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Coordinated development of muscles, tendons, and their attachment sites ensures emergence of functional musculoskeletal units that are adapted to diverse anatomical demands among different species. How these different tissues are patterned and functionally assembled during embryogenesis is poorly understood. Here, we investigated the morphogenesis of extraocular muscles (EOMs), an evolutionary conserved cranial muscle group that is crucial for the coordinated movement of the eyeballs and for visual acuity. By means of lineage analysis, we redefined the cellular origins of periocular connective tissues interacting with the EOMs, which do not arise exclusively from neural crest mesenchyme as previously thought. Using 3D imaging approaches, we established an integrative blueprint for the EOM functional unit. By doing so, we identified a developmental time window in which individual EOMs emerge from a unique muscle anlage and establish insertions in the sclera, which sets these muscles apart from classical muscle-to-bone type of insertions. Further, we demonstrate that the eyeballs are a source of diffusible all-trans retinoic acid (ATRA) that allow their targeting by the EOMs in a temporal and dose-dependent manner. Using genetically modified mice and inhibitor treatments, we find that endogenous local variations in the concentration of retinoids contribute to the establishment of tendon condensations and attachment sites that precede the initiation of muscle patterning. Collectively, our results highlight how global and site-specific programs are deployed for the assembly of muscle functional units with precise definition of muscle shapes and topographical wiring of their tendon attachments., The extraocular muscles (EOMs) are an evolutionarily conserved group of muscles that are precisely engineered for fine displacement of the eyeball, and thus crucial for visual acuity. This study presents the first integrative blueprint for morphogenesis of the EOM functional unit, providing genetic evidence for the existence of a retinoic acid signaling module that coordinates the emergence of individual EOMs, their tendons and insertion sites.

International audience

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are an interstitial cell population in adult skeletal muscle that support muscle regeneration. During development, interstitial muscle connective tissue (MCT) cells support proper muscle patterning, however the underlying molecular mechanisms are not well understood and it remains unclear whether adult FAPs and embryonic MCT cells share a common lineage. We show here that mouse embryonic limb MCT cells expressing the transcription factor Osr1, differentiate into fibrogenic and adipogenic cells in vivo and in vitro defining an embryonic FAP-like population. Genetic lineage tracing shows that developmental Osr1+ cells give rise to a subset of adult FAPs. Loss of Osr1 function leads to a reduction of myogenic progenitor proliferation and survival resulting in limb muscle patterning defects. Transcriptome and functional analyses reveal that Osr1+ cells provide a critical pro-myogenic niche via the production of MCT specific extracellular matrix components and secreted signaling factors., Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) form part of interstitial muscle connective tissue (MCT) in adults but the origin of this non-myogenic lineage is unclear. Here, the authors show that Odd skipped related 1 (Osr1) in mice marks embryonic MCT, giving rise to FAPs, and loss of Osr1 in the limb causes muscle defects.

International audience; The sequence of the chicken genome, like several other draft genome sequences, is presently not fully covered. Gaps, contigs assigned with low confidence and uncharacterized chromosomes result in gene fragmentation and imprecise gene annotation. Transcript abundance estimation from RNA sequencing (RNA-seq) data relies on read quality, library complexity and expression normalization. In addition, the quality of the genome sequence used to map sequencing reads, and the gene annotation that defines gene features, must also be taken into account. A partially covered genome sequence causes the loss of sequencing reads from the mapping step, while an inaccurate definition of gene features induces imprecise read counts from the assignment step. Both steps can significantly bias interpretation of RNA-seq data. Here, we describe a dual transcript-discovery approach combining a genome-guided gene prediction and a de novo transcriptome assembly. This dual approach enabled us to increase the assignment rate of RNA-seq data by nearly 20% as compared to when using only the chicken reference annotation, contributing therefore to a more accurate estimation of transcript abundance. More generally, this strategy could be applied to any organism with partial genome sequence and/ or lacking a manually-curated reference annotation in order to improve the accuracy of gene expression studies.

Opinion article (excerpt): Cells Live in a Complex World It may sound blatantly obvious, but we have to remind ourselves occasionally that in vivo cells experience an environment with a level of complexity far beyond experimental reach. The developing organism is a highly complex system, where each cell receives a multitude of cues of diverse nature at any given time point. Only the comprehensive integration of all these multivalent interactions determines the actual signaling state and hence the behavior of a cell. The analysis of biological questions is mainly inspired by a reductionist approach adopted from the ���exact sciences,��� where it has been proven immensely successful. That is, we are used to break down our experimental setup to a manageable number of variables. This of course is inherently contradictory to the complexity of biological systems. While simplification may be the only viable option for the experimenter to dissect biological function down to detail, it has also influenced our perspective toward the experimental systems applied. For example, studies of intracellular signaling pathways are typically performed with cultured cells. Culturing cells in an in vitro setting became a standard model system in biomedical research and with it in cell and developmental biology. These simplified systems allow for the dissection of molecular interactions and pathways and are aimed to deepen and mechanistically understand cellular behavior. While cell cultures have generated a wealth of information into cellular function, the data obtained in vitro frequently are in conflict with in vivo observations. One reason for this discrepancy is that these analyses focus on the cell as a closed functional system, thus conceptually unhinging it from its environment.

