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The molecular pathways of DNA repair in tumors may play a role in tailoring patient therapy. The Fanconi anemia DNA repair pathway operates in the repair of DNA interstrand crosslink induced by several chemotherapeutic drugs. In this study we evaluated the expression of Fanconi anemia DNA repair genes (FANCA, C, D2, F, BRCA1 and PALB2) in 46 primary breast tumors and ten non-compromised breast samples, by Real-Time Quantitative Reverse Transcription PCR, and to correlated gene expression with breast cancer subtypes and clinico-pathological parameters. Tumor samples were classified in subtypes based on immunohistochemistry markers, and clinico-pathological parameters were obtained from the medical reports. FANCD2 was twice more expressed in tumors than in the non-compromised group (p= 0.02). BRCA1 showed a differential expression in the luminal group, three times less expressed in Luminal-B than in Luminal-A group (p= 0.01). In conclusion, the higher level of expression of FANCD2 in tumors may indicate activation of the Fanconi anemia DNA repair pathway, which has been implicated in breast carcinogenesis and in chemotherapeutic resistance. The loss of BRCA1 expression in the Luminal-B group may indicate that the use of cisplatin-based neo/adjuvant therapies is preferable, and that the use of taxol-based therapies should be avoided due to the risk of drug resistance.

Objetivos: Descrever os achados oftalmológicos, dermatológicos e de microscopia óptica (MO) e microscopia eletrônica de varredura (MEV) de nova distrofia macular associada à síndrome dos cabelos anágenos frouxos (SCAF). Métodos: Uma família de sete pacientes, quatro deles afetados, foi examinada. Os pacientes foram submetidos ao exame oftalmológico completo, teste de cores (Ishihara e Farnsworth D-15), ecografia, angiografia, exames laboratoriais e dermatológico, teste do suor, microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura dos fios de cabelo. Resultados: Em duas irmãs afetadas encontramos no fundo de olho dispersões pigmentares em pólo posterior da retina, com estafiloma da mácula. Em dois irmãos foram encontradas as mesmas dispersões pigmentares em pólo posterior, com maior pigmentação e coloração amarelada em área macular e sem estafiloma. A avaliação na microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura dos indivíduos afetados confirmou a SCAF. Em uma mulher e em um homem não afetados todos os exames foram normais, exceto que na MO e MEV encontramos algumas semelhanças com os indivíduos afetados. Quanto ao modo de herança, o heredograma é compatível com herança autossômica recessiva com expressão parcial no heterozigoto. Conclusões: Há somente um relato na literatura internacional da associação de SCAF e coloboma ocular. Neste trabalho descrevemos os achados de nova distrofia macular associada à síndrome dos cabelos anágenos frouxos, distrofia cujos achados fundoscópicos são diferentes entre homens e mulheres. Por se tratar do primeiro relato na literatura, os achados descritos sugerem fortemente que esta associação pode ser parte de uma nova entidade nosológica. Purpose: To describe the ophthalmological, dermatological, light microscopy (LM) and scanning electron microscopy (SEM) findings of a new macular dystrophy associated with the loose anagen hair syndrome (LAHS). Methods: A family of seven patients, four of them affected, was examined. The patients underwent a complete ophthalmological examination, color test (Ishihara and Farnsworth D-15), ecography, angiography, laboratory and dermatological tests, sweat test, light microscopy and scanning electron microscopy of the hair. Results: In two affected sisters we found on eye fundoscopy pigmentary dispersions in the posterior pole of the retina, with macular staphyloma. In two brothers, the same pigmentary dispersions in the posterior pole was found, with more pigmentation and a yellow coloring in the macular area and without staphyloma. The light microscopy and scanning electron microscopy evaluation of the affected individuals confirmed loose anagen hair syndrome. In a not affected woman and man all examinations were normal, except the light microscopy and scanning electron microscopy that showed some similarities with the affected individuals. As for the way of inheritance, the pedigree is compatible with autosomal recessive inheritance with partial expression of the heterozygote. Conclusions: There is only one report in the international literature of loose anagen hair syndrome association with ocular coloboma. In this study we describe the findings of a new macular dystrophy associated with the loose anagen hair syndrome, a dystrophy whose fundoscopy findings are different between men and women. Since it is the first report in the literature, the described findings strongly suggest that this association can be part of a new nosological entity.