que o fungo atravesse a cutícula, a primeira e principal defesa do artrópode. A transposição dessa primeira barreira ocorre pela secreção de proteases, lipases e quitinases para degradar seus principais componentes estruturais. Dentre as proteases expressas por M. anisopliae, a família Pr1 de serino-proteases está associada à virulência. Essa família possui 11 isoformas - Pr1A a Pr1K - em M. anisopliae, sendo subdivididas em duas classes. A Classe II compreende 10 isoformas subdivididas em três subfamílias. Essas isoformas agem de forma sinergística entre si e com outros fatores, conferindo maior virulência e permitindo a infecção de diferentes hospedeiros. É suposto que a virulência coevolui por seleção recíproca com o hospedeiro, havendo seleção positiva para a evolução de novas proteases ou isoformas que não sejam inativadas por inibidores do hospedeiro. O presente trabalho busca testar essa hipótese na Classe II da família Pr1, com especial foco em M. anisopliae, utilizando diferentes métodos de inferência filogenética em conjuntos de aminoácidos e nucleotídeos das isoformas individuais, bem como agrupadas por subfamílias, abrangendo homólogos do gênero Metarhizium e fungos relacionados. As árvores obtidas e seus respectivos alinhamentos nucleotídicos foram analisados quanto à substituições sinônimas e não sinônimas para inferência de seleção positiva. Tanto para os conjuntos de dados individuiais quanto para aqueles agrupados por subfamília, as filogenias retratam grupos com alto suporte estatístico condizentes com a taxonomia dos organismos que sintetizam essas proteínas, embora contendo pequenas discrepâncias. Foram identificados sítios sob seleção positiva em seis das nove isoformas avaliadas, em sua maioria localizados no domínio proteolítico. Esses resultados indicam que existe pressão seletiva diferenciada para gerar novas variações de Pr1, com efeito potencial na especificidade por hospedeiros, aumento de virulência, ou adaptação a outros estilos de vida hospedeiro-independente. The entomopathogenic fungus Metarhizium anisoplie is widely applied as a pest-arthropod biocontrol agent in crops and animal production, encompassing a wide array of hosts. For a successful infection, it is vital that the fungus breaches the host’s cuticle, the first and main defense of artrhopods. Transposing this first barrier requires secreted proteases, lipases and chitinases that degrade the cuticle’s main structural components. Among the expressed proteases of M. anisopliae, the Pr1 family of serine proteases is related to its virulence. In M. anisopliae, this family contains 11 isoforms – Pr1A through Pr1K – divided into two classes. Class II comprises 10 isoforms further divided into three subfamilies. It is believed that these isoforms act synergistically and with other virulence fators, allowing the infection of different hosts. Presumably, virulence coevolves through reciprocal selection with the host, where positive selection occurs for the evolution of new proteases or isoforms that are not inactivated by the host’s inhibitors. The current work tests this hypothesis in Class II of the Pr1 family, with a special focus in M. anisopliae, employing different methods for phylogenetic inference in aminoacid and nucleotide datasets alike for each isoform individually as well as grouped by subfamily, encompassing homologs for the Metarhizium genus and related fungi. The inferred trees and their respective alignments were analyzed regarding synonymous and non-synonymous substitutions to detect positive selection. For each individual dataset, as well as for their subfamily groups, phylogenies depict groups that match the taxonomy of their respective organisms with high statistical support, albeit with minor discrepancies. Positively selected sites were identified in six out of nine Pr1 isoforms, most of them located within the proteolytic domain. These results imply that there exists a differential selective pressure for the evolution of novel Pr1 variations, potentially affecting host specificity, increasing virulence or adapting the fungus to different host-independent lifestyles.