Contains fulltext : 89231.pdf (Publisher’s version ) (Open Access) ABSTRACT: BACKGROUND: Mental retardation is a genetically heterogeneous disorder, as more than 90 genes for this disorder has been found on the X chromosome alone. In addition the majority of patients are non-syndromic in that they do not present with clinically recognisable features. This makes it difficult to determine the molecular cause of this disorder on the basis of the phenotype alone. Mutations in KDM5C (previously named SMCX or JARID1C), a gene that encodes a transcriptional regulator with histone demethylase activity specific for dimethylated and trimethylated H3K4, are a comparatively frequent cause of non-syndromic X-linked mental retardation (NS-XLMR). Specific transcriptional targets of KDM5C, however, are still unknown and the effects of KDM5C deficiency on gene expression have not yet been investigated. RESULTS: By whole-mount in situ hybridisation we showed that the mouse homologue of KDM5C is expressed in multiple tissues during mouse development.We present the results of gene expression profiling performed on lymphoblastoid cell lines as well as blood from patients with mutations in KDM5C. Using whole genome expression arrays and quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction (QRT-PCR) experiments, we identified several genes, including CMKOR1, KDM5B and KIAA0469 that were consistently deregulated in both tissues. CONCLUSIONS: Our findings shed light on the pathological mechanisms underlying mental retardation and have implications for future diagnostics of this heterogeneous disorder.

Angeborene skeletale Fehlbildungen treten beim Menschen häufig auf, Fehlbildungen des Extremitätenskeletts betreffen im Durchschnitt etwa eine(n) unter 1000 Neugeborenen. Diese Fehlbildungen manifestieren sich während der Embryonal- bzw. Fötalphase, sind also Entwicklungsdefekte. Wir haben in den vergangenen Jahren verschiedene Formen der Extremitätenfehlbildungen untersucht. Wir konnten für zwei Syndrome, das Al-Awadi/Raas- Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrom und das Fuhrmann Syndrom die genetische Ursache herausfinden. Beide Syndrome werden durch Missense Mutationen im Signalmolekül WNT7A hervorgerufen. Wir konnten in funktionellen Untersuchungen zeigen, daß die Mutation im Al-Awadi/Raas-Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrom, das einen sehr schweren Phänotyp zeigt, zu einem totalen Funktionsverlust von WNT7A führt, während die Mutation im phänotypisch weniger schweren Fuhrmann Syndrom einen partiellen Funktionsverlust von WNT7A bewirkt. Dies ist erst die zweite Mutation, die in einem WNT Gen als Ursache für ein humanes Syndrom beschrieben wurde. Um einen besseren Einblick in die potentiellen Funktionen der Wnt Faktoren während der Extremitäten-Entwicklung zu bekommen, haben wir erstmals eine vollständige Expressionsanalyse aller 19 Wnt Gene der Maus sowie der wichtigsten sekretierten Antagonisten während der Extremitäten-Entwicklung unternommen und konnten dabei zahlreiche neue Expressions-Domänen beschreiben. Der Hauptfokus unserer Arbeit lag auf der Analyse der Pathogenese einer Gruppe von Handfehlbildungen, den Brachydaktylien. Der Ansatzpunkt zur Analyse dieser Krankheitsfamilie lag in der Untersuchung der Funktion von ROR2, welches in der phänotypisch schwersten Form, der Brachydaktylie Typ B1 (BDB1), Mutationen aufweist. Mutationen in ROR2 verursachen jedoch nicht nur die dominante BDB1, sondern auch das phänotypisch distinkte rezessive Robinow Syndrom (RRS). Um aufzuklären, wie diese Mutationen zu verschiedenen Syndromen führen, stellten wir exakte Kopien humaner Mutationen her und exprimierten diese in einem definierten Zellsystem. Wir konnten zeigen, daß RRS Mutationen zu einer Retention des Proteins im endoplasmatischen Reticulum und zur Proteindegradation führen. BDB1 Mutationen jedoch sind stabil und gelangen an die Zellmembran, wo sie mit dem normalen Signaling interferieren können. Durch exakte Quantifizierung der Proteinmengen an der Membran konnten wir zeigen, daß die Schwere des BDB1 Phänotyps sowie das Auftreten überlappenden Phänotypen zwischen BDB1 und RRS mit der Menge an trunkiertem Protein an der Zellmembran korreliert. Ror2 ist eine Rezeptor- Tyrosinkinase, für die zu Beginn unserer Arbeiten weder Ligand noch Signalweg bekannt waren. Um einen Einblick in diese Prozesse zu erhalten und intrazelluläre Interaktionspartner von Ror2 zu identifizieren, führten wir einen Yeast-two-Hybrod Screen mit der intrazellulären Domäne von Ror2 durch. Wir konnten zeigen, daß Ror2 mit einem