Search

Scientific Reports 10, 21612 (2020). doi:10.1038/s41598-020-77884-4, Published by Macmillan Publishers, [London]

The research work was supported by the Spanish Institute of Health Carlos III (COV-20/00792) and by the European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), through CSIC's Global Health Platform (PTI Salud Global). MAR-H acknowledges support from the Spanish Institute of Health Carlos III and the European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), through CSIC's Global Health Platform (PTI Salud Global). DC is supported by a predoctoral iPFIS (IFI 19/00048) funded by Spanish Institute of Health Carlos III. MN-N is supported by the Rio Hortega contract (CM20/00074)., IL-6 is one of the major mediators of the hyper-inflammatory responses with complex biological functions as it can signal via different modes of action. IL-6 by classical signalling has anti-inflammatory and antibacterial activities, while trans-signalling mediates proinflammatory effects. The net biological effect of IL-6 is established by multiple factors beyond its absolute concentration. Here, we assess the relationship between IL-6 signalling variables [IL-6, soluble IL-6R (sIL-6R) and soluble gp130 (sgp130)] and outcomes in a cohort of 366 COVID-19 patients. The potential trans-signalling was evaluated by a ratio between the pro-inflammatory binary IL-6:sIL-6R complex and the inactive ternary IL-6:sIL-6R:sgp130 complex (binary/ternary complex) and the fold molar excess of sgp130 over sIL-6R (FME). Our data provide new evidence that high levels of IL- 6, sIL-6R, sgp130, binary/ternary complex ratio, and low FME are independent predictors of COVID-19 severity in survivor patients (without death), and the combination of IL-6 + sIL-6R + sgp130 exhibited the most robust classification capacity. Conversely, in a subgroup of patients with a very poor prognosis, we found that high levels of IL-6 and low levels of sIL-6R, sgp130, and binary/ternary complex ratio were predictors of death. In this context, the highest predictive capacity corresponded to the combined analysis of IL-6 + FME + lymphopenia + creatinine. Herein, we present IL-6 signalling variables as a helpful tool for the early identification and stratification of patients with clear implications for treatment and clinical decision-making., Spanish Institute of Health Carlos III (COV-20/00792), European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), CSIC's Global Health Platform (PTI Salud Global), Spanish Institute of Health Carlos III and the European Commission - NextgenerationEU (Regulation EU 2020/2094), iPFIS (IFI 19/00048) funded by Spanish Institute of Health Carlos III, Rio Hortega contract (CM20/00074)

Supplemental Digital Content is available in the text., Background: The Asp358Ala variant (rs2228145; A>C) in the IL (interleukin)-6 receptor (IL6R) gene has been implicated in the development of abdominal aortic aneurysms (AAAs), but its effect on AAA growth over time is not known. We aimed to investigate the clinical association between the IL6R-Asp358Ala variant and AAA growth and to assess the effect of blocking the IL-6 signaling pathway in mouse models of aortic aneurysm rupture or dissection. Methods: Using data from 2863 participants with AAA from 9 prospective cohorts, age- and sex-adjusted mixed-effects linear regression models were used to estimate the association between the IL6R-Asp358Ala variant and annual change in AAA diameter (mm/y). In a series of complementary randomized trials in mice, the effect of blocking the IL-6 signaling pathways was assessed on plasma biomarkers, systolic blood pressure, aneurysm diameter, and time to aortic rupture and death. Results: After adjusting for age and sex, baseline aneurysm size was 0.55 mm (95% CI, 0.13–0.98 mm) smaller per copy of the minor allele [C] of the Asp358Ala variant. Change in AAA growth was −0.06 mm per year (−0.18 to 0.06) per copy of the minor allele; a result that was not statistically significant. Although all available worldwide data were used, the genetic analyses were not powered for an effect size as small as that observed. In 2 mouse models of AAA, selective blockage of the IL-6 trans-signaling pathway, but not combined blockage of both, the classical and trans-signaling pathways, was associated with improved survival (P

While thousands of breast cancer cells disseminate and home to bone marrow (BM) until primary surgery, usually less than a handful will succeed in establishing manifest metastases months to years later. Signals and mechanisms determining failure or success of disseminated cancer cells (DCCs) are largely unknown and there is no in vivo model available to study the spontaneous progression and genomic evolution from early bone marrow infiltration to manifestation of bone metastasis, as spontaneous or transgenic mouse models do not generate bone metastases. We therefore profiled DCCs from BM of breast cancer patients long before manifestation of metastasis by RNAseq to identify signals supporting survival or outgrowth of DCCs and identified IL6/PTEN/PI3K signaling as candidate pathway for DCC activation. Since early DCCs often display close-to-normal genomes we used mammary epithelial cells ex vivo isolated from reduction mammoplasties and immortalized pre-malignant breast cancer cell lines as model for functional testing in vitro. Using specific activators and inhibitors of IL6 signaling revealed that IL6 trans, but not classical signaling, regulates stemness of mammary epithelial cells. Moreover, knock-down of PTEN revealed that PI3K/PTEN pathway activation renders cells independent of IL6 trans-signaling. Interestingly, gp130 expression, a pre-requisite for IL6 trans-signaling was found to be down-regulated by bone marrow stromal and endosteal, but not vascular niche cells, and as a consequence the number of cells with stem-like ability was significantly reduced. Consistent with a bottleneck function of microenvironmental DCC control, we found PIK3CA mutations highly associated with late-stage metastatic DCCs and CTCs while generally absent in early DCCs. Our data suggest that the initial steps of metastasis formation depend on microenvironmental signals and are not cancer cell-autonomous.

These days, the important role of retinoids in adult brain functionality and homeostasis is well accepted and has been proven by genomic as well as non-genomic mechanisms. In the healthy brain, numerous biological processes, e.g., cell proliferation, neurogenesis, dendritic spine formation as well as modulation of the immune system, have been attributed to retinoid signaling. This, together with the finding that retinoid metabolism is impaired in Alzheimer’s disease (AD), led to preclinical and early clinical testing of natural and synthetic retinoids as innovative pharmaceuticals with multifactorial properties. Acitretin, an aromatic retinoid, was found to exert an anti-amyloidogenic effect in mouse models for AD as well as in human patients by stimulating the alpha-secretase ADAM10. The lipophilic drug was already demonstrated to easily pass the blood brain barrier after i.p. administration and evoked increased nest building capability in the 5xFAD mouse model. Additionally, we analyzed the immune-modulatory capacity of acitretin via a multiplex array in the 5xFAD mouse model and evaluated some of our findings in human CSF derived from a pilot study using acitretin. Although several serum analytes did not display changes, Interleukin-6 (IL-6) was found to be significantly increased in both—mouse and human neural material. This demonstrates that acitretin exerts an immune stimulatory effect—besides the alpha-secretase induction—which could impact the alleviation of learning and memory disabilities observed in the mouse model.

A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 17 has been implicated in many shedding processes. Major substrates of ADAM17 are TNF-α, IL-6R, and ligands of the epidermal growth factor receptor. The essential role of the protease is emphasized by the fact that ADAM17 deficiency is lethal in mice. To study ADAM17 function in vivo, we generated viable hypomorphic ADAM17 mice called ADAM17ex/ex mice. Recent studies indicated regulation of proteolytic ADAM17 activity by cellular processes such as cytoplasmic phosphorylation and removal of the prodomain by furin cleavage. Maturation and thus activation of ADAM17 is not fully understood. So far, studies of ADAM17 maturation have been mainly limited to mouse embryonic fibroblasts or transfected cell lines relying on nonphysiologic stimuli such as phorbol esters, thus making interpretation of the results difficult in a physiologic context. In this article, we present a robust cell system to study ADAM17 maturation and function in primary cells of the immune system. To this end, HoxB8 conditionally immortalized macrophage precursor cell lines were derived from bone marrow of wild-type and hypomorphic ADAM17ex/ex mice, which are devoid of measurable ADAM17 activity. ADAM17 mutants were stably expressed in macrophage precursor cells, differentiated to macrophages under different growth factor conditions (M-CSF versus GM-CSF), and analyzed for cellular localization, proteolytic activity, and podosome disassembly. Our study reveals maturation and activity of ADAM17 in a more physiological-immune cell system. We show that this cell system can be further exploited for genetic modifications of ADAM17 and for studying its function in immune cells.

Interleukin‐6 (IL‐6) participates in the host response to injury and infection in the central nervous system (CNS). We identified strawberry notch homolog 2 (Sbno2) as an IL‐6‐stimulated gene in murine astrocytes. Sbno2 is a mouse homolog of the sno gene in Drosophila but little is known about the regulation or function of the mammalian gene. Here we examined the regulation of the Sbno2 gene in astrocytes in vitro and in the murine CNS following systemic endotoxin administration. In murine and human cultured astrocytes, Sbno2 gene expression was significantly upregulated in a dose‐ and time‐dependent fashion by hyper‐IL‐6 (IL‐6 + soluble IL‐6 receptor). The level of Sbno2 mRNA was also upregulated significantly in murine astrocytes by other glycoprotein130 cytokine‐family members and the pro‐inflammatory cytokines interleukin‐1 beta and tumor necrosis factor alpha. These changes were reflected by corresponding alterations in the level of the SBNO2 protein. Inhibiting protein synthesis resulted in higher Sbno2 mRNA and did not abolish the upregulation of Sbno2 mRNA mediated by hyper‐IL‐6. Inhibition of transcription led to a rapid reduction in hyper‐IL‐6‐induced Sbno2 mRNA in astrocytes suggesting that the Sbno2 mRNA is quite unstable. Following intra‐peritoneal lipopolysaccharide injection in mice, Sbno2 mRNA levels in the brain were significantly increased. Cellular localization studies revealed that this increase in Sbno2 mRNA occurred predominantly in astrocytes and in the choroid plexus and in some microglia, endothelial cells, and neurons. These findings are consistent with SBNO2 functioning as an acute inflammatory response gene in astrocytes as well as other cells in the CNS. GLIA 2015;63:1738–1752

Background & aims: Inhibitors of the epidermal growth factor receptor (EGFR) are the first-line therapy for patients with metastatic colorectal tumors without RAS mutations. However, EGFR inhibitors are ineffective in these patients, and tumor level of EGFR does not associate with response to therapy. We screened human colorectal tumors for EGFR-positive myeloid cells and investigated their association with patient outcome. We also performed studies in mice to evaluate how EGFR expression in tumor cells and myeloid cells contributes to development of colitis-associated cancer and ApcMin-dependent intestinal tumorigenesis. Methods: We performed immunohistochemical and immunofluorescent analyses of 116 colorectal tumor biopsies to determine levels of EGFR in tumor and stroma; we also collected information on tumor stage and patient features and outcomes. We used the Mann-Whitney U and Kruskal-Wallis tests to correlate tumor levels of EGFR with tumor stage, and the Kaplan-Meier method to estimate patients' median survival time. We performed experiments in mice lacking EGFR in intestinal epithelial cells (Villin-Cre; Egfrf/f and Villin-CreERT2; Egfrf/f mice) or myeloid cells (LysM-Cre; Egfrf/f mice) on a mixed background. These mice were bred with ApcMin/+ mice; colitis-associated cancer and colitis were induced by administration of dextran sodium sulfate (DSS), with or without azoxymethane (AOM), respectively. Villin-CreERT2 was activated in developed tumors by administration of tamoxifen to mice. Littermates that expressed full-length EGFR were used as controls. Intestinal tissues were collected; severity of colitis, numbers and size of tumors, and intestinal barrier integrity were assessed by histologic, immunohistochemical, quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, and flow cytometry analyses. Results: We detected EGFR in myeloid cells in the stroma of human colorectal tumors; myeloid cell expression of EGFR associated with tumor metastasis and shorter patient survival time. Mice with deletion of EGFR from myeloid cells formed significantly fewer and smaller tumors than the respective EGFR-expressing controls in an ApcMin/+ background as well as after administration of AOM and DSS. Deletion of EGFR from intestinal epithelial cells did not affect tumor growth. Furthermore, tamoxifen-induced deletion of EGFR from epithelial cells of established intestinal tumors in mice given AOM and DSS did not reduce tumor size. EGFR signaling in myeloid cells promoted activation of STAT3 and expression of survivin in intestinal tumor cells. Mice with deletion of EGFR from myeloid cells developed more severe colitis after DSS administration, characterized by increased intestinal inflammation and intestinal barrier disruption, than control mice or mice with deletion of EGFR from intestinal epithelial cells. EGFR-deficient myeloid cells in the colon of DSS-treated LysM-Cre; Egfrf/f mice had reduced expression of interleukin 6 (IL6), and epithelial STAT3 activation was reduced compared with controls. Administration of recombinant IL6 to LysM-Cre; Egfrf/f mice given DSS protected them from weight loss and restored epithelial proliferation and STAT3 activation, compared with administration of DSS alone to these mice. Conclusions: Increased expression of EGFR in myeloid cells from the colorectal tumor stroma associates with tumor progression and reduced survival time of patients with metastatic colorectal cancer. Deletion of EGFR from myeloid cells, but not intestinal epithelial cells, protects mice from colitis-induced intestinal cancer and ApcMin-dependent intestinal tumorigenesis. Myeloid cell expression of EGFR increases activation of STAT3 and expression of survivin in intestinal epithelial cells and expression of IL6 in colon tissues. These findings indicate that expression of EGFR by myeloid cells of the colorectal tumor stroma, rather than the cancer cells themselves, contributes to tumor development.