O Filo Platyhelminthes inclui todos os vermes achatados e contém quatro Classes: Turbellaria, Menogenea, Trematoda e Cestoda. A primeira é composta predominantemente por organismos de vida livre, a segunda por ectoparasitas e as Classes Trematoda e Cestoda são compostas por endoparasitas obrigatórios. Os cestódeos são agentes etiológicos de algumas das principais doenças de seres humanos e animais domésticos, apresentado complexos ciclos de vida que abrangem, pelo menos, dois hospedeiros. Entre as suas adaptações ao parasitismo, alguns cestódeos da Subclasse Eucestoda apresentam repetição seriada dos órgãos reprodutivos (metamerismo) e a segmentação externa destes (proglotização), apresentando, assim, uma enorme capacidade reprodutiva. Porém, pouco se sabe dos aspectos moleculares envolvidos na biologia do desenvolvimento desta estrutura corporal. O presente trabalho descreve as relações evolutivas entre organismos endoparasitas do Filo Platyhelminthes através de análise filogenômica, assim como a interrelação dos platelmintos com demais representantes do Superfilo Lophotrochozoa. Por meio da comparação de dados genômicos, transcritômicos e inferência funcional, este trabalho descreve um total de 34 proteínas associadas ao processo de proglotização, conservadas em platelmintos da Classe Cestoda. Entre estas proteínas, 12 estão relacionadas a processos de desenvolvimento, incluindo vias bem conhecidas como as vias de sinalização da wnt e do TGF-β/BMP. Adicionalmente, a identificação de 22 proteínas hipotéticas conservadas e a descrição de seus domínios, adiciona importantes alvos para o estudo da evolução deste processo de desenvolvimento na Classe Cestoda. The Phylum Platyhelminthes includes all flatworms and contains four classes: Turbellaria, Menogenea, Trematoda, and Cestoda. The first one is predominantly composed of free-living organisms, the second by ectoparasites and the Trematoda and Cestoda Classes are composed of obligatory endoparasites. The cestodes are etiologic agents of some of the major diseases of humans and domestic animals, and present complex life cycles that include at least two hosts. Among its adaptations to parasitism, some cestodes of Eucestoda Subclass have serial repetition of their reproductive organs (metamerism) and external segmentation of these (proglottisation), thus presenting an enormous reproductive capacity. However, little is known about the molecular aspects involved in the biology of development of this kind of body structure. This work describes the evolutionary relationships among endoparasite organisms from Phylum Platyhelminthes through phylogenomic analysis, as well as the interrelationship of flatworms with other species representing the Superphylum Lophotrochozoa. Through genomic data comparison, transcriptomic analysis and functional inference, this work describes a set of 34 proteins associated with the proglottisation process, preserved in flatworms Class Cestoda. Among these proteins, 12 are related to developmental processes, including well described pathways as the Wnt and TGF-β / BMP signaling pathways. Additionally, the identification of 22 conserved hypothetical proteins and the description of its domains adds important targets for the study of the proglottisation evolution in the Class Cestoda.

As ribonucleases catalisam a clivagem do RNA e são componentes ubíquos das células, desde procariotos até eucariotos. A família T2 é a classe de RNases mais amplamente distribuída entre os organismos vivos. A ampla distribuição desta família sugere que ela deve ter um papel funcional muito importante na biologia celular destes organismos. Em Solanaceae, há basicamente dois grupos destas proteínas, um representado pelas S-RNases, as quais estão envolvidas com a rejeição do pólen na autoincompatibilidade gametofítica e um outro grupo mais diverso que é denominado de S-like RNases, com funções muito diversificadas. As S-RNases se apresentam na forma de um gene multialélico, altamente polimórfico, que está contido no lócus S. O lócus S é composto por uma combinação de proteínas SLF (S-locus F-box), responsáveis pela determinação do fator polínico, e uma S-RNase produzida apenas no pistilo, de forma que estes genes estão fortemente ligados formando o haplótipo S. Esses produtos gênicos interagem possibilitando a rejeição do auto-pólen num fenômeno denominado distinção colaborativa do pólen não próprio. No Capítulo II, foram utilizados métodos filogenéticos para determinar os principais agrupamentos de alelos na genealogia de S-RNases do gênero Solanum. A topologia da árvore não mostrou sinal filogenético para espécies, contudo, isso era esperado uma vez que a diversificação destes alelos ocorreu anteriormente à diversificação das espécies, gerando um fenômeno denominado de polimorfismos trans-específicos. Além disso, foram realizadas análises de seleção positiva, as quais encontraram um alto número de resíduos com altas probabilidades, indicando que estão sob pressão de seleção positiva darwiniana. Com o intuito de compreender a diversidade estrutural destes alelos, foram construídos modelos teóricos com base em modelagem por homologia dos principais clados da filogenia, já que estas sequências apresentam um elevado grau de polimorfismo. Os resultados mostraram grande variação estrutural na região hipervariável destas sequências, enquanto que