LIM-Domänen Protein Wtip interagiert. Diese Interaktion ist lokalisiert auf den C-Terminus von Ror2, welcher in allen BDB1 Mutationen fehlt. Wir fanden, daß Ror2 in der Lage ist, Wtip an die Zellmembran zu rekrutieren, BDB1-Formen von Ror2 jedoch nicht. Schließlich fanden wir, daß Wtip ein neuer intrazellulärer Regulator des Wnt/-catenin Signalweges ist, in den Ror2 (unter anderem von uns) in den vergangenen Jahren involviert wurde. BDB1 ist charakterisiert durch Hypoplasie / Aplasie der distalen Fingerglieder. Um die Pathogenese dieses Phänotyps zu untersuchen, haben wir sowohl das Huhn als auch die Maus als Modellorganismus verwendet. Im Huhn konnten wir mittels retroviraler Misexpression von trunkierten Konstrukten (analog zu humanen BDB1 oder RRS Mutationen) zeigen, daß diese als dominant-negative wirken, wobei korrelierend zu den Experimenten in Zellkultur die RRS Mutationen einen schwächeren Effekt hatten. Wir beschrieben in diesem System den Defekt in Wachstumsfugen langer Knochen und zeigten, daß dieser auf einen Differenzierungsdefekt, nicht auf einen Proliferationsdefekt zurückgeht. In diesem System konnten wir jedoch keinen BDB1-analogen Phänotyp erzeugen. Dies gelang jedoch in einem Mausmodell, bei welchem eine humane Mutation (p.W749X) durch knock-in in den endogenen Ror2-Locus eingebracht wurde. Wir konnten in diesem Modell, das eine aplastische mittlere Phalanx aufweist, zeigen, daß die BDB1 durch einen Elongationsdefekt der frühen Knorpelkondensation der Hand und einem damit einher gehenden Defekt in der Bildung des distalen Gelenks zustande kommt. Unsere Ergebnisse liefern somit einen wichtigen Beitrag sowohl zur Erweiterung des Mutationsspektrums humaner Extremitäten-Fehlbildungen als auch zur funktionellen und molekularen Charakterisierung ihrer Pathogenese., Inheritable skeletal malformations are frequent in humans. In the recent years we have analyzed several limb malformation syndromes. For two closely related syndromes, Al-Awadi/Raas-Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrome and Fuhrmann Syndrome we were able to identify the genetic cause. In both syndromes we found recessive mutations in the gene encoding the signalling molecule WNT7A. Functional assays demonstrated that mutations in Al-Awadi/Raas- Rothschild/Schinzel Phocomelia Syndrome, showing a very severe phenotype, lead to a complete loss of function, while mutations in the less severe Fuhrmann Syndrome lead to a partial loss of function of the WNT7A protein. To gain further insight into the roles of WNT signalling in limb development we have performed a comprehensive expression analysis of all 19 mouse Wnt genes and their major secreted antagonists during limb development and were able to describe numerous novel expression domains. The main focus of our work, however, was the analysis of the pathomechanism of a group of hand malformations, the so-called brachydactylies (BDs). We therefore analyzed ROR2, which is mutated in the most severe human brachydactyly, BDB1. Importantly, mutations in ROR2 not only cause dominant BDB1, but also recessive Robinow syndrome (RRS). We analyzed the genotype-phenotype relationship for a range of BDB1 and RRS mutations in a defined cell system and found that RRS mutations cause intracellular retention of the protein. BDB1 mutations lead to the expression of proteins that are stably transferred to the cell membrane where they can act as dominant-negatives. Exact quantification of membrane-associated protein allowed a correlation between the amount of protein at the surface and severity of the BDB1 phenotype. ROR2 is a receptor tyrosine kinase. To identify protein interaction partners, we performed yeast-two-hybrid screening. We identified the LIM domain protein WTIP as an intracellular interaction partner. BDB1 is characterized by hypoplasia/aplasia of distal phalanges. We assessed the pathomechanism of BDB1 using the chicken and the mouse as model systems. Viral overexpression of proteins carrying BDB1 mutations in the chick showed that these act as dominant-negatives. A mouse model carrying the exact copy of a human BDB1 mutation (p.W749X) knocked into the mouse Ror2 locus recapitulated the BDB1 phenotype. This mouse showed aplasia of the middle phalanx in all digits, which was caused by a failure of elongation of the initial condensation in the autopode and a following failure of formation of a distal joint. In summary, our results contributed to expanding the mutational spectrum of human limb malformation syndromes and added to the functional and molecular characterization of their pathogenesis.