Bone healing is a complex process with closely linked phases of inflammation, regeneration, and remodeling. IL-6 may crucially regulate this process; however, the underlying mechanisms are unclear. IL-6 signals are transmitted via the transmembrane glycoprotein 130 by two distinct mechanisms: classic signaling using the membrane-anchored IL-6 receptor and trans-signaling using its soluble form. Herein, we investigated the hypothesis that IL-6 classic and trans-signaling have different functions during bone healing. To investigate fracture healing, 12-week-old C57BL/6J mice underwent a femur osteotomy. To study the function of IL-6 during the inflammatory phase, either an anti–IL-6 antibody, which inhibits IL-6 classic and trans-signaling, or soluble glycoprotein 130 fusion protein, which selectively blocks trans-signaling, was injected after 30 minutes and 48 hours. To analyze IL-6 effects in the repair phase, compounds were injected from day 7 onwards. Global IL-6 inhibition in the early phase after fracture reduced systemic inflammation, the recruitment of immune cells, and bone regeneration, resulting in delayed fracture healing. Global IL-6 inhibition during the repair phase disturbed bone formation and remodeling. In contrast, inhibition of IL-6 trans-signaling exerted minor effects on the immune response and did not influence bone repair, suggesting that the classic pathway accounts for most of the effects observed after global IL-6 inhibition. Our results reveal that IL-6 classic signaling, but not IL-6 trans-signaling, is essential for bone repair., publishedVersion

Prostate cancer (PCa) is the most prevalent cancer in men. Hyperactive STAT3 is thought to be oncogenic in PCa. However, targeting of the IL-6/STAT3 axis in PCa patients has failed to provide therapeutic benefit. Here we show that genetic inactivation of Stat3 or IL-6 signalling in a Pten-deficient PCa mouse model accelerates cancer progression leading to metastasis. Mechanistically, we identify p19(ARF) as a direct Stat3 target. Loss of Stat3 signalling disrupts the ARF-Mdm2-p53 tumour suppressor axis bypassing senescence. Strikingly, we also identify STAT3 and CDKN2A mutations in primary human PCa. STAT3 and CDKN2A deletions co-occurred with high frequency in PCa metastases. In accordance, loss of STAT3 and p14(ARF) expression in patient tumours correlates with increased risk of disease recurrence and metastatic PCa. Thus, STAT3 and ARF may be prognostic markers to stratify high from low risk PCa patients. Our findings challenge the current discussion on therapeutic benefit or risk of IL-6/STAT3 inhibition.

Prostate cancer (PCa) is the most prevalent cancer in men. Hyperactive STAT3 is thought to be oncogenic in PCa. However, targeting of the IL-6/STAT3 axis in PCa patients has failed to provide therapeutic benefit. Here we show that genetic inactivation of Stat3 or IL-6 signalling in a Pten-deficient PCa mouse model accelerates cancer progression leading to metastasis. Mechanistically, we identify p19ARF as a direct Stat3 target. Loss of Stat3 signalling disrupts the ARF–Mdm2–p53 tumour suppressor axis bypassing senescence. Strikingly, we also identify STAT3 and CDKN2A mutations in primary human PCa. STAT3 and CDKN2A deletions co-occurred with high frequency in PCa metastases. In accordance, loss of STAT3 and p14ARF expression in patient tumours correlates with increased risk of disease recurrence and metastatic PCa. Thus, STAT3 and ARF may be prognostic markers to stratify high from low risk PCa patients. Our findings challenge the current discussion on therapeutic benefit or risk of IL-6/STAT3 inhibition., IL6-STAT3 signaling is activated in prostate cancer, however inhibiting this pathway has not lead to a survival advantage in patients. Here, Pencik et al. show that loss of the IL6-STAT3 axis in mice and humans leads to metastasis due to loss of ARF, unravelling STAT3 and ARF as potential prognostic markers in prostate cancer.

Ciliary neurotrophic factor (CNTF) has pleiotropic actions on many neuronal populations as well as on glia. Signal transduction by CNTF requires that it bind first to CNTF-R, permitting the recruitment of gp130 and LIF-R, forming a tripartite receptor complex. Cells that only express gp130 and LIF-R, but not CNTF-R are refractory to stimulation by CNTF. On many target cells CNTF only acts in the presence of its specific agonistic soluble receptors. We engineered a soluble fusion protein by linking the COOH-terminus of sCNTF-R to the NH2-terminus of CNTF. Recombinant CNTF/sCNTF-R fusion protein (Hyper-CNTF) was successfully expressed in COS-7 cells. The apparent molecular mass of the Hyper-CNTF protein was estimated from western blots to be 75 kDa. Proliferation assays of transfected BAF/3 cells in response to CNTF and Hyper-CNTF were used to verify the activity of the cytokines. The proliferative results confirmed that CNTF required homodimerization of the gp130, CNTF-R and LIF-R receptor subunit whereas Hyper-CNTF required heterodimerization of the gp130 and LIF-R receptor subunit. We concluded that the fusion protein Hyper-CNTF had superagonistic activity on target cells expressing gp130 and LIF-R, but lacking membrane-bound CNTF-R.

IL-6 influences the expression of CEACAM5 and CEACAM6 in the pancreatic cancer cell line Colo357. Colo357 cells were treated with IL-6 (100 ng/ml) in serum-free medium or with the anti-IL-6R- antibody tocilizumab (10 or 100 μg/ml) in serum-containing medium to block endogenous IL-6 signaling for 24 h. RNA was isolated and qPCR performed to analyze the expression of CEACAM5/6. (PDF 95 kb)

Immune cells regulate cell surface receptor expression during their maturation, activation, and motility. Although many of these receptors are regulated largely at the level of expression, protease-mediated ectodomain shedding represents an alternative means of refashioning the surface of immune cells. Shedding is largely attributed to a family of a disintegrin and metalloprotease domain (ADAM) metalloproteases, including ADAM17. Although ADAM17 is well known to contribute to the innate immune response, mainly by releasing TNF-α, much less is known about whether/how this metalloprotease regulates adaptive immunity. To determine whether ADAM17 contributes to regulating adaptive immune responses, we took advantage of ADAM17 hypomorphic (ADAM17ex/ex) mice, in which ADAM17 expression is reduced by 90–95% compared with wild-type littermates. In this study, we show that that ADAM17 deficiency results in spleen and lymph node enlargement, as well as increased levels of Ag-specific class-switched Ig production following immunization with OVA together with anti-CD40 mAbs and polyinosinic-polycytidylic acid. Moreover, we demonstrate that the costimulatory ligand ICOS ligand (ICOSL) is selectively downregulated on the surface of B cells in an ADAM17-specific manner, although it is not proteolitically processed by recombinant ADAM17 in vitro. Finally, we show that higher cell surface levels of ICOSL in ADAM17ex/ex mice may contribute to the development of excessive Ab responses. Therefore, our data suggest a functional link between ADAM17 and ICOSL in controlling adaptive immune responses.

The mitogen-activated protein kinase phosphatase Dusp1 (also known as MKP-1) is essential for control of the inflammatory response to systemic challenge with the lipopolysaccharide of Gram-negative bacteria. Here, we have investigated the consequences of Dusp1-deficiency in colon ascendens stent peritonitis (CASP) and caecal ligation and puncture (CLP), two mouse models of septic peritonitis. Following CASP, Dusp1(-/-) mice had increased serum levels of CCL4, interleukin-10 (IL-10) and IL-6, with differences from wild-type mice being dependent on severity of sepsis. These cytokines, along with inducible nitric oxide synthase messenger RNA, were also expressed at higher levels in spleen and liver. Similar over-production of these cytokines was detected in the CLP model, with even larger differences from wild-type mice. Despite the increased inflammatory response, bacterial clearance was impaired in Dusp1(-/-) mice subjected to CASP and CLP. Dusp1(-/-) mice suffered increased lethality in both peritonitis models. Together our data indicate that exaggerated inflammatory responses to gut bacteria introduced into the peritoneum in the absence of Dusp1 do not help to control bacterial replication but are detrimental for the host.

Regulated recruitment and clearance of neutrophils (PMN) is the hallmark of competent host defense and resolution of inflammation. We now report that IFN-gamma controls PMN infiltration and modulates IL-6 signaling through its soluble receptor (sIL-6R) to promote their apoptosis and clearance. Induction of peritoneal inflammation in IFN-gamma-deficient (IFN-gamma-/-) mice emphasized that the initial rate of PMN recruitment was impaired. This defect in PMN recruitment was also associated with the suppressed intraperitoneal expression of IL-1beta and IL-6. Reconstitution of IFN-gamma signaling restored the rate of PMN infiltration and IL-6 levels and was accompanied by normalization of PMN-activating CXC chemokine expression. To test whether local IL-6 signaling modulated PMN recruitment, inflammation was induced in IFN-gamma-/- and IL-6-/- mice and cytokine signaling adapted by intraperitoneal sIL-6R-IL-6 fusion protein (HYPER-IL-6) or IFN-gamma. Although HYPER-IL-6 attenuated PMN influx in IFN-gamma-/- mice, IFN-gamma had no effect on PMN infiltration in IL-6-/- mice. Examination of the leukocyte infiltrate from IFN-gamma-/-, IL-6-/-, and wild-type mice showed that apoptosis was aberrant in the absence of IFN-gamma and IL-6 as a result of impaired sIL-6R signaling. These data emphasize a pivotal role for IFN-gamma in regulating innate immunity through control of both the recruitment and clearance phases of PMN trafficking.

The molecular consequence of the fever response has been illuminated by a recent study showing that a temperature shift to 40°C resulted in increased leukocyte adhesion to tissue sections, which was mediated by L-selectin activation in lymphocytes. This L-selectin activation during heat responses was dependent on IL-6 trans-signaling via the soluble IL-6R.

The cell wall composition of internodes of deep-water rice plants (Oryza sativa L. cv Habiganj Aman II) which were induced to grow rapidly by submergence in water was compared to that of nonsubmerged plants which grew slowly. No differences could be detected in cellulose, uronic acid, and lignin content expressed on a dry weight basis. Cell wall preparations of rapidly growing, submerged internodes contained more hydroxyproline and had a higher hydration capacity than those of control internodes. The silicon content of submerged rice internodes was considerably lower than that of air-grown plants. The role of silicon as a structural component of the cell wall of grasses is discussed in relation to lodging of deep-water rice plants after the flood waters have receded.

Der Prozess des Ectodomain-Sheddings beschreibt das irreversible Abspalten des extrazellulären Teils von membranständigen Proteinen. So werden unter anderem Wachstumsfaktoren, Adhäsionsmoleküle, Zytokine oder Rezeptoren von der Zelloberfläche durch Sheddasen, wie zum Beispiel A Disintegrin And Metalloprotease (ADAM) 17, abgespalten. Diese ubiquitär exprimierte Metalloprotease zählt zu den wichtigsten Sheddasen und kann über 80 verschiedene Substrate prozessieren. Dadurch ist ADAM17 in eine Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie die Regeneration, Differenzierung, Immunität, (chronische) Inflammation oder Krebs involviert. Eine strikte Regulation der Aktivierung und Maturierung der Protease ist dabei notwendig, jedoch noch nicht vollständig verstanden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten funktionale ADAM17-Varianten charakterisiert und dadurch Erkenntnisse über die posttranskriptionale Prozessierung von ADAM17 gewonnen werden. Dafür wurde das Makrophagen-Vorläufer-Zellsystem (MØP-Zellsystem) etabliert. Dies ist ein physiologischeres Zellsystem zur Analyse von ADAM17, da es auf immortalisierten Immunzellen basiert. Im Zuge dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die cytoplasmatische Domäne und deren Phosphorylierung durch die Polo-like Kinase 2 für die Aktivierung von ADAM17 zu vernachlässigen ist. Im Gegensatz dazu spielt die Abspaltung der Prodomäne durch Furin eine entscheidende Rolle. Die Regulation von Signalwegen ist von großer Bedeutung und führt bei einer Störung zu Krankheiten oder der Entstehung von Krebs. Aufgrund der Beteiligung von ADAM17 an dem EGF-R-Signalwegen über das Shedden des Rezeptors selbst und viele seiner Liganden, wurde diese Protease bereits als wichtiger Faktor in der Entstehung und Progression von Darmkrebs beschrieben. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit die Aktivität und Maturierung von ADAM17-Mutationen analysiert, die in Tumorgewebe von Darmkrebspatienten gefunden wurden. Dabei zeigten die untersuchten Varianten eine verminderte oder unveränderte ADAM17-Aktivität. Interessanterweise beeinträchtigte eine Mutation in der Prodomäne die Funktion und den Transport von ADAM17 am stärksten. Weitere Ergebnisse lassen vermuten, dass nicht nur die Membran-proximale Domäne in der Substraterkennung involviert ist, sondern auch die katalytische Domäne. Die Erkenntnisse dieser Arbeit unterstützen die Hypothese, dass ADAM17 über die Regulation von inflammatorischen Prozessen an der Tumorentstehung beteiligt ist. Im letzten Teil der Arbeit wurde das zuvor etablierte MØP-Zellsystem für die Charakterisierung einer Krankheits-assoziierten ADAM17-Variante verwendet. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Mutation, die sich in der katalytischen Domäne, aber abseits des aktiven Zentrums, befindet, sowohl die Aktivität als auch den Transport an die Zelloberfläche schwerwiegend beeinträchtigt. Diese Erkenntnisse können als Grundlage für die Suche nach therapeutischen Ansätzen dienen.

Inflammatory bowel diseases (IBD) are playing a more and more important socioeconomic role due to increasing incidences. However, the detailed pathophysiology is not fully understood, yet. This is reflected by the yet unsatisfactory treatment efficiency of even the most modern drugs under development. Genetic factors, environmental triggers, lifestyle and microbial signals are interactively contributing to the development of IBD. Coding variants of the IBD risk genes ATG16L1 and XBP1 have been associated with defective autophagy, deregulation of endoplasmic reticulum (ER) function and impaired pathogen clearance. IL-22 is a barrier protective cytokine by inducing regeneration and antimicrobial responses in the intestinal mucosa. Here, we show that XBP1 and ATG16L1 critically orchestrates beneficial IL-22 signalling in intestinal epithelium. IL-22 stimulation physiologically leads to transient ER stress, intracellular release of dsDNA and subsequent activation of the cGAS-STING pathway. Loss of ATG16L1 exacerbates IL-22-induced ER stress and augments STING-dependent IFN-I responses in IECs. IFN-I amplifies epithelial TNFα production downstream of IL-22 and leads to necroptotic cell death. In vivo, IL-22 treatment in Atg16l1ΔIEC mono- and Atg16l1ΔIEC/Xbp1ΔIEC double knockout mice potentiates endogenous ileal inflammation and causes widespread necroptotic epithelial cell death, which can be partially rescued by neutralising the IFN-I signalling using anti-IFNAR antibodies. Under conditions of chronic intestinal inflammation and with clear genetic “hits” to the autophagic and ER stress machinery like in human IBD, however, such a fate of IL-22 signals may crucially contribute to a vicious circle of tissue damage and inflammation.