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadoras: Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro e Drª. Talita Helen Bombardelli Gomig Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 18/03/2022 Inclui referências Resumo: O câncer de mama é uma doença com altos índices de incidência, mortalidade e impactos sociais e econômicos. Os tumores mamários são classificados em subtipos, visando direcionar o tratamento e predizer o prognóstico dos pacientes, porém, a classificação atual, baseada em quatro marcadores imunoistoquímicos, não é suficiente para uma classificação satisfatória destes tumores. Além disso, as características biológicas que geram as diferenças entre tumores não são completamente conhecidas. Neste sentido, as tecnologias proteômicas e interatômicas têm grande relevância, tanto na investigação das diferenças biológicas entre subtipos através da identificação de proteínas diferencialmente expressas, as quais influenciam vias e processos relacionados com as diferenças clínicas e biológicas dos subtipos, quanto na identificação de marcadores proteicos que possam complementar e otimizar a classificação e discriminação entre subtipos. Neste estudo, mais especificamente no capítulo 1, métodos proteômicos baseados em espectrometria de massas LC-MS/MS livre de marcação foram utilizados para obtenção e comparação do proteoma total de tumores mamários de diferentes subtipos (luminal A, Luminal B, HER2+ enriquecido e triplo negativo) e, através da aplicação de análises computacionais de enriquecimento funcional e de predição de interatoma, a relevância biológica de proteínas diferencialmente expressas foi evidenciada. Além disso, a tecnologia de machine learning baseada em supported vector machines foi aplicada para a obtenção de painéis proteicos com potencial para servirem como painéis de discriminação e de classificação de tumores mamários em subtipos. Proteínas diferencialmente expressas (DEPs) puderam ser identificadas entre todos os subtipos, identificando oncogenes e supressores de tumor que possuem padrões de expressão que variam segundo a subdivisão entre subtipos. Através das análises de enriquecimento, os contextos biológicos nos quais se incluem estas DEPs puderam ser explorados, sendo identificados processos e vias biológicas que possuem níveis de atuação e ativação/inativação que diferem segundo o subtipo do tumor, incluindo alterações, por exemplo, nas vias de endocitose mediada por clatrinas, metabolismo de glucose e carboidratos, citoproteção por HMOX1 e regulação da estabilidade e atividade de PTEN. Os painéis proteicos aqui propostos obtiveram bom desempenho, alcançando taxas de falso-positivos sempre menores que 10%, e sensibilidade e especificidade sempre maiores que 75%. O capítulo 2 desta dissertação, por sua vez, traz análises sobre as proteínas ribossomais (RPs) no contexto do câncer de mama, trazendo novas informações acerca do padrão de expressão proteômico e transcriptômico das RPs, bem como de seu potencial para predição de prognóstico e do o panorama funcional e mutacional das RPs no câncer de mama. Abstract: Breast cancer is a disease with high rates of incidence, mortality, and social and economic impacts. The mammary tumors can be classified into subtypes, aiming to manage patient treatment and predict patient prognostics, however, the actual classification method, based in four immunohistochemical markers, is not sufficient to a satisfactory classification of the tumors. Furthermore, the biological characteristics involved in the differences between subtypes are not fully known. In this context, proteomic and interatomic technologies have great relevance both in the investigation of the biological differences between subtypes through the identification of differentially expressed proteins, which influence biological pathways and processes related to clinical and biological differences among the subtypes, and in the identification of proteic biomarkers that can be used to complement and optimize the classification and discrimination between subtypes. In this study, more specifically in chapter 1, label free mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS) based proteomics was applied to obtain and compare total proteomes of breast tumors of different subtypes and, through application of computational enrichment analysis and interatomic predictions, the biological relevance of the differentially expressed proteins (DEPs) was investigated. Further, machine learning-based technologies were applied to obtain proteic panels with the potential to discriminate and classify breast tumors in subtypes. We found DEPs in thecomparisons of all subtypes, identifying oncogenes and tumor suppressor genes with expression patterns that vary accordingly with the subtype classification. Through the enrichment analysis, the biological context in with the DEPs take part was explored, being that processes and pathways that shows differential behavior among the subtypes were found, including, for example, clathrinmediated endocytosis, glucose and carbohydrates metabolism, HMOX1 mediated cytoprotection and PTEN stability and activity regulation. The proteic panels proposed achieved great performances, both in the cross-validation and in the independent cohort validation, reaching rates of false-positives under 10%, and sensibility and specificity over 75%. The chapter 2, in turn, describes the analysis about the ribosomal proteins (RPs) in breast cancer, contributing with new data about the RPs proteomic and transcriptomic expression pattern, as well about its potential as prognostic markers and mutational and functional landscape in breast cancer.