The vertebrate tail is unique for each species and fulfils a broad spectrum of functions. In the axolotl (Ambystoma mexicanum), a tailed amphibian, the tail constitutes one-third of the full body length and is necessary for swimming. Despite its size, most of the tail's tissues are derived from the posterior neural plate of the neurula. Although giving rise to neuronal structures of the central nervous system along most of its length, the most posterior part of the neural plate develops preponderantly into presomitic mesoderm (PSM) which forms muscle, bone and cartilage of the tail and posterior trunk. During development, the posterior neural plate reverses its orientation during an anterior turn movement (Taniguchi et al., 2017). Cells of the most posterior plate region become now localised in an anterior position while previously more anterior neural plate cells land at a more posterior site. Simultaneously, the axial neural tube and notochord extend themselves posteriorly. The PSM, developing bilaterally to the central axis, is integrated into posterior tail expansion while forming new somites at its anterior end. It is still elusive which morphological changes the PSM undergoes to facilitate tail formation and posterior elongation of the embryo. Furthermore, it remains enigmatic in what way PSM cells change their shape, orientation, migration behaviour and distribution to meet the requirements needed for adjusting PSM and somite morphology. With homotopic tissue transplantations of posterior neural plate cells from a gfp-expressing donor to a white (d/d) recipient, enabled specific labelling of all mesodermal cells of the tail. Otherwise, mesodermal cells of the trunk and tail can not be distinguished, neither genetically nor morphologically. With this cell labelling approach, the entire tail mesoderm could be imaged in toto. Thus, measurements of the morphological changes of the PSM and cell tracking in 3D was possible during development. With this technique, posterior neural plate cells could be shown to form parts of the posterior neural tube, the entire posterior PSM and the somites of the tail. During this course of development, the PSM becomes longer but does not increase its volume. Only when forming the somites, an increase in volume could be measured in the mesoderm. Single-cell labelling showed an anterior shift of cell movement led by medial PSM cells and followed by more laterally located cells. The anterior displacement happens simultaneously to the posterior elongation of the embryo. A hypothetical push by newly generated cells at the tail tip could be ruled out. Mitotic cells were evenly distributed in all tissues of the tail with a low proliferation rate. The morphological changes and anterior relocations of the tail mesoderm could, therefore, mainly be explained by cell migration. Therefore, further analyses focussed on cell migration, particularly on cellular characteristics displayed during migration such as shape, orientation, volume, distribution and filopodia organisation to obtain more profound information about how PSM cells migrate and contribute to somite formation. The net movement of tail elongation is directed posteriorly regardless of anteriorly relocating PSM cells. That is only feasible if a lateral expansion of the PSM by laterally migrating PSM cells is counteracted. There have been no studies on the lateral boundary so far. In the axolotl, the PSM is covered laterally by a two-layered epidermis and a fibronectin-rich extracellular matrix. After removing the tail epidermis, operated embryos showed missing or malformed tails, especially with lateral and dorsal curvatures and shortenings. Tail mesoderm examined in these cases showed an increased PSM volume and a lateral expansion of the tissue. A nearly normal tail developed when, after removing the epidermis, the embryos developed in 1% agarose supplemented with fibronectin. In contrast, a simple covering of the PSM with a nitrocellulose membrane, incubation in the softer methylcellulose or in agarose without fibronectin did not rescue tail formation. The lateral pressure on the PSM and a fibronectin-rich extracellular matrix seem necessary to preserve the tissue architecture of the PSM during tail formation. This study unravels the behaviour of individual PSM cells during their morphogenesis from single cells in the posterior plate of the neurula until somite formation in the tail bud. Overall, with specific labelling of tail mesodermal cells, their contribution to PSM morphology could be elucidated, and a more detailed model of tail elongation could be proposed: The posterior expansion of the neural tube and notochord pushes the posterior neural plate tissue posteriorly and squeezes the cells into an elongated mediolaterally oriented form. Labelling experiments of small individual cell groups showed that the ventral posteriormost cells are the first to escape this pressure by relocating anteriorly. Then, more anteriorly located cells follow, as well as dorsally located cells. These movements explain the anterior turn. Thereby, mesodermal cells start to migrate randomly, become elongated and change their orientation from mediolateral to anterior-posterior. Random cell migration leads to homogeneous cell mixing, which results in an aligned uniform tissue of trunk and tail PSM. The lateral constriction by the epidermis channels the undirected migration movements in an anterior direction. In this way, cells are directed towards the site of somite formation, the PSM narrows, and the embryo elongates posteriorly. This extension model includes the individual cell behaviour, which on the whole shapes PSM morphology. The analysed dynamic morphological changes of the PSM can be linked to the developmental processes of the tail and the posterior elongation of the axis.:1 Introduction 1.1 Embryonic tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Mechanism of tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.2 Molecular determination of cell populations in the tail bud . . . . . 