A disintegrin and metalloproteinase 17 (ADAM17) is the major sheddase involved in the cleavage of a plethora of cytokines, cytokine receptors and growth factors, thereby playing a substantial role in inflammatory and regenerative processes after central nervous system trauma. By making use of a hypomorphic ADAM17 knockin mouse model as well as pharmacological ADAM10/ADAM17 inhibitors, we showed that ADAM17-deficiency or inhibition significantly increases clearance of apoptotic cells, promotes axon growth and improves functional recovery after spinal cord injury (SCI) in mice. Microglia-specific ADAM17-knockout (ADAM17flox(+/+)-Cx3Cr1 Cre(+/-)) mice also showed improved functional recovery similar to hypomorphic ADAM17 mice. In contrast, endothelial-specific (ADAM17flox(+/+)-Cdh5Pacs Cre(+/-)) and macrophage-specific (ADAM17flox(+/+)-LysM Cre(+/-)) ADAM17-knockout mice or bone marrow chimera with transplanted ADAM17-deficient macrophages, displayed no functional improvement compared to wild type mice. These data indicate that ADAM17 expression on microglia cells (and not on macrophages or endothelial cells) plays a detrimental role in inflammation and functional recovery after SCI. The authors thank Prof. Dr. Erik Boddeke (University of Groningen) for his advice and Dr. Leen Timmermans (Hasselt University) for help with the immunohistochemistry. This study was supported by Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO; GOA1413, GOA5813FWO, GO6677 to SH and 11ZQ5.16N to DS). The work of SRJ was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (Bonn, Germany) Grant CRC877 (Project A1, and the German Cluster of Excellence 306, Inflammation at Interfaces').

Eine der häufigsten Ursachen für die Entwicklung einer Herzinsuffizienz ist die dilatative Kardiomyopathie. Deren Entstehung liegt in bis zu 50% eine genetische Ursache zugrunde. Die dabei wirkenden molekularen Mechanismen sind nicht zufriedenstellend verstanden. In Vorversuchen unserer Arbeitsgruppe ist mit dem Calsarcin 1 defizienten Mausmodell gearbeitet worden, welche eine dilatative Kardiomyopathie mit linksventrikulärer Dilatation und Induktion der Hypertrophie assoziierten fötalen Gene ohne Hypertrophie der Kardiomyozyten entwickeln. Ausgehend von diesem Modell ist die microRNA, miR 301 3p, als herunterreguliert identifiziert worden. Ziel dieser Studie war nun die Identifizierung kardialer Zielstrukturen der miR 301a und deren Charakterisierung. Im Verlauf ist Cofilin 2 als Zielstruktur der miR 301a entdeckt worden, was durch Mutation der Bindestellen und Nachweis der in vitro Regulation verifiziert worden ist. Passend zu der verminderten Expression der miR 301a in den Calsarcin 1 defizienten Tieren zeigt sich eine verstärkte Cofilin 2 Expression bei gleichem Phosphorylierungsstatus, welcher auf eine vermehrte Cofilin¬ 2 Aktivität hindeuten kann. Weitere Mausmodelle des Herzversagens haben ebenfalls erhöhte Expressionsniveaus von Cofilin 2 gezeigt. Im Widerspruch zu den Calsarcin 1-/- Tieren ist hier auch miR 301a vermehrt exprimiert. Die hauptsächliche Expression sowohl von miR-301a als auch von Cofilin 2 findet sich dabei in Kardiomyozyten und weniger in kardialen Fibroblasten. Funktionell zeigen miR 301a und Cofilin 2 eine Übereinstimmung in der Regulierung des Serum Response Faktors, da miR 301a inhibierend und Cofilin 2 stimulierend auf die Aktivität des Serum Response Faktors wirken. In neonatalen Kardiomyozyten führt Cofilin 2 zu einer Induktion der Hypertrophie assoziierten Gene ohne Hypertrophie zu induzieren. Zusammenfassend implizieren die erhobenen Daten eine Beteiligung der miR 301a und Cofilin 2 in der Pathogenese der dilatativen Kardiomyopathie.

Der Morbus Crohn und die Colitis ulcerosa stellen die beiden Hauptformen der chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) dar, deren polygene Ätiologie zwar bestätigt, jedoch noch nicht abschließend aufgedeckt ist. Im Mausmodell gewonnene Erkenntnisse bezüglich der protektiven Wirkung von Tryptophan bei intestinalen Entzündungen geben Anlass, die Rolle dieser essentiellen Aminosäure bei CED-Patienten näher zu beleuchten und somit ggf. einen weiteren Baustein der Pathogenese der CED aufzudecken. Mithilfe statistischer Korrelationsanalysen wurde in der vorliegenden Arbeit die Beziehung des im Serum gemessenen Tryptophanspiegels zu ausgewählten laborchemischen und klinischen Parametern bei 555 CED-Patienten ermittelt. Darüber hinaus erfolgte in einer Subkohorte die Messung der Tryptophanmetaboliten entlang des Kynureninstoffwechselweges.

Metastasis is the major cause of death in cancer patients. Especially, patients undergoing primary tumor resection are at a high risk of developing metastases. This is partly due to inflammatory stimuli priming the metastatic niche. The pro-inflammatory cytokine tumor necrosis factor α (TNFα) has been shown to promote lung metastases formation in a mouse model. Soluble TNFα is released by the protease a disintegrin and metalloprotease (ADAM) 17 in a process called ectodomain shedding. Albeit ADAM17 has been shown to be overexpressed in primary tumors, its role in metastasis and in particular for tumor cell extravasation and seeding remains elusive. Here we used mouse lines with genetic deficiency of ADAM17 in different tissues and injected either LLC or B16F1 cells intravenously to mimic hematogenic tumor cell metastasis. We demonstrate that endothelial ADAM17 is essential for tumor cell extravasation, seeding and metastases formation. We show that ADAM17 promotes extravasation through enabling death receptor-induced endothelial cell necroptosis. In this context, ADAM17 is essential for TNFα and TNF receptor signaling. We furthermore revealed that tumor cell-secreted CC-chemokine ligand 2 (CCL2) induces ADAM17 activity via protein kinase C (PKC) β. In conclusion, we identified a central role for endothelial ADAM17 during metastases formation, therefore representing a novel, promising target for advanced cancer therapy. Die Bildung von Metastasen ist die Haupttodesursache bei Krebspatienten. Besonders Patienten, die sich einer primären Tumorresektion unterziehen, haben ein hohes Risiko, Metastasen zu entwickeln. Dies ist zum Teil auf Entzündungsreaktionen zurückzuführen, die die metastatische Nische bereiten. Es wurde festgestellt, dass das proinflammatorische Zytokin TNFα die Bildung von Lungenmetastasen im Mausmodell begünstigt. Lösliches TNFα wird durch die Protease a disintegrin and metalloprotease ADAM17 freigesetzt. Dieser Prozess wird ectodomain-shedding genannt. Obwohl gezeigt wurde, dass ADAM17 in Primärtumoren überexprimiert ist, wurde seine Rolle in der Extravasierung von Tumorzellen und in der Ausbildung von Metastasen noch nicht erforscht. In dieser Arbeit verwendeten wir Mauslinien mit einem ADAM17 knock-out in verschiedenen Geweben und injizierten entweder LLC- oder B16F1-Zellen intravenös, um hämatogene Metastasierung nachzuahmen. Wir zeigen, dass ADAM17 in Endothelzellen für die Extravasierung und die Bildung von Metastasen essentiell ist. Dabei begünstigt ADAM17 die Tumorzellextravasierung, indem es die durch Todesrezeptoren induzierte Nekroptose von Endothelzellen ermöglicht. In diesem Zusammenhang ist ADAM17 für den TNFα Signalweg unerlässlich. Wir haben außerdem gezeigt, dass der durch Tumorzellen sekretierte CC-Chemokin-Ligand 2 (CCL2) die ADAM17-Aktivität durch Proteinkinase C (PKC) β induziert. Zusammenfassend haben wir eine zentrale Rolle für ADAM17 in Endothelzellen während der Metastasierung identifiziert und zeigen somit ein neues, vielversprechendes Ziel für die Krebstherapie auf.

Receptor cell-surface levels can be regulated by internalization, proteolytic cleavage of the membrane-bound receptor or synthesis of new receptors. Following internalization, the receptors are either recycled to the cell-surface or degraded in the lysosome. I could show that the IL-6R and gp130 are internalized in a clathrin- and dynamin-dependent manner which was not influenced by IL-6. Furthermore, the ICD of the IL-6R is dispensable for IL-6R internalization, however, I could show that gp130 influences IL-6R internalization to some extent. Following internalization, both receptors are recycled back to the cell surface via Rab11-positive recycling endosomes but are also degraded in the lysosome. Stimulation with IL-6 led to an increase in recycling of both receptors, but only degradation of gp130 in the lysosome was enhanced. Additionally, it was revealed that STAT3 signaling was only activated upon internalization of the IL-6/IL-6R/gp130 signaling complex, indicating that signaling is initiated at endosomes. Only little is known about endogenous stimuli leading to the release of sIL-6R in vivo. I could show that, in humans, activation of TLR2 resulted in an increase in sIL-6R release mainly from monocytes which was generated by proteolytic cleavage of the membrane-bound IL-6R mediated by ADAM10 and 17. Furthermore, TLR2 activation led to the activation of the ERK signaling pathway which was found to differentially regulate the release of IL-6 and sIL-6R. The sIL-6R is also released constitutively but the responsible protease has not been clearly identified so far. Using a screening procedure, cathepsin S was identified as a new protease that can proteolytically cleave the IL-6R. However, cathepsin S uses a different cleavage site in the IL-6R in vitro as has been determined for the sIL-6R in vivo, indicating that it is rather not involved in the generation of the constitutively released sIL-6R. Die Oberflächenexpression von Rezeptoren wird durch Internalisierung, proteolytische Spaltung sowie die Generierung neuer Rezeptoren reguliert. Nach der Internalisierung von Rezeptoren können diese entweder recycled oder im Lysosom abgebaut werden. Ich konnte zeigen, dass IL-6R und gp130 über einen Clathrin- und Dynamin-abhängigen Mechanismus internalisiert werden, wobei IL-6 die Internalisierung nicht beeinflusst. Der intrazelluläre Teil des IL-6R wird für die IL-6R-Internalisierung nicht benötigt, jedoch konnte ich zeigen, dass gp130 die Internalisierung des IL-6R zum Teil beeinflusst. Anschließend an die Internalisierung werden der IL-6R und gp130 sowohl über Rab11-positive Recycling Endosomen an die Zelloberfläche zurück transportiert, als auch im Lysosom abgebaut. Stimulation mit IL-6 führte zu einem erhöhten Recycling beider Rezeptoren, jedoch wurde nur gp130 vermehrt im Lysosom abgebaut. Des Weiteren zeigte sich, dass die STAT3-Signaltransduktion erst nach Internalisierung des IL-6/IL-6R/gp130-Komplexes aktiviert wird, was darauf schließen lässt, dass diese an Endosomen stattfindet. Bislang ist wenig über endogene Aktivatoren der sIL-6R Generierung in vivo bekannt. Ich konnte zeigen, dass im Menschen die Aktivierung von TLR2 zur Generierung des sIL-6R durch proteolytische Spaltung des membrangebundenen IL-6R durch ADAM10 und ADAM17 von Monozyten führt. TLR2-Aktivierung resultierte außerdem in der Aktivierung des ERK-Signalweges, welcher die Freisetzung von sIL-6R und IL-6 gegensätzlich reguliert. Der sIL-6R wird auch konstitutiv gebildet, jedoch ist die hierfür verantwortliche Protease noch nicht eindeutig nachgewiesen. Durch ein Screeningverfahren wurde Cathepsin S als eine neue Protease identifiziert, die den IL-6R proteolytisch spalten kann. Jedoch zeigte sich, dass Cathepsin S in vitro eine andere Schnittstelle im IL-6R verwendet als in vivo nachgewiesen wurde und daher vermutlich keine Rolle in der Generierung des konstitutiv gebildeten sIL-6R spielt.

Chronisch entzündliche Darmerkrankungen (CED), inklusive Morbus Crohn (MC) und Kolitis Ulcerosa (UC) sind chronische, wiederkehrende und destruktive entzündliche Störungen des Verdauungstrakts. Interleukinn-6 (IL-6), mit seinen kontext-abhängigen pro- und antientzündlichen Eigenschaften, ist bekannt als Schlüsselmodulator der Entzündungsantwort in der CED wie auch anderer Entzündungskrankheiten und wird daher als prominentes Ziel für klinische Interventionen gesehen. Sgp130Fc ist der natürliche Inhibitor der löslichen Interleukin-6 Rezeptor Antworten (Transsignalling) und unterdrückt daher die pro-inflammatorischen Effekte von IL-6 während die anti-inflammatorischen Einflüsse von IL-6 durch den membrangebundenen Rezeptor (sogenanntes klassisches Signalling) unberührt bleiben. Wir analysierten den Effekt von transgenetisch erhöhten sgp130Fc Serumspiegeln in der DSS Kolitis und AOM-DSS induzierter Karzinogenese. Obwohl die Injektion von rekombinantem sgp130Fc die Krankheitsaktivität in der DSS Kolitis begrenzt, wird dieses klinische Ergebnis nicht begleitet durch entsprechende Veränderungen in der Krankheitsaktivität in der Mukosa. Im Gegensatz dazu führte ein transgener Anstieg von sgp130Fc zu einem Anstieg der Krankheitsaktivität im Mausmodell der DSS Kolitis, während keine signifikanten Unterschiede in der Histologie beobachtet werden konnten. Der Effekt einer begrenzten Karzinogenese durch injiziertes sgp130Fc zeigte sich nicht bei transgenen sgp130Fc-Mäusen. Letztlich sollte betont werden, dass ein transgen erhöhter Serumspiegel von sgp130Fc einen auffallend unterschiedlichen Effekt bezüglich der Krankheitsaktivität innerhalb der Kolitis hat, als eine vorübergehende Erhöhung des Serumspiegels von sgp130Fc. Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn`s disease (CD) and ulcerative colitis (UC) are chronic, relapsing and destructive inflammatory disorders of the gastrointestinal tract. Interleukin-6 (Il-6), with its context-dependent pro- and anti-inflammatory properties, is known as a key modulator of the inflammatory response in IBD, as well as in other inflammatory diseases and cancer, and therefore regarded as a prominent target for clinical intervention (1). Sgp130Fc is the natural inhibitor of the soluble interleukin-6 receptor transsignaling responses and therefore inhibiting the pro-inflammatory effects of IL-6 while the anti-inflammatory impact of IL-6 via the membrane-bound receptor (so called classical signaling) is left intact. We analyzed the effect of transgenically increased sgp130Fc serum levels in DSS-colitis and AOM-DSS induced tumorgenesis. Although the injection of recombinant sgp130Fc limits the disease activity in DSS-colitis, these changes in clinical outcome are not accompanied by changes in mucosal disease activity. In contrast, the transgenic increase of sgp130Fc leads to an increase in disease activity in the DSS-colitis mouse model, while no significant differences in the histology could be detected. The effect of limited tumorgenesis via injected sgp130Fc could not be seen in the transgenic sgp130Fc mice. Finally, it needs to be pointed out that transgenically elevated serum levels of sgp130Fc have a strikingly different effect on colitis disease activity than temporarily elevated sgp130Fc levels.