Orientadora: Profa. Dra. Jaqueline Carvalho de Oliveira Coorientadora: Profª. Drª. Enilze M. S. F. Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/01/2020 Inclui referências: p. 180-195 Resumo: No mundo todo, o câncer de mama é a neoplasia mais frequente entre as mulheres e compreende um grupo heterogêneo de doenças, resultando em prognósticos e respostas clínicas distintas. Atualmente existem vários sistemas de classificação, sendo um dos mais usados o baseado em imunoistoquímica. Nessa classificação os tumores de mama são divididos em quatro grupos principais: luminal A, luminal B, HER2+ e triplo negativo. Apesar da classificação, ainda há uma heterogeneidade dentre os pacientes de cada grupo, fazendo com que o curso da doença e a resposta ao tratamento se diversifique. No genoma humano, foram identificadas 481 regiões ultraconservadas (UCRs) que apresentam 100% de identidade entre humanos, camundongos e ratos, e também com alta taxa de conservação em outras espécies. Tais regiões possuem de 200-781 pares de bases. Essas regiões podem ser transcritas (TUCRs: transcribed ultraconserved regions), e alterações em seus perfis de expressão têm sido associados a doenças, incluindo alguns tipos de tumores, porém, pouco se sabe da influência dessas regiões no câncer de mama. Além disso, apenas 4% dos transcritos foram totalmente descritos. Na busca por entender melhor o papel desses transcritos no desenvolvimento do câncer de mama, o nível de expressão das 481 T-UCRs foi analisado através de dados depositados no banco TCGA (The Cancer Genome Atlas). Através dessa análise foi verificado que a expressão diferencial de 302 (~63%) das T-UCRs estão associadas com algum parâmetro envolvido no desenvolvimento do câncer de mama como: subtipo molecular (43,45%), receptor de estrógeno (35,76%), receptor de progesterona (32,85%), amplificação de HER2 (16,63%), estadiamento (12,47%), terapia (36,59%) e sobrevida (9,56%). Dessas regiões analisadas fizemos um filtro em busca de regiões que estavam expressas em mais de 80% da amostra, localizadas em regiões intronicas e intergênicas, e qua apresentavam diferença de expressão enre subtipos para a confirmação da diferença de expressão em pacientes brasileiras (n=102) por RT-qPCR, e obtivemos a confirmação da diferença de expressão entre subtipos das regiões uc.147 e uc.193. O transcrito uc.147 está em uma região intrônica do gene LRBA, sendo transcrita no sentido contrário desse gene, e com expressão restrita ao núcleo. Já o transcrito uc.193 está na região 3'UTR do gene SYNCRIP, transcrita no sentido oposto desse gene, e com localização predominante citoplasmática. Adicionalmente, o aumento de expressão da uc.147 foi associada com uma pior sobrevida entre os pacientes luminal A. Com as técnicas de northern blotting e rapid amplification of cDNA ends (RACE), identificamos e descrevemos um transcrito de ~2800nt para a uc.147. O silenciamento da uc.147 nas linhagens celulares do subtipo luminal CAMA-1 e BT474, diminuiu a viabilidade celular. Além disso, na linhagem luminal A CAMA- 1, esse silenciamento também provocou uma diminuição na formação de colônias, aumentou a apoptose e provocou uma parada na fase G1 do ciclo celular. Essas alterações não foram vistas quando o gene LRBA foi silenciado, sugerindo um importante papel do uc.147 em câncer de mama. Adicionalmente, através do ensaio de pull-down nós observamos que existem muitas proteínas que interagem fisicamente com o transcrito e estão envolvidas no processo de tumorigênese. Esse trabalho é o primeiro a fazer uma análise global das T-UCRs em câncer de mama, e o primeiro a caracterizar e sugerir uma importante função 9 ao uc.147, além de apresentar um potencial como biomarcador de prognóstico no câncer de mama. Palavras-chave: Câncer de mama. T-UCRs. Biomarcadores. Tumorigênese. Abstract: Breast Cancer (BC) is the most commonly diagnosed cancer and the leading cause of cancer death among women. BC is a heterogeneous disease with a rage of clinical and molecular characteristics. There are many classification systems for BC. Based on immuno-histochemical analysis, BC