5 1.2 Axial elongation of the vertebrate body plan . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.1 Anterior body elongation (elongation of the trunk) . . . . . . . . . 8 1.2.2 Posterior body elongation (tail elongation) . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3 Studying tissue morphology during development . . . . . . . . . . . . 11 1.4 Aim of the project . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 12 2 Materials 2.1 Chemicals and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2 Antibodies and dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3 Techniqual equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3 Methods 3.1 Animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.1.1 Breeding of axolotls and embryo collection . . . . . . . . . . . . 19 3.1.2 Injections with the vital dye DiI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.1.3 Tissue transplantation techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.2 Immunohistochemical staining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.1 Vibratome sections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.2 Whole-mount staining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.3 Optical tissue clearing protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.3.1 Ethyl cinnamate based optical tissue clearing protocol . . . . . . . 21 3.3.2 SeeDB optical clearing protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4 Image analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4.1 3D image generation and processing . . . . . . . . . . .. . . . . . 22 3.4.2 Length measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4.3 Manual segmentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.4.4 Automatic segmentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5 Determination of cellular parameters . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . 25 3.5.1 Cell shape . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.2 Cell and tissue volume . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.3 Cellular distribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.4 Closest neighbour analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.5.5 Cell orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.5.6 Length and orientation of filopodia . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.5.7 Distance of cells to a plane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.5.8 Mitotic rate and spindle orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4 Results 4.1 The presomitic mesoderm is associated with axial elongation. . . . . . 33 4.1.1 Elongation of the body axis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 4.1.2 Contribution of different tissues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 4.1.3 Differential contribution of mesoderm and epidermis . . . . . . . . . 40 4.1.4 Dual potential of mesodermal progenitors . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.1.5 Mesodermal tissue expansion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.2 Cellular behaviour influences mesodermal morphology . . . . . . . . . 50 4.2.1 Cell division . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.2 Positional changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.2.3 Cellular characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Cell shape changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Change of cell orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Orientation of filopodia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Cell distribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 4.3 The epidermis fascilitates mesodermal tissue integrity . . . . . . .. . . . 67 4.3.1 Mesodermal tissue integrity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4.3.2 Malformed tails after epidermis removal . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.3.3 Alteration in mesodermal tissue dimensions . . . . . . . . . . . . . 73 4.3.4 Alteration of cell density after epidermis removal . . . . . . . . . . 77 4.3.5 Rescue of tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 5 Discussion 5.1 Cell migration of the presomitic mesodermal cells . . . . . . . . .. . . . 85 5.1.1 Continuity of gastrulation movements . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.2 Directed migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.1.3 Random cell migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.1.4 Lateral mechanical constriction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.2 Non-volumetric growth of the presomitic mesoderm . . . . . . . . . . . . . 91 5.3 Models of tail presomitic mesoderm formation . . . . . . . . . . . . . . . . 93 Der Schwanz der Wirbeltiere ist bei jeder Art einzigartig und erfüllt ein breites Spektrum an Funktionen. Beim Salamander Axolotl (Ambystoma mexicanum), macht der Schwanz ein Drittel der gesamten Körperlänge aus und ist zum Schwimmen notwendig. Trotz seiner Größe stammen die meisten Gewebe des Schwanzes von der posterioren Neuralplatte der Neurula ab. Obwohl der größte Teil der Neuralplatte neuronale Strukturen des Zentralnervensystems hervorbringt, entwickelt sich der posteriore Teil der Neuralplatte überwiegend zu präsomitischem Mesoderm (PSM), das Muskeln, Knochen und Knorpel des Schwanzes und des hinteren Rumpfes bildet. Während der Entwicklung kehrt die posteriore Neuralplatte ihre Orientierung in einer anterioren Drehbewegung um (Taniguchi et al., 2017). Zellen der hintersten Plattenregion werden in eine anteriore Position verschoben, während zuvor anteriorere Neuralplattenzellen an einer posterioren Stelle landen. Gleichzeitig verlängert sich das axiale Neuralrohr und das Notochord nach posterior. Das PSM, das sich bilateral zur Zentralachse entwickelt, ist im