IL-6 trans-signaling ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung entzündlicher Erkrankungen wie Rheumatoide Arthritis oder entzündlichen Darmerkrankungen. Es wird gezeigt, wie der für diese Signalart so wichtige lösliche IL-6 Rezeptor in primären Monozyten von versch. Proteasen gebildet wird und beleuchten dies im Rahmen des Differenzierungsvorgangs. IL-6 trans-signaling is a striking process in inflammatory diseases as rheumatoid arthritis and inflammatory bowel disease. It is shown how the soluble IL-6 receptor, which is so important for this kind of signaling, is generated by proteolytic cleavage from different proteases on monocytes. This process is further elucidated in macrophage differentiation.

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems monoklonale RNase H2-defiziente, humane Zelllinien generiert. Diese wiesen signifikante Proliferationsdefizite im Vergleich zu ihren Parentalzellen auf, was auf eine Arretierung des Zellzyklus in der G2-Phase zurückzuführen war. Dieses erste Anzeichen für das Vorliegen von DNA-Schäden konnte unter Verwendung verschiedener Methoden bestätigt werden. So waren RNASEH2A-defiziente Zellen von vermehrten Strangbrüchen, cytoplasmatischen DNA-haltigen Strukturen (sog. Mikronuklei) sowie höheren Mutationsraten betroffen, was als Ausdruck für genomische Instabilität gedeutet wurde. Des Weiteren gab es Hinweise auf eine leicht vermehrte Inkorporation von Ribonukleotiden in die genomische DNA der RNase H2-knockout-Zellen. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit erstmalig festgestellt werden, dass die RNase H2 einen positiven Einfluss auf die Mobilisierung von non-LTR-Retrotransposonen ausübt. Within the framework of this dissertation, monoclonal RNase H2-deficient human cell lines were generated by means of the CRISPR-Cas9 system. They featured a significant proliferative deficit compared to their parental cells that was ascribed to a G2-dependent cell cycle arrest. This first hint towards the existence of DNA-damage could subsequently be confirmed by the use of various techniques. The RNASEH2A-deficient cells were affected by increased numbers of strand breaks as well as cytoplasmic DNA-containing structures called micronuclei plus higher mutation rates, which was interpreted as a signal for elevated genomic instability. In addition to that, a lightly increased incorporation rate of ribonucleotides within the genomic DNA of RNase H2 knockout cells could be detected.Beyond that, it could be proved for the first time within this work that the RNase H2 exerts a positive influence on the mobilisation of non-LTR-retrotransposons.

Die physiologische Bedeutung von ADAM17 besteht in der irreversiblen proteolytischen Regulation von wichtigen Signalwegen wie dem EGFR Signalweg, wobei ADAM17 für die proteolytische Freisetzung von löslichen ErbB-Liganden wie Amphiregulin (AREG) verantwortlich ist. Lösliche EGFR Liganden binden an Rezeptoren der ErbB Rezeptor Tyrosinkinasefamilie, woraufhin sich Homo- oder Heterodimere der ErbB Rezeptoren bilden, welche durch Phosphorylierung aktiviert werden und intrazellulär u.a. Proliferationssignale weiterleiten. Die Expression von ADAM17, AREG und EGFR ist in Tumoren erhöht, was sich physiologisch durch signifikant verstärkte proteolytische Freisetzung von AREG auf intestinalen Epithelzellen äußert. Im Verlauf dieser Arbeit ließ sich dies in vitro bei humanen Kolorektalzelllinien, ex vivo in murinen 3D Organoidzellkulturen und in vivo in Gewebelysaten und Kolonkulturen von ADAM17 defizienten hypomorphen ADAM17ex/ex Mäusen zeigen. Um die pathophysiologische Relevanz von ADAM17 während der Darmkarzinogenese zu bestimmen, wurde im Rahmen dieser Arbeit zum einen ein entzündungsbasiertes Kolitis assoziiertes Darmkrebsmodell und zum anderen ein genetisch prädispositioniertes Modell mit hypomorphen ApcMin/+ ADAM17ex/ex Mäusen etabliert und analysiert. Die Mutation im Adenomatous polyposis coli (Apc) Gen hat eine Dysregulation des Wnt-Signalwegs zur Folge, was zur spontanen Entwicklung einer Vielzahl intestinaler Neoplasien führt. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die ADAM17 Defizienz im CAC Mausmodell zu einer signifikant erhöhten Ausbildung von Karzinomen, assoziiert mit verstärkten Entzündungsmerkmalen, im Kolon führt. Bemerkenswerterweise zeigen die genetisch prädispositionierten ApcMin/+ Mäuse bei ADAM17 Defizienz eine signifikant reduzierte Tumoranzahl und verminderte Zellproliferation, die einheitlich geringgradigen Dysplasien entsprechen. One of the physiological roles of ADAM17 is the proteolytic regulation of important pathways like the EGFR (epidermal growth factor receptor) pathway. ADAM17 cleaves membrane bound ErbB (erythroblastosis oncogene B) ligands such as Amphiregulin (AREG). The soluble ligands bind to receptors of the ErbB receptor tyrosine kinase family and trigger phosphorylation of both homo- or heterodimers of the ErbB receptors. Phosphorylation of ErbB receptors has been shown to activate intracellular signals such as proliferation. Expression and activation of ADAM17, AREG and EGFR is highly upregulated during tumorigenesis, which leads to increased shedding of AREG on intestinal epithelial cells as presented in this thesis. This effect was shown in vitro using human colorectal cancer cells, ex vivo in an established 3D murine organoid culture system and in vivo using tissue lysates and colon cultures from ADAM17 deficent hypomorphic ADAM17ex/ex mice. To identify the pathophysiological relevance of the previous results, the effect of ADAM17 deficiency on tumor formation was investigated in vivo in murine colitis associated cancer (CAC) as a model for inflammation associated colorectal cancer. Further a genetically predisposed colorectal cancer model was chosen, whereby ApcMin/+ mice crossbred with hypomorphic ADAM17ex/ex mice were generated and evaluated in this work. The mutated Adenomatous polyposis coli (Apc) gene results in dysregulation of the Wnt signaling pathway, which leads to a spontaneous development of multiple intestinal neoplasia (Min) in this mouse model. In summary, tumor formation is altered in ADAM17 deficiency CAC mouse model and hypomorphic ADAM17ex/ex mice developed higher numbers of carcinoma coupled with increased intestinal inflammation. Remarkably, the genetically predisposed ApcMin/+ mice deficient for ADAM17 showed a significantly reduced tumor number, diminished cell proliferation and low grade dysplasia

Der Nukleinsäurestoffwechsel ist ein streng reguliertes Netzwerk, dessen Integrität durch eine Vielzahl an Proteinen geschützt wird, die verschiedene Aufgaben in der Synthese, Modifizierung, Degradation und Detektion der unterschiedlichen Nukleinsäurespezies einnehmen. Daher führen Mutationen in diesen Regulatoren zu Erkrankungen wie dem Aicardi-Goutières-Syndrom (AGS), einer entzündlichen Autoimmunerkrankung. Nahezu die Hälfte aller betroffenen Patienten trägt dabei hypomorphe Mutationen in den drei Untereinheiten der RNase H2, einem Enzym, das sowohl den RNA-Anteil von RNA:DNA-Hybriden abbauen als auch einzelne Ribonukleotide aus DNA-Duplexen entfernen kann. Als Ursache des aktivierten Immunsystems bei AGS wird die Akkumulation von unprozessierten Nukleinsäuren aufgrund der enzymalen Dysfunktion postuliert. Dennoch konnte dieses immunstimulierende Substrat bisher nicht identifiziert werden.Unter Nutzung eines induzierbaren, murinen RNase H2-Knock-out-Systems wurde nun in der vorliegenden Arbeit auf in-vitro-Ebene das Auftreten von einzel (ss)- und doppelsträngiger (ds) DNA im Zytoplasma aufgezeigt. Es handelte sich dabei um geschädigte und neu-synthetisierte dsDNA, die sich durch einen nukleären Exportprozess im extranukleären Kompartiment als perinukleäre Körperchen anreicherten und hier vom Sensor cGAS erkannt wurden. Die direkte Kolokalisation dieser Nukleinsäurespezies mit dem detektierenden Protein erklärte zudem mechanistisch die erhöhte Expression der ISGs, einem Hauptmerkmal des Aicardi-Goutières-Syndroms. Neben der Aktivierung des cGAS-STING-Signalweges wurde des Weiteren experimentell aufgezeigt, dass gleichzeitig der Abbau der ektopischen DNA über Autophagie erfolgte und unter Nutzung pharmakologischer mTOR-Inhibitoren zusätzlich verstärkt werden konnte und damit therapeutische Optionen eröffnete. Zuletzt wurde der Zellzustand der zellulären Seneszenz als Antwort auf die Schädigung des Genoms aufgezeigt und dessen Funktion zur Unterdrückung der Akkumulation zytoplasmatischer DNA postuliert.

The Drosophila Dscam1 gene can be spliced into thousands of different isoforms, providing the basis for a cell surface code: Each cell expresses a distinct subset of 10-50 isoforms, rendering its surface uniquely recognizable. The importance of Dscam1 for axonal and dendritic patterning has been demonstrated in numerous in vivo assays. However, surprisingly little is known regarding the signaling pathway of the Dscam1 receptor. This dissertation describes my efforts to understand the molecular mechanisms of neuronal self-recognition. My dissertation is divided into three chapters: The first two chapters consist of two published papers to which I have contributed during my time in the neuronal wiring laboratory. They demonstrate that the Dscam1 receptor is indispensable for the axonal patterning of mechanosensory neurons in the ventral nerve cord of the fly. In contrast to its role in uniform dendritic patterning, it is critical to regulate Dscam1 signaling in some sub-compartments of the outgrowing axons. Such spatial regulation of Dscam1 signaling by the novel ligand Slit and tyrosine-phosphorylation allows the formation of complicated neurite patterns. Dscam1 tyrosine phosphorylation is negatively modulated by the receptor tyrosine phosphatase RPTP69D. In chapter 3, I summarize the results of a combination of proteomic screens. They were aimed at unraveling the Dscam1 signaling complex and at identifying tyrosine phosphorylated proteins that are regulated by Dscam1 signaling. These results link the Dscam1 receptor directly to the actin and tubulin cytoskeleton and suggest that the receptor is capable of physically recruiting components of the translational machinery to the membrane. Furthermore, I found the cytoplasmic domain to be associated with components of the cellular endomembrane system, suggesting that receptor internalization might be an important regulatory mode, fine-tuning the signaling response. Das Drosophila Dscam1-Gen kann in Tausende Isoformen translatiert werden. Diese stellen die Grundlage für einen Zelloberflächencode dar: Jede Zelle exprimiert eine individuelle Kombination von 10-50 Isoformen. Dies verleiht der Zelloberfläche eine einzigartige Identität. Der Belang von Dscam1 für die Bildung von Neuriten-Verzweigungen ist in vivo überzeugend demonstriert worden. Allerdings ist wenig über den Dscam1-Signalweg bekannt. Diese Dissertation dokumentiert meine Bemühungen, die molekularen Mechanismen der neuronalen Selbsterkennung zu verstehen. Meine Dissertation gliedert sich in drei Teile: Die ersten beiden Teile umfassen zwei bereits publizierte Studien, zu denen ich als Autorin beigetragen habe. Diese zeigen, dass Dscam1 unentbehrlich für die Bildung axonaler Verzweigungen von mechanosensorischen Neuronen in der ventralen Nervenschnur der Fliege ist. Im Gegensatz zur Bildung gleichmäßiger dendritischer Muster ist es wichtig, das Dscam1-Signal in Unterregionen des auswachsendenden Axons zu regulieren. Nur wenn solch eine lokale Kontrolle des Dscam1 Signalweges durch den neu identifizierten Liganden Slit und Tyrosin-Phosphorylierung gewährleistet ist, können sich komplexe axonale Verzweigungen bilden. Die Phosphorylierung des Dscam1-Rezeptors wird durch die Rezeptor-Tyrosin-Phosphatase RPTP69D negativ reguliert. Der dritte Teil meiner Dissertation befasst sich mich mit proteomischen Experimenten. Sie waren darauf ausgerichtet Proteine zu identifizieren, die auf ein Dscam1-Signal mit der Veränderung ihres Phosphorylierungs-Status reagieren. Aus den Ergebnissen lässt sich eine direkte Verbindung zwischen Dscam1 und dem Zytoskelett ableiten. Sie legen des weiteren nahe, dass der Rezeptor auch Komponenten der Translationsmaschinerie an die Membran rekrutiert. Die Assoziation von Dscam1 mit Vesikelkomponenten legt auch nahe, dass Endozytose ein wichtiger Modus der feinabgestimmten Signalregulierung sein könnte.