is subdivided in four main groups: luminal A, luminal B, HER2 and triple negative. Although, the number of BC classification system and the stratification of patients improved the therapy, inside of each subtype, patients can still have different outcomes. So, the identification of new biomarkers is important to a better prognosis, and development of more specific therapy. There are 481 ultra-conserved regions (UCRs) described in the genome, being longer than 200bp and 100% conserved among human, rat, and mouse. Most UCRs are transcribed (T-UCR) and some are differentially expressed in tumors. In addition, T-UCRs have already been described participating of the tumorigenesis process. However, the influence that T-UCRs impose on BC remains unclear. Furthermore, only 4% of T-UCRs present information on molecular details. Through analysis of all T-UCRs in the TCGA (The Cancer Genome Atlas) BC data, we found 302 regions associated with important clinical features in BC: 43% associated with molecular subtype, 36% of estrogen-receptor-positive, 17% with ERBB2 expression, 12% with clinical staging and 10% with overall survival. Looking for regions that were expressed in more than 80% of the samples, located in noncoding region and with a greater difference among subtypes we chose 12 T-UCRs to confirm differential expression in Brazilian patients (n=102) by RT-qPCR. We confirmed the differential expression among subtypes in uc.147 and uc.193. Furthermore, the strand specific RT-qPCR indicated that uc.147 and uc.193 are transcribed in the opposite direction from their host genes, LRBA and SYNCRIP, respectively. RT-qPCR. Through subcellular fractionation we demonstrated that uc.147 is located in the nucleus and uc.193 is most cytosolic. Additionally, high expression of uc.147 is associated with poor survival in luminal A patients. Northern blotting results indicated that the uc.147 transcript is around 2800nt and its sequence was confirmed by rapid amplification of cDNA ends (RACE). In addition, the silencing of uc.147 in luminal cell lines CAMA-1 and BT474 reduces cell viability, and in luminal A CAMA-1 cells the silencing reduces colony formation, increases apoptosis, and arrests cells in G1 phase of cell cycle. The same effects are not observe knocking down the LRBA. Besides, using pull-down assay we discover that many proteins associated with tumorigenesis process are binding to uc.147. This study is the first screening of all T-UCRs in BC, the first to characterize uc.147, and demonstrate its potential as prognostic marker in BC. Keywords: Breast Cancer. T-UCRs. Tumorigenesis. Biomarker.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadoras: Prof.a Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro e Dra. Talita Helen Bombardelli Gomig Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 11/03/2020 Inclui referências: p. 79-92 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres no mundo e no Brasil é o segundo mais frequente (superado pelo de pele não melanoma). A heterogeneidade tumoral dessa neoplasia é uma das dificuldades que interferem na terapêutica precisa e consequentemente no prognóstico da doença. A imunoistoquímica classifica os tumores em subgrupos orientando a utilização do melhor tratamento. A utilização de biomarcadores é fundamental para uma classificação mais apropriada desta doença, considerando inclusive a facilidade de obtenção de amostras em fluidos, como sangue e biópsia, para a identificação de potenciais marcadores evidenciando a importância de estudos nessas amostras biológicas. Métodos proteômicos podem auxiliar na identificação de proteínas com alterações no perfil de expressão entre amostras biológicas distintas. Neste contexto, o presente estudo tem por objetivo obter o proteoma de tecidos mamários não tumorais: do tumor primário de mama (T) de pacientes diagnosticados com diferentes subtipos moleculares de câncer de mama (Triplo Negativo e Luminal B) para avaliar diferenças significativas na expressão proteica, de relevância na discriminação destes subtipos da doença. As amostras de tecidos mamários não