regiões conservadas não apresentaram grandes mudanças estruturais e com estruturas secundárias características. No Capítulo III, foram realizadas diversas análises com o objetivo de compreender a diversificação estrutural e funcional de RNases T2 na família Solanaceae. As análises filogenéticas mostraram a formação de três principais grupos, sendo um de S-RNases, e os outros dois de S-like RNases. Com relação ao Clado 2, podemos inferir que houveram ao menos dois eventos de duplicação gênica. Além disso, também foram utilizados os métodos de NSsites e branch-site para inferência de seleção positiva como uma forma de identificar possíveis sinais de diversificação molecular. Muitos resíduos parecem estar sob seleção em ambos os métodos, embora um número maior fosse encontrado no NSsites (41), com estes resíduos localizando-se em regiões mais flexíveis da proteína, enquanto que os aqueles selecionados de acordo com o brach-site (8) estavam situados em posições mais rígidas da estrutura. Em súmula, os resultados encontrados nos capítulos que compreendem esta tese demonstram que análises teóricas podem contribuir efetivamente de inúmeras maneiras com o intuito de desenvolver uma melhor compreensão dos fenômenos biológicos relacionados com a evolução molecular de famílias multigênicas, além de também contribuir no entendimento dos processos de diversificação de genes multialélicos, utilizando como modelo de estudo a família gênica RNase T2. The ribonucleases catalyze the cleavage of RNA and are ubiquitous components of cells, from prokaryotes to eukaryotes. The T2 family is the most widely category of RNases distributed among living organisms. The wide distribution of this family suggests that it should play an important functional role in cell biology of these organisms. Basically, there are two groups of these proteins in Solanaceae, one represented by SRNases, which are involved in the rejection of pollen in gametophytic self-incompatibility and a more diverse group, which is termed S-like RNases with very diverse functions. SRNases are a highly polymorphic and multiallelic gene contained in the S locus. The S locus consists of a combination of SLF proteins (F-box S-locus), responsible for the pollen factor, and one S-RNase expressed only in the pistil, and those genes are tightly linked as an S-haplotype. Products of these genes interact enabling the rejection of self-pollen in a phenomenon called collaborative non-self recognition. In Chapter II, we used phylogenetic methods to determine the main clusters of alleles in the genealogy of SRNase in the Solanum genus. The topology of the tree showed no phylogenetic sign to species delimitation, but it was expected since the diversification of these alleles occurred previously the diversification of the species, generating a phenomenon called trans-specific polymorphism. In addition, analyzes of positive selection were carried out, and it resulted in a significant number of residues with high probability, indicating they are under Darwinian positive selection. In order to understand the structural diversity of alleles, theoretical models were constructed based on homology modeling of the major clades found in the phylogeny, since it has a high degree of polymorphism in these sequences. The results showed that major structural variations are located in the hypervariable regions of these sequences, while conserved regions performed without major structural changes and showed stable secondary structures. In Chapter III, we used several analyzes to understand the structural and functional diversification of RNase T2 in the Solanaceae family. Phylogenetic analyses showed the clustering of three main groups, one with just SRNases and the two others composed by S-like RNases. Regarding to Clade 2, we could infer that at least two gene duplication events have occurred. In addition, we used two methods for inference of positive selection, NSsites and branch-site, as a mean to identify possible signals of molecular diversification. Many residues seem to be under selection in both methods, although a higher number was found in NSsites (41), and these residues were located in more flexible regions of the protein, while those selected according to the brach-site (8) were located at more rigid positions of the structure. In summary, the results found in the chapters of this thesis show that theoretical analyses could effectively contribute in many ways in order to develop a better understanding of biological phenomena related to the molecular evolution of gene families. Also, it contributes to the understanding of the processes related to multiallelic genes diversification, using gene family RNase T2 as a model.