Die limitierte Proteolyse des Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R) führt zur Freisetzung der IL-6R-Ektodomäne. Der so entstandene lösliche IL-6R (sIL-6R) kann mit Interleukin-6 (IL-6) einen agonistischen Komplex bilden, der Glykoprotein130 (gp130) exprimierende Zellen aktiviert, auch wenn diese Zellen keinen membranständigen IL-6R exprimieren. Dieser Signalweg wird als trans-signaling bezeichnet und ist hauptsächlich für die pro-inflammatorischen Prozesse von IL-6 verantwortlich. Die Metalloproteasen A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) ADAM10 und ADAM17 sind die Hauptsheddasen des IL-6R. Obwohl der sIL-6R ein attraktives therapeutisches Ziel ist, ist seine Entstehung im Menschen bis heute größtenteils ungeklärt. In dieser Arbeit konnte zunächst bestätigt werden, dass der Großteil des sIL-6R im humanen Serum nicht durch alternatives Spleißen der IL6R mRNA entsteht. Mit Hilfe von Flüssigkeitschromatographie und Massenspektrometrie konnte ein C-terminales Peptid des humanen sIL-6R aus humanem Serum identifiziert werden, das durch proteolytische Spaltung des membrangebundenen IL-6R zwischen P355 und V356 entstanden ist. Des Weiteren zeigten in vitro Untersuchungen, dass ADAM17 diese Schnittstelle (P355/V356) und nicht die früher beschriebene zwischen Q357 und D358 nutzt. N- und O-Glykosylierung hatte keinen Einfluss auf Zelloberflächenexpression und Signal-transduktion des IL-6R. Das identifizierte N- und O-Glykanpaar in unmittelbarer Nähe der ADAM17-Schnittstelle scheint nur einen geringeren Einfluss auf die ADAM17-vermittelte Proteolyse des IL-6R zu haben. Überraschenderweise wurde die N-Glykosylierung an Position N55 in der Domäne D1 des IL-6R als eine ADAM17-Exosite identifiziert, die die Proteolyse des IL-6R reguliert. Ein IL-6R, dem alle N-Glykosylierungsstellen mittels Punktmutationen entfernt wurden, kann nicht mehr von ADAM17 prozessiert werden, was eine wichtige Rolle der Glykosylierung in der Regulation der sIL-6R-Entstehung unterstreicht. Limited proteolysis of the Interleukin-6-Receptor (IL-6R) leads to the release of the IL-6R-ectodomain. Together with Interleukin-6 (IL-6) the resulting soluble IL-6R (sIL-6R) forms an agonistic complex, which activates glycoprotein 130 (gp130) expressing cells, even if these cells show no IL-6R expression. This signal pathway is called trans-signaling and is mainly associated with pro-inflammatory activities of IL-6. The metalloproteases A disintegrin and metalloproteinase (ADAM) ADAM10 and ADAM17 are the major sheddases of the IL-6R. Although the sIL-6R represents an attractive pharmaceutical target, its generation is mainly unknown. In this study it could be confirmed, that the majority of the sIL-6R in human serum is not generated by alternative splicing of the IL6R mRNA. With the help of liquid chromatography and mass spectrometry a c-terminal peptide of the sIL-6R could be identified in human serum, which was generated by proteolytic cleavage of membrane-bound IL-6R between P355 and V356. Furthermore it could be shown in vitro that ADAM17 cleaves between P355 and V356 and does not use the formerly published cleavage site between Q357 and D358. N- and O-glycosylation showed no influence on cell surface expression and signal transduction of the IL-6R. The identified N- and O-glycan-pair in close proximity to the ADAM17 cleavage site seems to have only a minor influence on ADAM17 mediated proteolysis. Surprisingly, an N-glycosylation at position N55 in the domain D1 was identified as an ADAM17-exosite, which regulates proteolysis of the IL-6R. ADAM17-mediated proteolysis of an IL-6R, in which all N-glycosylation sites were removed is impaired, which underlines an important role of glycosylation in regulating the generation of the sIL-6R.

Interleukin-23 ist Teil der IL-6/IL-12-Superfamile der heterodimeren Zytokine und spielt eine bedeutende Rolle in der Differenzierung von Th17-Zellen und in der Entwicklung entzündlicher Autoimmunerkrankungen. Der IL-23-Rezeptor ist aus zwei Untereinheiten aufgebaut, dem IL-12Rβ1 und dem IL-23R. In Anwesenheit des Liganden IL-23 dimerisieren die beiden Rezeptoren und Signaltransduktion wird ausgelöst. Ziel der Arbeit war die erzwungene Dimerisierung des IL-23-Rezeptorkomplexes mit anschließender Untersuchung seiner Expression und Funktionalität in Abwesenheit des Liganden IL-23. Um dies zu erreichen, wurden die extrazellulären Domänen der IL-23-Rezeptor-Untereinheiten mit IL-15 bzw. IL-15Rα-sushi ersetzt. Diese beiden Proteine binden einander mit hoher Affinität und erzeugen somit die künstliche Dimerisierung der chimären Rezeptoren. Per retroviraler Transduktion wurden beiden Konstrukte IL-15-IL-23R und sushi-IL-12Rß1 in Hyper-IL-6-abhängige Ba/F3 gp130 Zellen integriert. Die Durchführung einer RT-PCR konnte die Expression der Rezeptoren bestätigen und eine durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass die transduzierten Ba/F3 gp130 Zellen den dimeren Rezeptorkomplex auf ihrer Oberfläche tragen. Anhand einer Western Blot Untersuchung konnte gezeigt werden, dass MAPK- und JAK/STAT-Signaltransduktionswege durch die Rezeptoraktivierung angeschaltet wurden, indem die Phosphorylierung der STAT1-, STAT3- und ERK1/2-Proteine nachgewiesen werden konnte. Die intrazelluläre Signaltransduktion resultierte in ligandenunabhängiger Proliferation der Ba/F3 gp130 Zellen, welche mit Hilfe von Proliferationassays überprüft wurde. In Hinblick auf die Bedeutung von IL-23 bei der Entstehung verschiedenster autoimmuner Entzündungserkrankungen wäre es von großem Nutzen, die Funktionsweise des IL-23-Rezeptors unter Verwendung des in dieser Arbeit erstellten konstitutiv aktiven, zytokinunabhängigen IL-23-Rezeptorkomplexes tiefer gehend zu erforschen.

Proteolytic release of ectodomains at the cell membrane, termed ectodomain shedding, is an irreversible post-translational mechanism to regulate protein function. Members of the a disintegrin and metalloprotease (ADAM) family are key enzymes in shedding of receptors and ligands and, hence, influence cell signaling. Conditional deletion of ADAM10 in murine tissues, such as brain or skin, indicates an essential role for the protease in both organ development and tissue integrity. However, the function of ADAM10 in liver physiology in vivo is largely unknown. We show that in mice with a liver specific deletion of ADAM10 tissue homeostasis in the liver is impaired. Development of the biliary tree, which is dependent on the ADAM10 substrate Notch, was not altered in our mice. Still, mice lacking ADAM10 in the liver developed spontaneous necrosis to various degrees. Interestingly, the liver injury did not cause an increase in pro-inflammatory cytokines. Despite regeneration of the necrotic areas, we observed an accumulation of proliferating liver progenitor cells and a persistent activation of hepatic stellate cells leading to a striking liver fibrosis. We detected, in accordance with these findings, enhanced liver progenitor cell mitogen signaling in a liver progenitor cell line in the absence of ADAM10 activity. Our results demonstrate that ADAM10-mediated proteolytic processing seems to be essential in the termination of liver progenitor cell-driven regenerative processes that, if deregulated, lead to chronic liver disease. They furthermore underline the importance of irreversible post-translational modifications for the maintenance of tissue homeostasis. Die proteolytische Abspaltung von extrazellulären Domänen an der Zelloberfläche, auch als Ectodomain-Shedding bezeichnet, ist ein unumkehrbarer post-translationeller Mechanismus zur Regulation der Proteinfunktion. Mitglieder der “A disintegrin and metalloprotease” (ADAM) Familie sind für das Ectodomain-Shedding von vielen Rezeptoren und Liganden verantwortlich und beeinflussen so die zelluläre Kommunikation. Durch gewebsspezifische Knock-Outs von ADAM10, in Gehirn oder Haut von Mäusen, konnte der Protease bereits eine wichtige Funktion sowohl in der Organentwicklung als auch in der Gewebsintegrität zugeordnet werden. Die in vivo Funktion von ADAM10 in der Leber ist jedoch größtenteils unbekannt. Wir zeigen in dieser Studie, dass in Mäusen mit einem leberspezifischen Knock-Out von ADAM10 die Gewebsintegrität der Leber beeinträchtigt ist. Die Entwicklung des Gallengangsystems, für die das ADAM10 Substrat Notch benötigt wird, war in unseren Mäusen nicht beeinträchtigt. Jedoch entwickelten Mäuse mit einem leberspezifischen ADAM10 Knock-Out spontane Nekrosen, die unterschiedlich stark ausgeprägt waren. Interessanterweise bewirkte der Leberschaden keine Erhöhung von entzündungsfördernden Zytokinen. Trotz Reparatur der nekrotischen Gebiete beobachteten wir eine Anhäufung von sich vermehrenden Lebervorläuferzellen und eine damit einhergehende andauernde Aktivierung von Ito-Zellen, die zu einer markanten Leberfibrose führten. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen konnten wir in einer Zelllinie von Lebervorläuferzellen zeigen, dass die Hemmung der ADAM10 Aktivität zu einem erhöhten Mitogensignal führt. Unsere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die proteolytische Spaltung durch ADAM10 wichtig ist für die Beendung von Lebervorläuferzell-abhängiger Regeneration, die unreguliert zu chronischen Lebererkrankungen führt. Sie betonen außerdem die Bedeutung von unumkehrbaren post-translationellen Modifizierungen für die Aufrechterhaltung der Gewebsintegrität.

Ektodomänen-Shedding stellt eine irreversible, posttranslationale Modifikation dar, die unter anderem zur Freisetzung von biologisch aktiven Ektodomänen führt. A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) ist mit über 80 Substraten eine, für physiologische Prozesse wie Entzündungsreaktionen oder Regenerationsprozesse, wichtige Sheddase. Trotz der bedeutenden Rolle von ADAM17 ist bis heute nur wenig über die Regulation ihrer Shedding-Aktivität bekannt. In früheren Studien wurde gezeigt, dass extrazelluäre Proteindisulfidisomerasen (PDIs) mit ADAM17 interagieren und eine strukturelle Änderung innerhalb der Ektodomäne von ADAM17 herbeiführen. Dies hat eine Inaktivierung von ADAM17 zur Folge. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die PDIs mit der membranproximalen Domäne von ADAM17 (MPD17) interagieren und diese durch die Isomerisierung zweier Disulfidbrücken von einer offenen in eine geschlossene Form überführen. Dabei liegt im aktiven ADAM17 die offene, flexible MPD17 vor, während im inaktiven Zustand die MPD17 die geschlossene Form einnimmt. Der Wechsel von der offenen zu der geschlossenen Form reguliert CANDIS (Conserved ADAM-SeventeeN Dynamic Interaction Sequence), ein hochkonservierter Bereich innerhalb der Stalk-Region von ADAM17, der in der Lage ist die beiden Substrate IL-6R und IL-1RII zu binden. Nur wenn die MPD17 in der offenen Form vorliegt, werden diese Substrate von CANDIS gebunden. Die geschlossene MPD17 verhindert hingegen den Zugang der Substrate zu CANDIS. Neue Daten zeigen, dass das ADAM17-vermittelte Shedding-Ereignis durch eine transiente Phosphatidylserin-Translokation ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde in diesem Zusammenhang geklärt, dass nur die offene MPD17, und nicht die geschlossene Form, spezifisch Ortho-Phospho-L-Serin (OPLS) bindet. Daraus lässt sich schließen, dass das Shedding-Ereignis in Zusammenhang mit einer Bindung der offenen MPD17 an die Phosphatidylserinpräsentierende Zellmembran steht. Diese Bindung ist in der geschlossenen, inaktiven Form nicht möglich. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen die fundamentale Bedeutung der MPD17 und CANDIS für die Shedding-Aktivität von ADAM17 und ermöglichen so ein tieferes Verständnis der ADAM17-Regulation. Ectodomain shedding is an irreversible posttranslational modification which leads to the release of biologically active ectodomains of transmembrane proteins. A disintegrin and metalloprotease 17 (ADAM17) is an important sheddase which can cleave more than 80 different substrates and is therefore involved in various physiological and pathophysiological processes, including inflammation and regeneration. Despite the importance of ADAM17, the regulation of the shedding activity is scarcely understood. It is known from previous studies that extracellular protein disulphide isomerases (PDIs) interact with ADAM17 which results in a structural change in the ectodomain of the protease. This interaction leads to the inactivation of ADAM17. In this study, it was shown that the PDIs interact with the membrane-proximal domain of ADAM17 (MPD17) and that this domain can be converted from an open conformation into a closed one through isomerisation of disulphide-bonds. Thereby, the open and more flexible form relates to the active ADAM17 while the MPD17 shows the closed and rather rigid conformation in the inactive protease. The shift from the open to the closed conformation regulates CANDIS (Conserved ADAM Seventeen Dynamic Interaction Sequence), a highly conserved sequence within the stalk region of ADAM17 which is able to bind the two substrates IL-6R and IL-1RII. This interaction can only occur when the MPD17 is in the open conformation while the closed form prevents the interaction between CANDIS and the substrates. Recent results show that ADAM17 mediated shedding can be triggered by transient exposure of phosphatidylserine (PS). Along that line, it was shown in this study that solely the active form of MPD17, but not the closed one, can bind to OPLS (ortho-phospho-l-serine). This leads to the conclusion that an ADAM17 mediated shedding event includes the binding of the open conformation of the MPD17 to the PS-presenting plasma membrane. This binding does not occur when MPD17 is in the closed conformation. In conclusion, this study shows the fundamental relevance of the MPD17 and CANDIS for the shedding activity and allows a deeper understanding of the regulation of ADAM17.

Tim-1 und Tim-4 sind Mitglieder der Tim (T cell Immunoglobulin and Mucin domain) Protein-Familie und spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation von Immunantworten, Immuntoleranz sowie bei der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und Allergien. Während Tim-1 ausschließlich auf antigenpräsentierenden Zellen exprimiert wird, wurde die Tim-4 Expression auf T-Zellen, regulatorischen B-Zellen sowie Dendritischen Zellen nachgewiesen. Eine Reihe von Liganden (Viren, Rezeptoren, Lipide oder Kernproteine) wurde für die Tim-1 und Tim-4 Proteine beschrieben, was auf eine Liganden-spezifische Diversität ihrer Funktion hindeutet. Die Funktion von Tim-1 und Tim-4 ist bislang nicht eindeutig aufgeklärt. Tim-1 und Tim-4 wirken als kostimulierende Moleküle bei der T-Zellaktivierung und können die Phagozytose apoptotischer Zellen als Rezeptoren für Phosphatidylserin vermitteln. Neben seiner Rolle im Immunsystem ist Tim-1 in die Pathogenese der ischämischen Nierenerkrankungen und Nierenzellkrebs involviert. Bei diesen Erkrankungen entsteht lösliches Tim-1 Protein, welches durch proteolytische Spaltung generiert wird. Tim 1 and Tim-4 are members of the Tim (Immunoglobulin and T cell mucin domain) protein family and play a major role in the regulation of immune responses, immune tolerance, as well as in the pathogenesis of autoimmune diseases and allergies. While Tim-4 is only expressed on antigen-presenting cells, Tim-1 expression was detected on T cells, regulatory B cells and dendritic cells. A number of different molecules including viruses, receptors, lipids, or nuclear proteins have been described as ligands for Tim-1 and Tim-4 proteins, suggesting a ligand-specific diversity of their function. The function of Tim-1 and Tim-4 is not completely understood. It was described that Tim-1 and Tim-4 act as costimulatory molecules during T cell activation and are involved in phagocytosis of apoptotic cells. In addition to their role in the immune system Tim-1 is involved in the pathogenesis of ischemic renal disease and renal cell cancer. Soluble Tim-1, which is generated by proteolytic cleavage, is used as a biomarker in these diseases.