Prozess der Schwanzverlängerung involviert, während es gleichzeitig an seinem vorderen Ende neue Somiten bildet. Es ist immer noch unklar, welche morphologischen Veränderungen das PSM durchläuft, um die Schwanzbildung und die posteriore Ausdehnung des Embryos zu ermöglichen. Darüber hinaus ist unbekannt, auf welche Weise PSM-Zellen ihre Form, Orientierung, ihr Migrationsverhalten und ihre Verteilung ändern, die für eine Veränderung der PSM- und Somitenmorphologie erforderlich sind. Mit homotopen Gewebetransplantationen von posterioren Neuralplattenzellen von einem gfp-exprimierenden Spender auf einen weißen (d/d) Empfänger, konnte eine spezifische Markierung aller mesodermalen Zellen des Schwanzes erreicht werden. Andernfalls können mesodermale Zellen des Rumpfes und des Schwanzes weder genetisch noch morphologisch unterschieden werden. Mit diesem Zellmarkierungsansatz konnte das gesamte Schwanzmesoderm in toto abgebildet werden. So waren Messungen der morphologischen Veränderungen des PSM und Zellverfolgung in 3D während der Entwicklung möglich. Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, dass die Zellen der posterioren Neuralplatte Teile des posterioren Neuralrohrs, das gesamte posteriore PSM und die Somiten des Schwanzes bilden. Dabei wird das PSM länger, ohne sein Volumen zu vergrößern. Erst während der Bildung von Somiten wurde eine Volumenzunahme gemessen Einzelzellmarkierungen zeigten eine anteriore Verschiebung der Zellen, angeführt von medialen PSM-Zellen und gefolgt von lateral gelegenen Zellen. Diese anteriore Verschiebung geschieht gleichzeitig mit der posterioren Streckung des Embryos. Ein hypothetischer Schub durch neugebildete Zellen an der Schwanzspitze konnte ausgeschlossen werden. Mitotischen Zellen waren gleichmäßig in allen Geweben des Schwanzes verteilt und wiesen eine geringe Proliferationsrate auf. Die morphologischen Veränderungen und anterioren Verlagerungen des Schwanzmesoderms können daher hauptsächlich durch Zellmigration erklärt werden. Die Analysen konzentrierten sich daher auf die Zellmigration, insbesondere auf die zellulären Charakteristika, die sich während der Migration zeigen, wie z.B. Form, Orientierung, Volumen, Verteilung und Filopodienorganisation. So konnten neue Informationen darüber gewonnen werden, wie PSM-Zellen wandern und zur Somitenbildung beitragen. Die Nettobewegung der Schwanzverlängerung ist, unabhängig von nach anterior wandernden PSM-Zellen, nach posterior gerichtet. Das ist nur möglich, wenn einer lateralen Ausdehnung des PSM durch ungerichtet migrierenden Zellen entgegengewirkt wird. Über die Rolle einer laterale Begrenzung bei diesem Prozess gibt es bisher keine Untersuchungen. Beim Axolotl ist das PSM seitlich von einer zweischichtigen Epidermis und einer Fibronektin-reichen extrazellulären Matrix bedeckt. Nach Entfernung der Schwanzepidermis zeigten operierte Embryonen fehlende oder missgebildete Schwänze, insbesondere mit einer lateralen und dorsalen Krümmung und einer Verkürzung. Untersuchungen des Schwanzmesoderms zeigten ein erhöhtes PSM-Volumen und eine laterale Ausdehnung des Gewebes. Ein nahezu normaler Schwanz entwickelte sich, wenn die Embryonen nach Entfernung der Epidermis mit 1% Agarose, ergänzt mit Fibronektin, bedeckt wurden. Im Gegensatz dazu konnte eine einfache Abdeckung des PSM mit einer Nitrozellulosemembran, die Inkubation in der weicheren Methylzellulose oder in Agarose ohne Fibronektin die Schwanzbildung nicht normalisieren. Der seitliche Druck auf das PSM und eine Fibronektin-reiche extrazelluläre Matrix scheinen notwendig zu sein, um die Gewebearchitektur des PSM während der Schwanzbildung zu erhalten. Diese Studie zeigt das Verhalten einzelner PSM-Zellen während der Morphogenese der hinteren Neuralplatte bis zur Somitenbildung. Insgesamt konnte durch die spezifische Markierung von mesodermalen Zellen des Schwanzes deren Beitrag zur PSM-Morphologie aufgeklärt und ein detaillierteres Modell der Schwanzverlängerung vorgeschlagen werden: Die posteriore Ausdehnung des Neuralrohrs und des Notochords schiebt das posteriore Neuralplattengewebe nach hinten und quetscht die Zellen in eine verlängerte, mediolateral orientierte Form. Markierungsexperimente einzelner Zellgruppen zeigten, dass die ventralen, posterior gelegenen Zellen diesem Druck als erste entkommen, indem sie sich nach anterior verschieben. Ihnen folgen weiter anterior gelegene Zellen sowie dorsal gelegene Zellen. Diese Bewegungen erklären die anteriore Drehung. Dabei beginnen mesodermale Zellen ungerichtet zu wandern, verlängern sich und ändern ihre Orientierung von mediolateral nach anterior-posterior. Die ungerichtete Zellwanderung führt zu einer homogenen Zelldurchmischung, so dass zusammen mit dem PSM des Rumpfes ein einheitliches Gewebe gebildet wird. Die laterale Begrenzung durch die Epidermis kanalisiert die ungerichteten Migrationsbewegungen in anteriore Richtung. Auf diese Weise werden die Zellen in Richtung der Somitenbildungsstelle gelenkt, das PSM verengt sich, und der Embryo streckt sich nach hinten. Dieses Ausdehnungsmodell beinhaltet das individuelle Zellverhalten, das insgesamt die Morphologie des PSM prägt. Die analysierten dynamischen morphologischen Veränderungen des PSM können mit Schwanzentwicklungsprozessen und der posterioren Elongation der Achse in Verbindung gebracht werden.:1 Introduction 1.1 Embryonic tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.1 Mechanism of tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1.1.2 Molecular determination of cell populations in the tail bud . . . . . 5 1.2 Axial elongation of the vertebrate body plan . . . . . . . . . . . . . . . . . 8 1.2.1 Anterior body elongation (elongation of the trunk) . . . . . . . . . 8 1.2.2 Posterior body elongation (tail elongation) . . . . . . . . . . . . . . 9 1.3 Studying tissue morphology during development . . . . . . . . . . . . 11 1.4 Aim of the project . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . 