Rico Díaz, Agustín, Becerra, Manuel, Cerdán, María Esperanza, Universidade da Coruña. Departamento de Bioloxía Celular e Molecular, Becerra Fernández, Manuel, and Cerdán Villanueva, Esperanza
Programa Oficial de Doutoramento en Bioloxía Celular e Molecular . 5004V01, [Abstract] β-galactosidases are enzymes required in a large number of applications by food industry. In this thesis we engineered the β-galactosidases from Aspergillus niger and Kluyveromyces lactis in order to obtain more suitable forms for industrial uses. Aspergillus niger β-galactosidase was expressed in yeast, purified by affinity chromatography and crystallized to perform Xray diffraction experiments. The three-dimensional structures of the enzyme in its native form and in complexes with five oligosaccharides were solved. The results gave insights into specificity determinants of GH35 β- galactosidases catalysis and this knowledge allowed engineering of the enzyme to achieve new variants with increased transgalactosylation activity. Moreover, thermostable mutants of β-galactosidase from Kluyveromyces lactis were obtained by performing a rational design strategy. The introduction of new disulfide bonds among subunit interfaces also produced a noticeable rise in the catalytic efficiency of the mutants. This effect was attributable to quaternary structure stabilization, which increases the proportion of the highest active oligomeric forms in the equilibrium. Finally, immobilization studies using two different supports showed that in the mutant the loss of catalytic activity after immobilization, even after several reutilization cycles, was lower than in the native protein. Therefore, this mutant variant performed better than the native form during immobilization, which represents a new advantage for industrial applications., [Resumen] Las β-galactosidasas son enzimas utilizadas en numerosas aplicaciones de la industria alimentaria. En esta tesis se modifican las β-galactosidasas de Aspergillus niger y de Kluyveromyces lactis para obtener variantes adecuadas para su uso industrial. La β-galactosidasa de Aspergillus niger se expresó, purificó y cristalizó para llevar a cabo experimentos de difracción con rayos X. Se resolvieron las estructuras tridimensionales de la enzima en sus formas nativa y acomplejada con cinco oligosacáridos. Los resultados ayudan a entender las claves que determinan la especificidad en la catálisis de las β-galactosidasas de la familia GH35 y permiten la modificación de la enzima para obtener nuevas variantes con mayor actividad de transgalactosilación. Además, se obtuvieron mutantes de β- galactosidasa de Kluyveromyces lactis mediante una estrategia de diseño racional. La introducción de nuevos puentes disulfuro en la zona de interacción de las subunidades también produjo una importante subida en la eficiencia catalítica de los mutantes. Finalmente, los estudios de inmovilización con dos soportes diferentes mostraron que en el mutante la pérdida de actividad catalítica después de la inmovilización fue inferior que en la proteína nativa. Por lo tanto, esta variante mutante se comportó mejor que la forma nativa durante la inmovilización, lo que implica una nueva ventaja para su uso en aplicaciones industriales., [Resumo] As β-galactosidasas son enzimas utilizadas en numerosas aplicacións da industria alimentaria. Nesta tese modifícanse as β-galactosidasas de Aspergillus niger e de Kluyveromyces lactis para obter variantes axeitadas para o seu uso industrial. A β-galactosidasa de Aspergillus niger expresouse, purificose e cristalizouse para levar a cabo experimentos de difración con raios X. Resolvéronse as estruturas tridimensionais da enzima nas súas formas nativa e acomplexada con cinco oligosacáridos. Os resultados axudan a entender as claves que determinan a especificidade na catálisis das β-galactosidasas da familia GH35 e permiten a modificación da enzima para obter novas variantes con maior actividade de transgalactosilación. Ademais, obtivéronse mutantes de β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis mediante unha estratexia de deseño racional. A introdución de novas pontes disulfuro na zona de interacción das subunidades tamén produciu unha importante subida na eficiencia catalítica dos mutantes. Finalmente, os estudos de inmovilización con dous soportes diferentes mostraron que no mutante a perda de actividade catalítica despois da inmovilización foi inferior que na proteína nativa. Polo tanto, esta variante mutante comportouse mellor que a forma nativa durante a inmovilización, o que supón unha nova vantaxe para o seu uso en aplicacións industriais.