tumorais, do tumor primário de mama e do linfonodo axilar metastático foram previamente processadas e preparadas para a espectrometria de massas e, em seguida, foram efetuadas a análise comparativa, a validação das proteínas e a anotação funcional. As comparações foram entre proteínas presentes entre subtipos (Triplo Negativo e Luminal B), a análise das proteínas diferencialmente expressas foi obtida através de testes estatísticos não paramétricos in-silico e a validação por técnicas moleculares. A anotação funcional das proteínas diferencialmente expressas e a predição de suas interações permitiu a seleção de alvos de interesse para o estudo do câncer de mama. Proteínas que apresentaram relevância funcional na tumorigênese e que constituam potenciais marcadores para a discriminação entre os subtipos foram avaliadas na literatura e em bancos de dados de interação proteica, sendo elas a Culina 3, B-catenina1 e Fibronectina 1. A validação da expressão proteica foi realizada através do método Western Blotting, demonstrando a expressão diferencial dessas proteínas entre subtipos distintos do câncer mama, a qual pode ter importância na progressão da doença, principalmente no que se refere a migração celular e invasão. Estudos adicionais envolvendo suas interações com outras proteínas poderão ampliar a compreensão das funções desempenhadas por essas proteínas no contexto do câncer de mama triplo negativo, evidenciando seu potencial como marcadores moleculares da doença. Abstract: Breast cancer is the most common type of cancer among women in the world and in Brazil is the second most frequent (surpassed by non-melanoma skin). The tumor heterogeneity of this neoplasm is one of the difficulties that interfere in the therapy accurately and consequently in the prognosis of the disease. Immunohistochemistry classifies tumors into subgroups guiding the use of the best treatment. The use of biomarkers is fundamental for a more appropriate classification of this disease, including considering the ease of obtaining samples in fluids, such as blood and biopsy, for the identification of potential markers evidencing the importance of studies in these biological samples. Proteomic methods can help identify proteins with changes in the expression profile between distinct biological samples. In this context, the present study aims to obtain the proteoma of non-tumor breast tissues: the primary breast tumor (T) of diagnosed patients with different molecular subtypes of breast cancer (Triple Negative and Luminal B) to evaluate significant differences in protein expression, of relevance in the discrimination of these subtypes of the disease. Samples of non-tumor breast tissues, primary breast tumor and metastatic axillary lymph node were previously processed and prepared for mass spectrometry and then comparative analysis, protein validation and functional annotation. The analysis of differentially expressed proteins was obtained through in-silic nonparametric statistical tests, and validation by molecular techniques, comparisons were between proteins present between subtypes (Triple Negative and Luminal B). Functional annotation of differentially expressed proteins and the prediction of their interactions allowed the selection of targets of interest for the study of breast cancer. Proteins that presented functional relevance in tumorigenesis and that constitute potential markers for discrimination between subtypes were evaluated in the literature and in protein interaction databases, which are Culina 3, B-catenine1 and Fibronectin 1. Protein expression validation was performed using the Western Blotting method, demonstrating the differential expression of these proteins among distinct subtypes of breast cancer, which may be important in the progression of the disease, especially with regard to cell migration and invasion. Additional studies involving their interactions with other proteins may broaden the understanding of the functions performed by these proteins in the context of triple negative breast cancer, evidencing its potential as molecular markers of the disease.