Der Seneszenz-assoziierte sekretorische Phänotyp seneszenter Zellen beinhaltet unter anderem die Freisetzung der Ektodomänen membrangebundener Proteine. Unter diesen Proteinen befinden sich auch bekannte Substrate der Metalloprotease ADAM17. Ziel dieser Arbeit war es, die Rolle von ADAM17 bei der Generierung von löslichem TNRFR1 und Amphiregulin, zwei SASP-Komponenten und zugleich ADAM17-Substrate, im Zusammenhang mit zellulärer Seneszenz zu untersuchen. The senescence associated secretory phenotype of senescent cells includes the release of the ectodomaine of membrane bound proteins. Among these proteins there are known substrates of the metalloprotease ADAM17. The aim of this study was to explore the role of ADAM17 in the release of the two SASP components and ADAM17 substrates TNFR1 and Amphiregulin during cellular senescence.

Most cancer deaths are not the result of primary cancer development, but rather the result of its spread, a process called metastasis. Metastasis is a complex process where cancer cells leave the original tumor site, intravasate into the bloodstream, migrate to a distant organs and initiate invasive growth. Numerous studies have contributed to better understanding the underlying cellular and molecular processes of metastasis. It has become increasingly clear that inflammation can enhance tumor growth and tumor progression. ADAM17, as primary sheddase of transmembrane protein TNF-α, and sheddase of adhesion molecules, is required for recruitment of immune cells into the tissue and is implicated in inflammatory responses. It is also shown that the metalloprotease ADAM17 is responsible for cleavage of growth factor receptors and ligands of EGFR, which are necessary for tumor growth and proliferation. In the present study, it was investigated the importance of ADAM17 in the tumor stroma for metastatic progression and spread. To address this, we used Lewis Lung Carcinoma (LLC) cells and ADAM17 hypomorphic mice (ADAM17ex/ex mice) in a model of experimental metastasis. In an experimental metastasis model, tumor cells are injected via the tail vain. At different time points we analyzed the thickness of alveolar septa, infiltration of immune cells, cytokine and chemokine expression to determine the level of lung damage in control and hypomorphic mice. We could see that ADAM17ex/ex animals, that express low levels of ADAM17, had a much reduced tumor burden. The reduced metastatic growth was accompanied with reduced expression of inflammatory chemokines like e.g. MCP-1 and MIP-2. We observed a reduced infiltration of inflammatory cells, in particular Ly6G/Gr1+CD11b+ myeloid derived suppressor cells in ADAM17ex/ex mice. ADAM17ex/ex mice revealed significantly lower metastasis than ADAM17wt/wt mice at all followed time points. We demonstrated that ADAM17 in the host lung supports tumor growth via inflammatory and proliferatory stimuli.

Zusammenfassung: Die membranständige Protease a disintegrin and metalloprotease 17 (kurz ADAM17) spaltet zahlreiche Oberflächenproteine proteolytisch von der Zellmembran und entlässt diese in den Extrazellularraum, wo sie verschiedene Signalwege initiieren. Zu den Substraten von ADAM17 zählen Zytokine, Rezeptoren, Adhesionsmoleküle und Wachstumsfaktoren. Durch die Beteiligung dieser Substrate an physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen wird ersichtlich, dass ADAM17 eine Schlüsselrolle bei der Immunantwort, Gewebsregeneration und Krebsentstehung zukommt. Die Aktivierung von ADAM17 ist noch weitgehend unerforscht. Es wurde gezeigt, dass das inaktive Rhomboid 2 iRhom2 notwendig ist, damit ADAM17 vermittelte proteolytische Spaltung von Pro-TNF-α stattfindet. iRhom2 ist ein intrazelluläres Transmembranprotein, welches hauptsächlich von Immunzellen exprimiert wird und im ER und im Golgi-Apparat lokalisiert ist. In Makrophagen von Mäuse in denen das Gen RHBDF2 deletiert wurde, welches für iRhom2 codiert, wird ADAM17 nicht an die Zelloberfläche transportiert, sondern bleibt im ER und die Freisetzung von TNF-α wird inhibiert. Folglich ist iRhom2 für den Transport von ADAM17 in murinen Immunzellen unerlässlich, iRhom2 kommt die Funktion eines Transportrezeptors zu. Eine Steigerung der proteolytischen Aktivierung von ADAM17 konnte bislang weder in vitro noch in vivo durch Überexpression von ADAM17 erreicht werden. Daraus resultiert die Frage, ob durch eine Überexpression von iRhom2 die enzymatische Aktivität von ADAM17 gesteigert werden kann und ob eine gesteigerte katalytische Aktivität mit einer erhöhten Oberflächenexpression korreliert. Darüber hinaus soll disskutiert werden, ob die Generieung einer iRhom2 transgenen Maus ein sinnvoller Schritt zur weiteren Erforschung der Funktion von ADAM17 ist. Um diese Fragestellung zu beantworten wurden iRhom2 transgene Zellen hergestellt und die Oberflächenexpression von ADAM17 analysiert. Es konnte eine gesteigerte Oberflächenexpression von ADAM17 auf iRhom2 transgenen Zellen nachgewiesen werden. Des Weiteren wurde die Freisetzung der ADAM17-Substrate TNFR-I und TNFR-II durch iRhom2 transgene Zellen untersucht. Dabei wurde gezeigt, dass die Freisetzung von TNFR-I und TNFR-II von iRhom2 transgenen Zellinien im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollzellen zwischen 1,5-fach bis 2-fach gesteigert ist. Die ADAM17-vermittelte proteolytische Freisetzung von TNFR-I und TNFR-II wird folglich durch die Überexpression von iRhom2 erhöht. Wenn dieser Zusammenhang in vivo durch die Generierung einer iRhom2 transgenen Maus rekonstruierbar ist, verspräche dies neue Erkenntnisse über die Funktion von ADAM17 und wäre somit ein sinnvoller Schritt in der Erforschung der Protease.

Die genomischen Regionen der TIM (T Zell Immunglobulin- und Mucindomänen) Proteine stehen in Verbindung mit zahlreichen Krankheiten, einschließlich allergischen Reaktionen, Transplantationstoleranz, Autoimmun-reaktionen und Krebs (Freeman et al., 2010). Es existieren acht murine TIM-Gene (mTIM-1 - mTIM-8), sowie drei humane (hTIM1, hTIM-3, hTIM-4). Das murine TIM-2 Protein hat kein Ortholog im Menschen, weist aber eine große Sequenzhomologie mit mTIM-1 auf, welches nach erfolgter Proteolyse auch als lösliche Variante beschrieben wurde. Zahlreiche Transmembranproteine werden von der Zelloberfläche durch Proteasen abgespalten, wodurch lösliche Ektodomänen entstehen, die es ermöglichen, immunologische Prozesse einzuleiten, die Stärke der Immunantwort zu regulieren und diese auch zu beenden. TIM-2 ist, wie alle TIM Rezeptoren, ein Typ I Transmembranprotein und wird hauptsächlich auf differenzierten Th (T-Helfer)2 Zellen sowie aktivierten B Zellen exprimiert. Der Aufbau der TIM Proteine ist ähnlich strukturiert wie der, des membranständigen CX3CL1 Chemokins (Fraktalkin), von dem bereits bekannt ist, dass es durch ADAM10 und ADAM17 prozessiert wird. Darauf aufbauend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob das murine TIM-2 Protein ein Substrat von ADAM10 oder 17 ist. Für die Aktivierung von ADAM17 wurde der Phorbolester PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) als Stimulus verwendet und zur ADAM10-Induktion das Ionophor Ionomycin sowie BzATP (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)Adenosin-5'-Triphosphat). Mit Hilfe von spezifischen ADAM10/17-Inhibitoren und der ADAM10 Prodomäne konnte ADAM10, aber nicht ADAM17, als Hauptprotease für TIM-2 identifiziert werden. Weitere Experimente zum Shedding von TIM-2 in Wildtyp-, ADAM10-, 17- oder doppelt (ADAM10 und 17)-defizienten MEFs (murinen embryonalen Fibroblasten) bestätigten, dass TIM-2 durch ADAM10 gespalten wird. Interessanterweise führte eine Deletion im extrazellulären Bereich von TIM-2 nahe der Transmembrandomäne zu einer stark verminderten TIM-2-Spaltung nach BzATP- oder Ionomycin-Stimulation. Diese Ergebnisse deuten daraufhin, dass die ADAM10-Schnittstelle im TIM-2 Protein innerhalb der Region zwischen Prolin221 und Lysin230 liegt oder, dass dieser Bereich essentiell für die Substraterkennung durch ADAM10 ist. Weitere Untersuchungen mit TIM-2 Mutanten ohne die Immunglobulindomäne oder der intrazellulären Region zeigten keinen Einfluss auf das TIM-2 Shedding. Studien an L-Selektin, APP (Amyloid Precursor Protein) oder Semaphorin4D deuten an, dass das Calcium-bindende Protein Calmodulin (CaM) ein negativer Shedding-Regulator ist. Dieses konnte auch hier für das Substrat TIM-2 gezeigt werden, da die Interaktion von TIM-2 mit Calmodulin das Shedding von TIM-2 negativ beeinflusst. CaM interagiert vermutlich mit dem transmembranen-intrazellulären Bereich von TIM-2 und verhindert somit die Prozessierung durch ADAM10. Schließlich konnte die BzATP- und Ionomycin-vermittelte Spaltung von endogenem TIM-2 auf primären murinen B Zellen nach der Aktivierung mit anti-IgM und anti-CD40 monoklonalen Antikörpern nachgewiesen werden. Außerdem war H-Ferritin, der natürliche Ligand von TIM-2, nicht nur in der Lage an das membranständige TIM-2 zu binden, sondern auch an die natürlich, lösliche TIM-2 Variante. H-Ferritin vermittelt den Eisentransport im Organismus und kann die Proliferation von B Zellen steigern. Ob dementsprechend das hier erstmalig beschriebene ADAM10-abhängige Shedding von TIM-2 in der B Zellbiologie oder bei der Regulation der Eisenhomöostasis eine Rolle spielt, müsste in weiteren Studien untersucht werden. TIM (T cell immunoglobuline and mucin domain) genomic regions are linked to multiple disease states including allergy, asthma, transplant tolerance, autoimmunity and cancer (Freeman et al., 2010). There are eight TIM genes in mice (mTIM-1 - mTIM-8), and three in humans (hTIM-1, hTIM-3, hTIM-4). The murine TIM-2 protein has no ortholog in humans but is highly homologous to the murine TIM-1, which is known to be proteolytically cleaved. Many transmembrane proteins are cleaved from the cell surface by proteases, resulting in the generation of soluble ectodomains, which can regulate different immune processes. TIM-2 is a type I transmembrane glycoprotein and is expressed on late differentiated Th (T helper)2 cells or activated B cells. The structure of the TIM proteins resembles that of fractalkine, which is a membrane bound CX3CL1 chemokine and is cleaved by ADAM10 and ADAM17. Here, ectodomain-shedding of TIM-2 by ADAM10 or 17 was analyzed. The phorbol-ester PMA (Phorbol-12-myristat-13-acetat) was used for the activation of ADAM17 and the ionophor ionomycin or BzATP (2'(3')-O-(4-Benzoylbenzoyl)Adenosin-5'-Triphosphat) were used to induce ADAM10. With the help of ADAM10/17-specific inhibitors and the ADAM10 prodomain, ADAM10 but not ADAM17 was identified as major sheddase of TIM-2. Further shedding experiments with ADAM10-, ADAM17- or double (ADAM10 and 17)-deficient MEFs (murine embryonic fibroblasts) confirmed the cleavage of TIM-2 by ADAM10. Interestingly, ionomycin- or BzATP-induced shedding of TIM-2 was abrogated by deletion of 10 juxtamembrane amino acids from the stalk region but not by deletion of two further N-terminally located blocks of 10 amino acids, indicating a membrane proximal cleavage site within the region between proline221 and lysine230. TIM-2 lacking the immunoglobulin domain or the intracellular tail was cleaved after ionomycin- or BzATP-treatment, indicating that these domains were not involved in the regulation of ectodomain shedding. Studies with L-selectin, APP (Amyloid Precursor Protein) or semaphorin4D defined the basic calcium-binding protein calmodulin (CaM) as a negative shedding-regulator of these substrates. In this study, the same was shown for TIM-2, because TIM-2 cleavage by ADAM10 was enhanced after stimulation with the CaM-inhibitor W7 (N-(6-Aminohexyl)-5-chlor-1-naphthalinsulfonamid). Therefore, it is possible, that the interaction of CaM with the transmembrane-intracellular region of TIM-2 inhibits the ADAM10-mediated shedding of TIM-2. Moreover, BzATP- and Ionomycin-mediated shedding of endogenous TIM-2 was verified in primary murine B cells activated with anti-IgM and anti-CD40 monoclonal antibodies. Furthermore, it was demonstrated, that H-ferritin the natural ligand of TIM-2, interacts with recombinant soluble TIM-2 as well as with shed TIM-2 protein. H-ferritin is involed in the cellular iron-transport and can stimulate the proliferation of B cells. Therefore, further analyses will have to show if the ADAM10-dependent TIM-2 shedding is involved in B cell-biology or iron-homeostasis.