12 2 Materials 2.1 Chemicals and solutions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 2.2 Antibodies and dyes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.3 Techniqual equipment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 2.4 Software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18 3 Methods 3.1 Animals . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.1.1 Breeding of axolotls and embryo collection . . . . . . . . . . . . 19 3.1.2 Injections with the vital dye DiI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.1.3 Tissue transplantation techniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19 3.2 Immunohistochemical staining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.1 Vibratome sections . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20 3.2.2 Whole-mount staining . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.3 Optical tissue clearing protocols . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21 3.3.1 Ethyl cinnamate based optical tissue clearing protocol . . . . . . . 21 3.3.2 SeeDB optical clearing protocol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4 Image analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4.1 3D image generation and processing . . . . . . . . . . .. . . . . . 22 3.4.2 Length measurements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22 3.4.3 Manual segmentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 3.4.4 Automatic segmentation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5 Determination of cellular parameters . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . 25 3.5.1 Cell shape . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.2 Cell and tissue volume . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.3 Cellular distribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25 3.5.4 Closest neighbour analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 3.5.5 Cell orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 3.5.6 Length and orientation of filopodia . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.5.7 Distance of cells to a plane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31 3.5.8 Mitotic rate and spindle orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 4 Results 4.1 The presomitic mesoderm is associated with axial elongation. . . . . . 33 4.1.1 Elongation of the body axis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33 4.1.2 Contribution of different tissues . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34 4.1.3 Differential contribution of mesoderm and epidermis . . . . . . . . . 40 4.1.4 Dual potential of mesodermal progenitors . . . . . . . . . . . . . . . 42 4.1.5 Mesodermal tissue expansion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 4.2 Cellular behaviour influences mesodermal morphology . . . . . . . . . 50 4.2.1 Cell division . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50 4.2.2 Positional changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 4.2.3 Cellular characteristics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Cell shape changes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 Change of cell orientation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Orientation of filopodia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63 Cell distribution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66 4.3 The epidermis fascilitates mesodermal tissue integrity . . . . . . .. . . . 67 4.3.1 Mesodermal tissue integrity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68 4.3.2 Malformed tails after epidermis removal . . . . . . . . . . . . . . . 70 4.3.3 Alteration in mesodermal tissue dimensions . . . . . . . . . . . . . 73 4.3.4 Alteration of cell density after epidermis removal . . . . . . . . . . 77 4.3.5 Rescue of tail formation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80 5 Discussion 5.1 Cell migration of the presomitic mesodermal cells . . . . . . . . .. . . . 85 5.1.1 Continuity of gastrulation movements . . . . . . . . . . . . . . . . . 85 5.1.2 Directed migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86 5.1.3 Random cell migration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 5.1.4 Lateral mechanical constriction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 5.2 Non-volumetric growth of the presomitic mesoderm . . . . . . . . . . . . . 91 5.3 Models of tail presomitic mesoderm formation . . . . . . . . . . . . . . . . 93

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle des Proteins Neurofibromin in skelettalen Muskelzellen zu beschreiben. Ein Verlust von Neurofibromin ist die Ursache von Neurofibromatose I (NF1) - eine der häufigsten Erbkrankheiten weltweit. Die bekanntesten Krankheitssymptome sind Tumore neuroektodermalen Ursprungs. Eine große Zahl der Patienten leidet darüber hinaus an schweren Defekten des muskuloskelettalen Systems. Diese Defekte treten häufig bereits im Kindesalter auf und führen zu Knochendeformationen, einer verminderten Knochendichte und einer erhöhten Prädisposition für Frakturen. Außerdem erhöht eine Reduktion von Muskelkraft und Koordinationsfähigkeit das Risiko für Stürze und Verletzungen und beeinträchtigt die Patienten zusätzlich. Neurofibromatose I wird durch Mutationen im NF1-Gen hervorgerufen. Dieses Gen kodiert für das RAS-GTPase-aktivierende Protein Neurofibromin, welches als Tumorsupressor und Histogenese-Kontrollgen beschrieben wurde. Tumor- und Knochenentwicklung stehen im Mittelpunkt der NF1-Forschung. Die Ursachen verringerter Muskelleistungen wurden bisher allerdings nicht untersucht. In Anbetracht der skelettalen Missbildungen stellt sich jedoch die Frage, ob nicht skelettale und muskuläre Defekte zusammen das klinische Bild hervorrufen. Die vorliegende Arbeit widmet sich der Erforschung des NF1-Pathomechanismus in Muskelzellen. Dafür wurden drei Mausmodelle mithilfe einer konditionellen