Orientadora: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientador: Dr. José Cláudio Casali da Rocha Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 13/03/2020 Inclui referências: p. 79-94 Resumo: A Síndrome de Lynch (SL) é uma das síndromes de predisposição hereditária ao câncer mais comuns. Ela tem herança autossômica dominante e é causada por mutação germinativa de um dos genes de reparo de malpareamento de bases, sendo os principais deles MLH1, MSH2, MSH6 e PMS2. Os indivíduos com SL apresentam um risco aumentado para o desenvolvimento de vários tipos de tumor durante a vida, sendo os principais deles o câncer colorretal (CCR) e o de endométrio. O objetivo desse trabalho é caracterizar aspectos clínicos e moleculares das famílias com suspeita ou diagnóstico de SL desde a implantação do Serviço de Oncogenética do Hospital Erasto Gaertner, além de avaliar o acesso desses pacientes aos métodos diagnósticos da SL no contexto do Sistema Único de Saúde (SUS). Para isso, foram revisados retrospectivamente os prontuários de todos os pacientes atendidos no serviço entre julho de 2012 e dezembro de 2018, buscando pacientes que atendessem os critérios de inclusão propostos nesse estudo. Foram então incluídos 32 probandos, sendo 18 mulheres (56,3%) e 14 homens (43,7%), com idade média de 41,3 anos de idade ao diagnóstico do primeiro tumor. Apenas 43,3% dessas 32 famílias incluídas preenchia critérios de Amsterdam I/II. Cada um desses probandos teve de um a cinco tumores, num total de 57 tumores. Entre os 32 tumores índice, 84,4% pertenciam ao espectro da síndrome e 75% dos casos foram diagnosticados antes dos 50 anos de idade. Apenas dez desses probandos (31,2%) tiveram a oportunidade de realizar teste genético, apesar de todos os 32 terem a indicação por terem apresentado imunoistoquímica (IHQ) do tumor anormal ou história pessoal e/ou familiar sugestiva de SL. Os casos que não tiveram acesso a teste genético tiveram seu gene causal de SL inferido pelo resultado da IHQ, de modo que todos os 32 casos foram atribuídos a algum dos genes de reparo. Dos 32 casos, 13 (40,6%) foram atribuídos ao gene MSH2, 7 (21,9%) a MLH1, 7 (21,9%) a PMS2 e 5 (15,6%) a MSH6. Essa distribuição difere do sugerido pela literatura, principalmente devido a um excesso de casos relacionados a PMS2 (p=0.004) e escassez de MLH1 (p=0.005). Entre os dez pacientes que realizaram teste genético, cinco probandos não relacionados tiveram uma mesma mutação detectada - MSH2:c.2152C>T (p.Gln718*). Essa mutação foi relacionada a um efeito fundador num estudo recente em Portugal, mas ainda não foi descrito efeito fundador no Brasil. Essa população de estudo nunca havia sido incluída em estudos prévios sobre a SL no Brasil. Os achados desse estudo evidenciaram algumas barreiras à adequada identificação de famílias portadoras de SL no cenário do SUS. São necessárias estratégias para melhorar o rastreamento da SL e diagnóstico de indivíduos acometidos, assim como a identificação, captação e testagem dos familiares em risco, para que esse diagnóstico possa se traduzir na prevenção de câncer em maior escala. Abstract: Lynch Syndrome (LS) is among the most common hereditary cancer syndromes. It is an autosomal dominant disorder caused by a germline mutation in one of the mismatch repair genes, mainly MLH1, MSH2, MSH6 and PMS2. Individuals with LS are at an increased lifetime risk for several types of tumors, but mostly colorectal and endometrial cancers. This study aims to describe clinical and molecular aspects of families suspected for or diagnosed with LS since the implementation of the Oncogenetics Department at Hospital Erasto Gaertner, and also to evaluate the access of these patients to molecular diagnostic methods within the context of the Brazilian Public Health System. For this purpose, we made a retrospective chart review of all patients seen at the Oncogenetics clinics from July 2012 to December 2018, aiming to identify patients who fulfilled inclusion Criteria for this study. Thus, 32 probands were included, comprising 18 females (56,3%) and 14 males (43,7%), with a mean age of 41,3 years at their first tumor diagnosis. Only 43,3% of these 32 families fulfilled Amsterdam Criteria I/II. Each one of the probands had one