Zusammenfassung Single-domain Antikörper oder Nanobodies besitzen aufgrund ihrer geringen Größe eine Reihe herausragender Eigenschaften, die sie in die Lage versetzen, Limitationen (z.B. Kosten, Stabilität, versteckte Epitope, Gewebegängigkeit) klassischer IgG-Antikörpertherapien zu überwinden. Zur Erweiterung ihrer Einsatzmöglichkeiten werden Antikörper häufig modifiziert und z.B. an Radionuklide oder Polyethylenglykol gekoppelt. Als neuartiger Ansatz zur gezielten Modifizierung von Nanobodies haben wir die Mikrobielle Transglutaminase (MTG) untersucht. Als Modellsystem der Modifizierung wurde die Dimerisierung mittels Ribonuklease A S-tag gewählt und am Beispiel eines Nanobodies gegen humanen Tumor Nekrose Faktor (hTNF) eine Methode zur MTG-induzierten Dimerisierung etabliert. Die dimeren Nanobodies wiesen gegenüber den monomeren Nanobodies eine um den Faktor 5 gesteigerte Aktivität auf. Auf Pflanzen basierende Expressionssysteme besitzen gegenüber klassischen Verfahren zur Produktion rekombinanter Proteine Vorteile wie Kostenersparnis, Erweiterbarkeit der Anbaufläche und etablierte Anbau- und Ernteverfahren. Die zentralen Einschränkungen wie geringe Proteinakkumulation und ineffiziente Aufreinigungsverfahren können durch Anfügen eines Elastin-ähnlichen Polypepitds (elastin-like polypeptide, ELP) überwunden werden. Die Anreicherung der rekombinanten Proteine in Pflanzen wird deutlich gesteigert und gleichzeitig ermöglicht der ELP-Anhang eine simple und effiziente Reinigungsmethode – das inverse transition cycling (ITC). Sie beruht auf reversibler Aggregation in Abhängigkeit von Temperatur und Salzkonzentration. Hier zeigen wir, dass das Anfügen eines ELP-Anhangs an den verwendeten Nanobody zu einer deutlichen Steigerung der Akkumulation auf über 2% des gesamten löslichen Proteins führt. Aktivitätstests des anhand ITC gereinigten anti-hTNFNanobody- ELP Fusionsproteins wiesen eine dem aus E. coli stammenden Nanobody vergleichbare Aktivität auf. In auf dieser Dissertation aufbauenden Experimenten verhinderten die anti-hTNF-Nanobody-ELP Fusionsproteine die Sterblichkeit im LPS/D-Gal Sepsis-modell der Maus komplett. Zudem war die Halbwertszeit des anti-hTNF-Nanobody- ELP Fusionsproteins gegenüber dem ursprünglichen Nanobody um den Faktor 20 verlängert. Die Modifizierung / Dimerisierung von Nanobodies mittels Mikrobieller Transglutaminase sowie die Expression und Aufreinigung von Nanobody-ELP Fusionsproteinen aus Pflanzen stellen interessante Weiterentwicklungen in der Nanobody-Technologie dar.

Fibrillar collagen type I is the most abundant protein in human body and essential for the formation and strength of bone, skin, and tendon. The assembly of collagen fibrils is initiated by proteolytic enzymes which cleave off the propeptides of procollagen I. Hence, mutations in collagen genes and dysregulation of procollagen proteinase activity are the main causes of pathological disorders in collagen fibril formation. Here I demonstrate that the metalloproteases meprin α and meprin β are the only enzymes known so far capable of releasing the C- as well as the Npropeptides from type I procollagen both in vitro and in vivo thereby inducing the assembly of collagen fibrils. Meprin cleavage sites were found to be the same or in close proximity to those for the N-proteinase ADAMTS-2 and the C-proteinase BMP-1. Skin lysates from meprin α and meprin β knockout mice revealed smaller amounts of the mature collagen I compared to wild-type controls. As a consequence, meprin α and meprin β knockout mice exhibited significantly reduced collagen deposition in skin and an impaired arrangement of dermal collagen fibrils. This resulted in a markedly decreased tissue tensile strength. As a compensatory effect to partly offset the loss of procollagen proteinase activity in meprin knockout mice, expression of gene coding for bone morphogenetic protein-1/mammalian tolloid (BMP-1/mTLD) was significantly increased in these animals. These data demonstrate that meprin α and meprin β induce collagen fibril formation in vitro and in vivo and contribute to the integrity of connective tissue in skin. They regulate the collagen deposition in skin and might therefore be promising therapeutic targets to limit fibrosis. Fibrilläre Kollagene stellen die wichtigsten Proteine des Organismus dar. Sie sind die strukturgebenden Proteine von Haut, Knochen und Sehnen. Während der Synthese des Kollagens findet eine post-translationale Modifizierung des Prokollagens durch Proteasen statt, die die Propeptide abspalten. Durch das Fehlen der Propeptide sind Kollagenmoleküle in der Lage, sich zu langen Fibrillen aneinanderzulagern und es kommt zur Kollagenassemblierung. Im Rahmen dieser Dissertation konnte ich zeigen, dass die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β die bisher einzigen bekannten Enzyme sind, die in der Lage sind, sowohl das C- als auch das N-Propeptid vom Prokollagen I in vitro und in vivo abzuspalten. Diese enzymatische Spaltung geht mit der Fibrillenbildung einher, die im Elektronenmikroskop beobachtet werden konnte. Konsequenterweise zeigen Meprin α und Meprin β Knockout-Mäuse signifikante Defekte bei der Integrität des Bindegewebes. Durch das Fehlen der C- und N-Proteinaseaktivität in Meprin Knockout-Mäusen kann weniger reifes Kollagen gebildet werden als in wildtypischen Kontrollmäusen. Histologische Untersuchungen der Haut haben ergeben, dass die Kollagenschicht dieser Meprin Knockout-Mäuse signifikant vermindert ist und die Kollagenfasern in der Haut dieser Mäuse weniger dicht gepackt, ungeordnet und kleiner im Durchmesser sind, woraus eine stark reduzierte Reißfestigkeit der Haut resultiert. Um das Fehlen der Prokollagen-Proteinaseaktivität zu kompensieren,werden die für das bone morphogenetic protein-1/mammalian tolloid (BMP-1/mTLD) codierenden Gene in diesen Mäusen stark überexpremiert. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass sowohl Meprin α als auch Meprin β die Kollagenassemblierung in vitro und in vivo induzieren und somit an der Stabilität des Bindegewebes beteiligt sind. Sie regulieren die Kollageneinlagerung in der Haut und sind aus diesem Grund vielversprechende therapeutische Targets in der Fibrose.

The in vivo roles of meprin metalloproteases in pathophysiological conditions remain elusive. Substrates define protease roles. Therefore, to identify natural substrates for human meprin α and β we employed TAILS (terminal amine isotopic labeling of substrates), a proteomics approach that enriches for N-terminal peptides of proteins and cleavage fragments. Of the 151 new extracellular substrates we identified, it was notable that ADAM10 (a disintegrin and metalloprotease domain-containing protein 10)—the constitutive α-secretase—is activated by meprin β through cleavage of the propeptide. To validate this cleavage event, we expressed recombinant proADAM10 and after preincubation with meprin β, this resulted in significantly elevated ADAM10 activity. Cellular expression in murine primary fibroblasts confirmed activation. Other novel substrates including extracellular matrix proteins, growth factors and inhibitors were validated by western analyses and enzyme activity assays with Edman sequencing confirming the exact cleavage sites identified by TAILS. Cleavages in vivo were confirmed by comparing wild-type and meprin−/− mice. Our finding of cystatin C, elafin and fetuin-A as substrates and natural inhibitors for meprins reveal new mechanisms in the regulation of protease activity important for understanding pathophysiological processes., Cellular and Molecular Life Sciences, 70 (2), ISSN:1420-682X, ISSN:1420-9071

Das humane Tim-3 gehört zur T cell immunoglobulin and mucin-Genfamilie und wird sowohl auf Zellen des adaptiven Immunsystems als auch auf Zellen des angeborenen Immunsystems exprimiert und wurde zunächst als negativer Regulator von Immunantworten bekannt, der wichtig für das Beenden von Effektor-T-Zellen vermittelten Immunantworten ist. Tim-3 wird durch ADAM10 und ADAM17, zwei Vertretern der Disintegrin-ähnlichen Metalloproteasen prozessiert. Die proteolytische Spaltung durch ADAM10 und ADAM17 wird differentiell reguliert. Die durch ADAM17 vermittelte Spaltung von Tim-3 scheint Calcium abhängig zu sein und wird höchstwahrscheinlich durch Calmodulin reguliert. Die differentielle Regulation von Tim-3 durch ADAM10 und ADAM17 konnte auch in primären isolierten CD14+Monozyten nachgewiesen werden. Das Endotoxin LPS als Stimulus führte ebenfalls zur Proteolyse des endogenen Tim-3 durch ADAM10 und ADAM17. Dies ist ein Hinweis auf die physiologische Relevanz der beobachteten Spaltungprozesse.

BACKGROUND & AIMS: One treatment strategy for pancreatic ductal adenocarcinoma is to modify, rather than deplete, the tumor stroma. Constitutive activation of the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) is associated with progression of pancreatic and other solid tumors. We investigated whether loss of P53 function contributes to persistent activation of STAT3 and modification of the pancreatic tumor stroma in patients and mice. METHODS: Stat3, Il6st (encodes gp130), or Trp53 were disrupted, or a mutant form of P53 (P53R172H) or transgenic sgp130 were expressed, in mice that developed pancreatic tumors resulting from expression of activated KRAS (KrasG12D, KC mice). Pancreata were collected and analyzed by immunohistochemistry, in situ hybridization, quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction (qPCR), or immunoblot assays; fluorescence-activated cell sorting was performed to identify immune cells. We obtained frozen pancreatic tumor specimens from patients and measured levels of phosphorylated STAT3 and P53 by immunohistochemistry; protein levels were associated with survival using Kaplan-Meier analyses. We measured levels of STAT3, P53, ligands for gp130, interleukin 6, cytokines, sonic hedgehog signaling, STAT3 phosphorylation (activation), and accumulation of reactive oxygen species in primary pancreatic cells from mice. Mice with pancreatic tumors were given gemcitabine and a Janus kinase 2 (JAK2) inhibitor; tumor growth was monitored by 3-dimensional ultrasound. RESULTS: STAT3 was phosphorylated constitutively in pancreatic tumor cells from KC mice with loss or mutation of P53. Tumor cells of these mice accumulated reactive oxygen species and had lower activity of the phosphatase SHP2 and prolonged phosphorylation of JAK2 compared with tumors from KC mice with functional P53. These processes did not require the gp130 receptor. Genetic disruption of Stat3 in mice, or pharmacologic inhibitors of JAK2 or STAT3 activation, reduced fibrosis and the numbers of pancreatic stellate cells in the tumor stroma and altered the types of immune cells that infiltrated tumors. Mice given a combination of gemcitabine and a JAK2 inhibitor formed smaller tumors and survived longer than mice given control agents; the tumor stroma had fewer activated pancreatic stellate cells, lower levels of periostin, and alterations in collagen production and organization. Phosphorylation of STAT3 correlated with P53 mutation and features of infiltrating immune cells in human pancreatic tumors. Patients whose tumors had lower levels of phosphorylated STAT3 and functional P53 had significantly longer survival times than patients with high levels of phosphorylated STAT3 and P53 mutation. CONCLUSIONS: In pancreatic tumors of mice, loss of P53 function activates JAK2-STAT3 signaling, which promotes modification of the tumor stroma and tumor growth and resistance to gemcitabine. In human pancreatic tumors, STAT3 phosphorylation correlated with P53 mutation and patient survival time. Inhibitors of this pathway slow tumor growth and stroma formation, alter immune cell infiltration, and prolong survival of mice. Transcript profiling: ArrayExpress accession number: E-MTAB-3278. ZB 0 Z8 0 ZR 0 ZS 0

The IL-6 cytokine family is involved in inflammation, regeneration and tumor formation (23, 144). One characteristic of IL-6 signaling is the requirement of the alpha subunit IL-6R, which exists as a membrane bound as well as a soluble form. The IL-6/IL-6R complex binds to the ubiquitously expressed, signal transducing beta-receptor gp130, leading to gp130 activation and downstream signaling via the intracellular associated Janus kinases (JAKs). Despite the fact that the binding sites of the IL-6/IL-6R complex to gp130 were identified by crystal structure analysis, the molecular mechanism underlying gp130 activation is barely understood. Recently constitutive active deletion mutants of gp130 were found in patients with benign liver adenoma. Theses deletions differ in length as well as in position and cluster around the IL-6 contact site of domain D2. This contact area comprises the EF loop, stabilized by adjacent amino residues in wildtype gp130. Furthermore, the EF loop is connected to the BC loop of domain D3 via hydrophobic interactions. We hypothesized that an inactive gp130 conformation is stabilized via such interactions. Using a rational structure-based mutagenesis approach we could show, that an increased EF loop flexibility as well as interference with the hydrophobic interactions led to ligand independent activation of gp130. In addition we discovered that the D1 domain, in particular the first N-terminal residues were crucial for the ligand independent activity of the gp130 deletion mutants. Based on our results we present a model, which helps to explain the molecular basis of cytokine dependent as well as cytokine independent activation of gp130, presumably providing an insight into the molecular basis of cytokine receptor activation in general. Moreover, we were interested in the physiological consequences of a cell-autonomous, ligand independent activation of gp130 in hepatocytes. We therefore generated transgenic mice, expressing a previously published artificial, constitutive active variant of gp130 (L-gp130) in a tetracycline inducible manner. We intended to use this murine model to study in more depth the impact of hepatocellular signaling on injury induced liver regeneration and tumor promotion. Unfortunately we did not achieve an inducible expression of L-gp130 during our analysis, suggesting that the transgene was silenced after genomic integration. Therefore we are currently generating two alternative murine models to analyze the effect of a cell-autonomous hepatocellular expression of ligand independent gp130 variants. Die Familie der Interleukin-6 (IL-6) Zytokine spielt eine wichtige Rolle bei Entzündung, Regeneration und Tumorentstehung (23, 144). Die Besonderheit der IL-6 Signalgebung ist, dass IL-6 zuerst an seinen alpha-Rezeptor (IL-6R) binden muss, welcher in membrangebundener und löslicher Form existiert. Dieser Komplex bindet an den ubiquitär expremierten, signalgebenden beta-Rezeptor gp130 und aktiviert die intrazellulär gekoppelten Janus kinasen (JAKs). Obwohl die Bindungsstellen des IL-6/IL-6R Komplexes an gp130 anhand von Strukturanalysen aufgeklärt wurden, ist die molekulare Grundlage der gp130 Aktivierung nach wie vor unklar. Kürzlich wurden konstitutiv aktive Deletionsmutanten von gp130 in Patienten mit benignen Leberadenomen gefunden (130). Die Deletionen variierten in Länge und Position, befanden sich jedoch alle in einem Bereich der D2 Domäne, die als Kontaktstelle für IL-6 identifiziert wurde. Dieser Bereich beinhaltet den EF loop, dessen Konformation durch angrenzende Aminosäuren in Wildtyp gp130 stabilisiert wird. Zudem ist der EF loop über hydrophobe Wechselwirkungen mit dem BC loop der D3 Domäne verbunden. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine inaktive gp130 Konformation durch diese Wechselwirkungen stabilisiert wird. Durch rationale strukturbasierte Mutagenese konnten wir zeigen, dass eine erhöhte Flexibilität des EF loops, als auch die Unterbrechung der hydrophoben Interaktionen zu einer liganden-unabhängigen Aktivierung von gp130 führten. Zudem können wir zeigen, dass die D1 Domäne und insbesondere die ersten N terminalen Aminosäurereste eine wichtige Rolle bei der liganden-unabhängigen Aktivierung der gp130 Deletionsmutanten spielt. Aufgrund unserer Befunde können wir ein Modell aufstellen, das versucht, die molekularen Grundlagen der Zytokin-abhängigen, als auch der Zytokin-unabhängigen gp130-Aktivierung zu erklären und somit einen generellen Einblick in die Aktivierung von Zytokinrezeptoren liefert. Wir waren zudem an den physiologischen Konsequenzen einer zell-autonomen, liganden-unabhängigen hepatozytären gp130 Aktivierung interessiert. Wir generierten daher transgene Mäuse mit einer Tetrazyklin-induzierbaren Expression einer kürzlich publizierten artifiziellen, konstitutiv aktiven gp130 Variante (L-gp130). Die Auswirkungen auf die Leberregeneration nach Schädigung, sowie die Entstehung von Lebertumoren sollten anhand dieses murinen Modells ermittelt werden. Im Laufe unserer Analysen zeigte sich allerdings, dass die L-gp130 Expression nicht induzierbar war und der Promotor vermutlich im Genom nicht zugänglich vorliegt. Wir arbeiten daher gerade an zwei alternativen transgenen Mausmodellen zur zell-autonomen Expression liganden-unabhängiger gp130 Varianten.