Knockout-Technik erzeugt. Die Technik erlaubte eine Muskelzell-spezifische Deletion des Nf1-Gens zu ausgewählten Zeitpunkten der Embryonalentwicklung. Im ersten Model (Nf1Lbx1) wurde Nf1 in Muskel-Vorläuferzellen ausgeschaltet. Im zweiten Model (Nf1Myf5) sind Myoblasten und im dritten Model (Nf1HSA) Myotuben vom Nf1-Knockout betroffen. Alle Modelle wurden mithilfe von histologischen, immunochemischen, molekularbiologischen und biochemischen Methoden hinsichtlich der vier Phasen der Muskelentwicklung - embryonale, fetale, perinatale und adulte Myogenese - untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass ein Verlust von Nf1 ein reduziertes Muskelfaser-Wachstums hervorruft. Diese Reduktion konnte erstmalig im fetalen Stadium der Myogenese bei Tag E18.5 detektiert werden. Sie wird durch den Nf1-Verlust in Muskel-Vorläuferzellen beziehungsweise Myoblasten, nicht jedoch in Myotuben, ausgelöst. Die Größenreduktion der Muskelfasern geht hauptsächlich auf eine Verminderung der myonukleären Domäne (zellulärer Proteingehalt pro Zellkern) zurück. Der Verlust von Nf1 löst zudem einen transienten Anstieg der Zahl Pax7+ Vorläuferzellen im fetalen Stadium aus. Nach der Geburt nimmt deren Zahl wiederum verstärkt ab, wahrscheinlich durch eine Erschöpfung des Zellpools. Dadurch verringert sich die Anzahl sogenannter Satellitenzellen, residenter Muskelstammzellen. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass Nf1 maßgeblich an der Regulation von Muskelfaser-Identität und metabolischen Parametern beteiligt ist. Die Untersuchung von Nf1- und Ras-assoziierten Signalwegen ergab eine erhöhte Aktivierung der Akt-, Mek/Erk- und Nfat-Signalkaskaden durch einen Nf1-Knockout. Eine Reihe von transkriptionellen Zielgenen dieser Signalwege konnte als möglicher Auslöser der beschriebenen Wachtums- und Metabolismusdefekte identifiziert werden. Die Ergebnisse zeigen, dass Nf1 wichtige Funktionen in skeletalen Muskelzellen übernimmt, dies schließt die Differenzierung von Pax7+ Vorläuferzellen, das Faserwachstum und die Regulation metabolischer Prozesse ein. Die hier etablierten Mausmodelle rekapitulieren Aspekte des Neurofibromatose I-Krankheitsbildes. Sie sind daher geeignete Forschungsobjekte für weitere Studien zum Pathomechanismus sowie für die Durchführung therapeutischer Tests. The aim of this work was to describe the role of the protein neurofibromin in skeletal muscle cells. Loss of neurofibromin function causes neurofibromatosis I (NF1) - one of the most common genetic disorders worldwide. Although the most prominent symptoms of NF1 are tumours of neuroectodermal origin, a high fraction of patients suffers from pathological changes of the musculoskeletal system. These symptoms mostly appear in early childhood and include bone malformations, decreased bone density and a high predisposition to fractures. An additional reduction of muscular strength and coordination skills increases the risk of falls and injuries which altogether contributes to tremendous restrictions of patients' health and life quality. Neurofibromatosis I is caused by mutations in the gene NF1. The gene encodes for the RAS GTPase activating protein neurofibromin, which is described as a tumour suppressor and histogenesis control gene. Although considerable research was performed on tumourgenesis and skeletogenesis in NF1 patients, the aspect of putative muscular defects has not been investigated yet. However, in respect to skeletal malformations it seems most likely that a combination of skeletal and muscular defects causes the clinical picture. Therefore, basic pathomechanisms of NF1 in muscle cells were studied in this work. For this purpose, three mouse models were generated using a conditional knockout approach allowing a muscle cell specific Nf1 knockout. In each model Nf1 was deleted in a specific stage of embryonic development. In the first model (Nf1Lbx1) Nf1 was deleted in muscle precursor cells. In the second model (Nf1Myf5) myoblasts were targeted and in the third model (Nf1HSA) Nf1 was deleted in myotubes. The mice were analysed using histological, immunochemical, molecular biological and biochemical methods. Thereby, the four phases of muscle development were analysed: embryonic, fetal, perinatal and adult myogenesis. It could be shown that loss of Nf1 causes a decrease in muscle fibre growth. This decrease was first detected in the fetal phase of myogenesis at embryonic day E18.5. It was detected only if Nf1 was deleted in precursor cells or myoblasts, but not if deleted in myotubes. The fibre size reduction was mainly due to reduction of the myonuclear domain (cellular protein content per nucleus). Furthermore, it was detected that the number of Pax7+ progenitor cells showed a transient increase in the fetal stage upon deletion of Nf1. However, postnatally the Nf1 deletion resulted in strong depletion of Pax7+ progenitor cell numbers. That leads to a diminished cell pool of muscle stem cells, so called satellite cells, which are responsible for muscle regeneration. Also, it seems that Nf1 has a role in fibre type determination and regulation of metabolic parameters as loss of Nf1 caused a shift towards oxidative fibre characteristics. Investigations of molecular pathways in muscle tissue showed that deletion of Nf1 leads to significant over-activation of the Ras downstream components Erk/Mek, Akt and Nfat as well as transcriptional upregulation of their downstream targets which might be responsible for the detected growth and metabolism defects. The results show that Nf1 has several roles in skeletal muscle cells, including differentiation of Pax7+ precursor cells, fibre growth and regulation of metabolic characteristics. The described mouse models recapitulated aspects of neurofibromatosis I associated muscle defects like the decrease of muscle size. Therefore, they are suitable for further studies and therapy testing in the process of neurofibromatosis I research.