to five tumors diagnosed during their lifetime, for a total of 57 tumors. Among 32 index tumors, 84,4% were included in the tumor spectrum of the syndrome, and 75% of the cases were diagnosed at 50 years old or younger. Only ten of these probands (31,2%) had access to genetic testing, even though all of them had the indication to have it done due to abnormal immunohistochemistry (IHC) results or suspect personal and/or family history. Untested cases were assigned to a causal gene based on IHC results, so that all 32 cases were assigned to one of the mismatch repair genes. Out of 32 cases, 13 (40,6%) were assigned to MSH2, 7 (21,9%) to MLH1, 7 (21,9%) to PMS2 and 5 (15,6%) to MSH6. This distribution is inconsistent with data in the literature, mainly due to an excess of PMS2 cases (p=0.004) and a lack of MLH1 (p=0.005). Among ten patients who underwent genetic testing, five unrelated probands had the same mutation identified - MSH2:c.2152C>T (p.Gln718*). A founder effect has recently been described for this mutation in Portugal, but a founder effect has not yet been described in Brazil. The population of this study had not been included in previous studies regarding LS in Brazil. Our findings show there are some barriers to appropriate identification of LS families in the setting of the Brazilian Public Health System. Improvements are needed to a better screening and diagnosis of the syndrome, as well as for the identification and testing of relatives at risk. Such efforts are important to achieve cancer prevention and control in a larger scale.

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadora: Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 22/02/2019 Inclui referências Resumo: O câncer de mama é o mais comum em mulheres no mundo e o segundo mais incidente em mulheres no Brasil, após o câncer de pele não melanoma. Em homens, é uma malignidade pouco frequente representando cerca de 1,8% dos casos de câncer de mama em geral. Tecnologias de alta resolução aliadas à bioinformática têm sido utilizadas como estratégias de estudo para auxiliar no diagnóstico, na seleção da terapia e no prognóstico do câncer. Nesse contexto, as análises de proteoma e interatoma consistem em importantes abordagens para evidenciar os principais processos biológicos associados à tumorigênese, uma vez que níveis de expressão proteica alterados podem influenciar vias celulares críticas e redes de interações, e comprometer a homeostase do ambiente tecidual, contribuindo para o desenvolvimento do câncer. Neste estudo, a espectrometria de massa baseada na quantificação livre de marcação, seguida da anotação/enriquecimento funcional e da predição de redes de interação proteína-proteína, foi realizada para obter um panorama do proteoma diferencial e seu contexto biológico funcional no câncer de mama feminino e masculino. Os níveis de expressão proteica dos tumores primários de mama foram avaliados simultaneamente aos linfonodos axilares metastáticos e tecidos mamários não tumorais para identificar as proteínas diferencialmente expressas entre esses tecidos. Análises in sílico dos dados proteômicos foram utilizadas para identificar as vias de sinalização e metabólicas, funções e processos biológicos mais relevantes, bem como redes de interação que envolvem proteínas com alteração de expressão. Os dados referentes à análise do câncer de mama feminino demonstraram um alto nível de similaridade no perfil proteômico de ambos os tecidos mamários não tumorais (contralateral e adjacente) e entre os malignos (tumor primário de mama e linfonodo axilar metastático). O contexto biológico geral dessa análise incluiu as vias de LXR/RXR, óxido nítrico, eNOS, eIF2 e sirtuínas; metabolismo de ácidos graxos; estresse oxidativo; funções relacionadas ao tumor; e o processo metastático; além de funções biológicas agrupadas nos hallmarks clássicos do câncer e em fenótipos de estresse, processos metabólicos e vias de sinalização. O proteoma comparativo do câncer de mama masculino, por sua vez, evidenciou várias proteínas diferencialmente expressas entre os tecidos analisados. Em geral, essa análise identificou as vias de sinalização de granzima B, sirtuínas, eIF2, citoesqueleto de actina, eNOS, cálcio e resposta de fase aguda