Interleukin-6 (IL-6) übernimmt sowohl bei physiologischen als auch bei pathophysiologischen Prozessen eine Schlüsselrolle in der Koordination von Immunantworten. Ein wichtiger Schritt ist hierbei das so genannte IL-6 Trans-signaling, bei dem IL-6 an den löslichen IL-6 Rezeptor (sIL-6R) bindet. Der entstandene Komplex ist in der Lage, praktisch alle Zellen durch Bindung an den membranständigen signaltransduzierenden Rezeptor 130 (gp130) zu aktivieren. IL-6 alleine kann dies nur bei Zellen, die den membrangebundenen IL-6R tragen. Löslicher IL-6R entsteht im Menschen hauptsächlich durch limitierte Proteolyse des membranständigen Rezeptors (Shedding), aber auch durch alternatives Splicen der IL-6R mRNA. Es ist bekannt, dass der humane IL-6R von ADAM17, einem Mitglied der A Disintegrin And Metalloprotease Proteinfamilie, und zu einem geringeren Teil von ADAM10 prozessiert wird. Man nimmt an, dass ADAM10 hierbei für das langsame, konstitutive Shedding verantwortlich ist, während ADAM17 den IL-6R schnell nach (patho-)physiologischer Stimulation schneidet. Analoge Daten zum murinen IL-6R gibt es bislang nicht. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass der IL-6R in der Maus nur in geringem Maße durch ADAM17 proteolytisch gespalten wird. Hypomorphe ADAM17ex/ex-Mäuse, die eine um rund 95 % reduzierte ADAM17 Expression in allen Geweben aufweisen, zeigten keine Reduktion des Serumspiegels an löslichem murinem IL-6R (smIL-6R) verglichen mit Wildtyp-Mäusen. Stimulation mit dem Phorbolester PMA war zum großen Teil nicht in der Lage, ADAM17-mediiertes Shedding des mIL-6R auszulösen, was unterstreicht, dass murines ADAM17 (mADAM17) nicht die Hauptprotease des mIL-6R ist. Shedding des mIL-6R durch ADAM17 konnte hingegen erzielt werden, wenn Teile des extrazellulären Bereiches durch ihr humanes Gegenstück ausgetauscht wurden. Die Transmembran- und die intrazelluläre Domäne hatten hierauf keinen Einfluss. Dieses deutet auf eine wichtige Rolle des extrazellulären Bereichs des IL-6R in Bezug auf die Erkennung des Substrats IL-6R durch seine Protease hin. Kürzlich wurde Apoptose als natürlicher Stimulus entdeckt, der ADAM17-mediiertes Shedding des hIL-6R verursacht und damit zur Auflösung einer akuten Entzündung beiträgt. Obwohl Apoptose ebenso das Shedding des IL-6R in der Maus auslöst, wurde die verantwortliche Protease im Rahmen dieser Arbeit als murines ADAM10 (mA- DAM10) identifiziert. ADAM10 war ebenso verantwortlich für das durch Ionomycin ausgelöste Shedding von humanem und murinem IL-6R. In murinen embryonalen Fibroblasten, die defizient für ADAM10 sind, wurde die Proteolyse des humanen IL-6R von ADAM17 kompensiert, wo hingegen muriner IL-6R von einer bisher noch nicht identifizierten weiteren Protease geschnitten wurde. In weiteren Experimenten konnte die physiologische Stimulation des purinergen P2X7-Rezeptors als neuer Stimulus der IL-6R Proteolyse identifiziert werden, die ausschließlich durch humanes und murines ADAM10 vermittelt wurde. Dieser neue Signalweg trug zum physiologischen Serumlevel an smIL-6R in der Maus bei, was durch signifikant reduzierte Werte an smIL-6R im Blut P2X7-R defizienter Mäuse gezeigt werden konnte. Schließlich wurde das stress- auslösende Antibiotikum Anisomycin als weiterer Stimulus der Proteolyse des hIL-6R durch ADAM17 mittels Aktivierung der p38 MAPK identifiziert. Für diesen Prozess war die intrazelluläre Domäne (ICD) des IL-6R erforderlich. Es stellt somit den ersten beschriebenen Prozess dar, in dem die ICD des IL-6R für das Shedding erforderlich ist. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit eine unerwartete Speziesspezifität von ADAM10 und ADAM17 beim Shedding des IL-6R und identifiziert ADAM10 als neue induzierbare Protease des IL-6R in Mensch und Maus. Dies kann Konsequenzen für die Interpretation von Phenotypen von ADAM17 und ADAM10 defizienten Mäusen, insbesondere bei Krankheitsmodellen, haben. Interleukin-6 (IL-6) is an important mediator of immune responses both during physiologic and pathophysiologic processes. A key event is the so-called IL-6 trans-signaling, in which the soluble Interleukin-6 receptor (sIL-6R) binds to IL-6. This complex is able to activate virtually all cells through binding to the membrane-bound glycoprotein 130 (gp130), whereas IL-6 alone is only able to activate cells expressing the membrane-bound IL-6R. In humans, the sIL-6R is predominantly generated by proteolytic cleavage of the membrane-anchored form (shedding) and to a minor extent by alternative splicing. It is known from previous studies that shedding of the human IL-6R is mediated by A Disintegrin And Metalloprotease 17 (ADAM17) and to a minor extent by ADAM10. It is believed that hereby ADAM10 is responsible for the slow, constitutive shedding, whereas ADAM17 is activated through (patho-)physiological stimuli. Comparable data for murine IL-6R are missing. In this study, it was shown that ADAM17 is not the main sheddase of murine IL-6R in mice. In hypomorphic ADAM17ex/ex mice, which have about 95 % reduced ADAM17, serum levels of soluble murine IL-6R (smIL-6R) were not reduced compared to wildtype mice. Phorbol ester stimulation was largely ineffective to induce ADAM17-mediated shedding of mIL-6R, indicating that murine ADAM17 (mADAM17) was not the major sheddase of murine IL-6R. Shedding of mIL-6R by mADAM17 was rescued in chimeric mIL-6R proteins containing any extracellular domain of human IL-6R but not the transmembrane or the intracellular domain. This points to a role of the extracellular domains of IL-6R in substrate/protease recognition. Recently, apoptosis was identified as a physiological stimulus of ADAM17-mediated shedding of hIL-6R and IL-6 trans-signaling for the resolution of acute inflammation. Even though apoptosis induced mIL-6R shedding in mice, the responsible protease was identified as murine ADAM10 (mADAM10). ADAM10 was also identified as the protease responsible for Ionomycin-induced shedding of human and murine IL-6R. However, in ADAM10 deficient murine embryonic fibroblasts compensatory shedding of hIL-6R was mediated by ADAM17 but loss of ADAM10-mediated shedding of mIL-6R was compensated by a yet unidentified protease. Moreover, physiological stimulation of the purinergic P2X7 receptor was discovered as a novel inducer of IL-6R shedding solely mediated by murine and human ADAM10. This pathway contributed to the physiologic serum level of sIL-6R in mice as shown by significant reduction of smIL-6R in the blood of P2X7-R deficient mice. Finally, the stress-inducing antibiotic anisomycin was shown to induce shedding of hIL-6R via ADAM17 depending on the activation of p38 MAPK, a process, in which the intracellular domain (ICD) of the IL-6R was needed. This showed for the first time the requirement of the ICD of the human IL-6R for a shedding event. In conclusion, this work showed an unexpected species specificity of ADAM10 and ADAM17 and identified ADAM10 as novel inducible sheddase of IL-6R in mice and men, which might have consequences for the interpretation of phenotypes from ADAM17 and ADAM10 deficient mice, especially for animal models of human diseases.

Die vorliegende Arbeit sollte einen Beitrag zum besseren Verständnis der komplexen Interaktionen zwischen Zytokinen und Rezeptoren Interleukin-6-artiger Zytokine leisten. Ausgangspunkt für die experimentellen Arbeiten waren die zuvor beschriebenen Designerzytokine IC5 und IC7. Bei diesen war die Glykoprotein 130 (gp130)-bindende Site-III von Interleukin-6 ganz bzw. teilweise durch das entsprechende Leukemia Inhibitory Factor-Rezeptor (LIFR)-Bindungsepitop von Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF) ersetzt worden. Hierdurch waren neue Zytokine entstanden, die ihre Bioaktivität nun nicht mehr über ein Homodimer aus gp130, sondern über ein Heterodimer aus gp130 und LIFR entfalten. Eine mögliche Aktivierung des Oncostatin M-Rezeptors (OSMR) durch IC7, das heißt ein Verlust der Spezifität für den LIFR, war bislang nicht untersucht worden. Das überraschende Ergebnis dieser Arbeit ist, dass das LIFR-Bindungsepitop von CNTF nach Übertragung auf ein IL-6-Gerüst in dem Designerzytokin IC7 in der Lage ist, eine Aktivierung des OSMR auf humanen HepG2-Zellen zu induzieren. Experimente mit BaF/3-[gp130, IL-6R, OSMR]-Zellen, einer neu generierten Zelllinie, die neben gp130 und IL-6R zusätzlich den OSM-Rezeptor exprimiert, bestätigten den initialen Befund. Zusätzlich fand sich, dass die in einer früheren Arbeit auf BaF/3-[gp130, IL-6R, LIFR]-Zellen beschriebene ca. 100-fach stärkere Aktivität von IC7 gegenüber IC5 auf BaF/3-[gp130, IL-6R, OSMR]-Zellen verschwindet. Der Verlauf der Aktivitätskurven spricht für einen relativen Aktivitätsverlust von IC7 auf BaF/3-[gp130, IL-6R, OSMR]-Zellen. Allerdings erreichen beide Zytokinchimären in höherer Dosierung die gleiche Aktivität und sogar eine überschießende „Supramaximalaktivität“. Anhand der gelösten 3-D-Struktur des IL-6/IL-6R-Komplexes wurde folgende Hypothese für das veränderte Verhalten der Site-III aufgestellt: Durch eine Interaktion zwischen der Domäne D2 des Interleukin-6-Rezeptors (IL-6R) und einem Teil der zur Site-I gehörenden AB-Schleife von IL-6 kommt es zu einer Stabilisierung derselben. Dies ermöglicht die Interaktion zwischen Site-III, die ebenfalls zum Teil aus der AB-Schleife besteht, und der Ig-Domäne des β-Rezeptors. Dies ist möglicherweise Voraussetzung für eine Bindung zwischen der Domäne-2 des α-Rezeptors und der Ig-artigen Domäne des β-Rezeptors. Insgesamt könnte eine Interaktion der Domäne-2 des α-Rezeptors mit der Ig-artigen Domäne des β-Rezeptors bei allen Interleukin-6-artigen Zytokinen, die einen α-Rezeptor zur Signaltransduktion benötigen, Einfluß auf die Spezifität der Site-III haben. Zum Abschluß dieser Arbeit wurden die experimentellen Grundlagen zur Überprüfung dieser Hypothese durch die Konstruktion des Designerzytokins IC15 sowie die Rezeptorchimären CIR2 und CIR2ΔIg gelegt. IC15 besitzt im Unterschied zu IC7 die komplette AB-Schleife von CNTF. In den Rezeptorchimären sind die Domänen D1 und D2 des IL-6R durch die Domänen D1 bzw. D1 und D2 des CNTFR ersetzt. Auf Zellen, die gp130 und LIFR sowie eine der Rezeptorchimären exprimieren, sollte IC15 so aktiv sein wie LIF. Auf Zellen mit gleicher Ausstattung, aber mit dem OSMR anstelle des LIFR, sollte IC15 dagegen keine Aktivität besitzen. IC15 wurde in E. coli exprimiert, gereinigt und durch Circular Dichroism die strukturelle Integrität nachgewiesen. Für die Rezeptorchimären CIR2 und CIR2ΔIg wurden, als Basis für weiterführende Experimente, optimale Expressionsbedingungen ermittelt und gezeigt, dass sich diese auch in Kombination mit den signaltransduzierenden Untereinheiten gp130 und LIFR in Zellen exprimieren lassen. Die hier gewonnenen Erkenntnisse tragen zu einem besseren Verständis der Rezeptor-Liganden-Interaktion bei und sollen somit langfristig zur Entwicklung spezifischer Agonisten bzw. Antagonisten Interleukin-6-artiger Zytokine beitragen. Angesichts der Vielzahl menschlicher Erkrankungen, bei denen Interleukin-6-artige Zytokine eine entscheidende Rolle spielen, hätte eine Modulation der Zytokinwirkungen ein erhebliches therapeutisches Potenzial.

Inflammatory bowel disease is a chronic inflammatory disorder of the gastrointestinal tract. In this work the influence of the metalloprotease ADAM17 as well as of IL-6 signaling was analyzed using a DSS-induced colitis model. Entzündliche Darmerkrankungen gehören zu den chronischen Entzündungen des Gastrointestinaltraktes. In dieser Arbeit wurde der Einfluss der Metalloprotease ADAM17 sowie die IL-6 Signalwege mit Hilfe eines DSS- induzierten Colitismodels näher untersucht.