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico The screening for genes in metagenomic libraries from soil creates opportunities to explore the enormous genetic and metabolic diversity of microorganisms. Rivers are ecosystems with high biological diversity, but few were examined using the metagenomic approach. With this objective, a metagenomic library was constructed from DNA soil samples collected at three different points along the Jundiaí-river (Rio Grande do Norte-Brazil). The points sampled are from open area, rough terrain and with the direct incidence of sunlight. This library was analyzed functionally and based in sequence. For functional analysis Luria-Bertani solid medium (LB) with NaCl concentration varied from 0.17M to 0.85M was used for functional analysis. Positives clones resistant to hypersaline medium were obtained. The recombinant DNAs were extracted and transformed into Escherichia coli strain DH10B and survival curves were obtained for quantification of abiotic stress resistance. The sequences of clones were obtained and submitted to the BLASTX tool. Some clones were found to hypothetical proteins of microorganisms from both Archaea and Bacteria division. One of the clones showed a complete ORF with high similarity to glucose-6-phosphate isomerase which participates in the synthesis of glycerol pathway and serves as a compatible solute to balance the osmotic pressure inside and outside of cells. Subsequently, in order to identify genes encoding osmolytes or enzymes related halotolerance, environmental DNA samples from the river soil, from the water column of the estuary and ocean were collected and pyrosequenced. Sequences of osmolytes and enzymes of different microorganisms were obtained from the UniProt and used as RefSeqs for homology identification (TBLASTN) in metagenomic databases. The sequences were submitted to HMMER for the functional domains identification. Some enzymes were identified: alpha-trehalose-phosphate synthase, L-ectoina synthase (EctC), transaminase L-2 ,4-diaminobutyric acid (EctB), L-2 ,4-diaminobutyric acetyltransferase (EctA), L-threonine 3 dehydrogenase (sorbitol pathway), glycerol-3-phosphate dehydrogenase, inositol 3-phosphate dehydrogenase, chaperones, L-proline, glycine betaine binding ABC transporter, myo-inositol-1-phosphate synthase protein of proline simportadora / PutP sodium-and trehalose-6-phosphate phosphatase These proteins are commonly related to saline environments, however the identification of them in river environment is justified by the high salt concentration in the soil during prolonged dry seasons this river. Regarding the richness of the microbiota the river substrate has an abundance of halobacteria similar to the sea and more than the estuary. These data confirm the existence of a specialized response against salt stress by microorganisms in the environment of the Jundiaí river A busca por genes baseada na construção e análise de bibliotecas metagenômicas a partir de solo gera oportunidades para explorar uma enorme diversidade genética e metabólica de microrganismos. Os rios são ecossistemas com alta diversidade biológica, mas ainda pouco explorados por meio de metagenômica. Com o objetivo de explorar a diversidade microbiana, uma biblioteca metagenômica foi construída a partir de DNA extraído de substrato de rio em três pontos ao longo do rio Jundiaí (Rio Grande do Norte-Brasil). Os pontos de amostragem são derivados de área aberta, terreno acidentado e com a incidência direta da luz solar. Esta biblioteca foi analisada funcionalmente e também com base em sequências. Para a análise funcional foi utilizado meio de cultura sólido LB com concentração de NaCl variando de 0,17M a 0,85M. Foram obtidos 15 clones positivos com características halotolerantes. Os DNAs recombinantes foram extraídos e retransformados em cepa de Escherichia coli DH10B e curvas de sobrevivência foram obtidas para confirmação e quantificação da resistência ao estresse abiótico. As sequências dos clones foram obtidas e submetidas a ferramenta BLASTX e assim foi comprovado que alguns clones codificavam proteínas hipotéticas. Um dos clones apresentou uma ORF completa com elevada similaridade de glucose-6-fosfato-isomerase que participa na síntese do precursor de glicerol, sendo um soluto compatível para equilibrar a pressão osmótica no interior e no exterior das células. Posteriormente, para identificação de genes que codificam osmólitos relacionados com halotolerância e identificação da diversidade microbiológica, amostras de DNA ambiental do substrato do rio e da coluna d´água do estuário e oceano foram coletadas e pirosequenciadas. As sequências de osmólitos de diferentes microrganismos foram obtidas a partir do UniProt e utilizadas como RefSeqs para a identificação por homologia (TBLASTN) nos bancos de dados metagenômicos. As sequências identificadas nos bancos de dados ambientais foram submetidas ao programa HMMER com o fim de identificar domínios funcionais. Foram identificadas as enzimas: alfa-trealose-fosfato sintase, L-ectoina sintase (ectC), transaminase do ácido L-2,4-diaminobutírico (EctB), ácido L-2 ,4-diaminobutírico acetiltransferase (EctA), L-treonina 3-desidrogenase (via de síntese do sorbitol), Glicerol-3-fosfato desidrogenase, inositol-3-fosfato desidrogenase, chaperonas, L-prolina glicina betaína ligação transportador ABC, mio-inositol-1-fosfato sintase, a proteína simportadora de prolina/sódio -PutP e trealose-6-fosfato fosfatase. Estas são enzimas que participam da síntese de osmólitos comumente relacionados a ambientes salinos, no entanto a identificação desses solutos em ambiente de rio é justificada pela elevada concentração salina no solo durante prolongadas estações de seca neste rio. Quanto à riqueza da microbiota foi identificado que o substrato do rio possui uma abundância de halobactérias semelhante a do mar e superior a do estuário. Esses dados confirmam a existência de uma resposta especializada contra o estresse salino por microrganismos no ambiente do rio Jundiaí