relacionadas às proteínas com alteração de expressão. A análise proteômica comparativa adicional, realizada entre os tecidos de tumor mamário masculino e o de uma paciente do sexo feminino com o mesmo subtipo da doença e parâmetros clinicopatológicos similares, indicou um relevante conjunto de proteínas diferencialmente expressas, envolvido principalmente em processos relacionados ao câncer e na transdução de sinal. Ao todo, este estudo revela perfis proteômicos diferenciais em processos associados e interconectados de sinalização no câncer de mama feminino e masculino e fornece fontes de dados relevantes para a pesquisa do câncer, as quais podem contribuir para procedimentos clínicos no câncer de mama. Para isso, abordagens complementares e estudos de validação são recomendados para confirmar o potencial de proteínas individuais e/ou de vias como marcadores biológicos na tumorigênese mamária. Abstract: Breast cancer is the most common cancer in women worldwide and the second most incident in women in Brazil, after non-melanoma skin cancer. In men, it is a rare malignancy accounting for about 1.8% of overall breast cancer cases. High-throughput technologies allied to bioinformatics have been used as study strategies to assist in the diagnosis, therapy selection, and prognosis of cancer. In this context, proteome and interactome analyses consist in important approaches to highlight the main biological processes associated with tumorigenesis, since the protein levels altered expression can influence critical cellular pathways and interactive networks, and compromise the tissue environment homeostasis contributing to cancer development. In this study, the mass spectrometry-based label-free quantification followed by functional annotation/enrichment and protein-protein interaction networks prediction were performed to obtain a landscape of the differential proteome and its functional biological context in the female and male breast cancer. Protein expression levels of the primary breast tumors were evaluated simultaneously with the corresponding metastatic axillary lymph nodes and the non-tumor breast tissues to identify the differentially expressed proteins among these tissues. In silico analyses of the proteomic data were used to identify the most relevant signaling and metabolic pathways, biological functions and processes as well as interaction networks related to the deregulated proteins. Data from female breast cancer analysis demonstrated a high level of similarity in the proteome profile of both non-tumor breast tissues (contralateral and adjacent) and between the malignant ones (primary breast tumor and axillary metastatic lymph nodes). The general biological context of this analysis included the pathways of LXR/RXR, nitric oxide, eNOS, eIF2 and sirtuins; fatty acid metabolism; oxidative stress; tumor-related functions; metastatic process; and to biological roles grouped into the classic hallmarks of cancer and in stress phenotypes, metabolic processes and signaling pathways. The comparative proteome of male breast cancer, on the other hand, highlights various differentially expressed proteins among the tissues analyzed. In general, this analysis identified the signaling pathways of granzyme B, sirtuins, eIF2, actin cytoskeleton, eNOS, calcium and acute phase response related to the deregulated proteins. The additional proteomic comparative analysis, performed between the tissues of the male breast tumor and the ones of a female patient matched for the breast cancer subtype and similar clinic-pathological parameters, indicated an interesting set of differentially expressed proteins, which were mainly involved in cancer-related biological processes and signal transduction. Altogether, this study reveals differential proteomic profiles in cancer associated and interconnected signaling processes in female and male breast cancers and provides relevant data sources for the cancer research, which can ultimately contributes to the clinical approaches in the breast cancer. Therefore, complementary approaches and validation studies are recommended to confirm the potential of individual proteins and/or pathways and cellular processes as biological markers in breast tumorigenesis.

Orientadora: Profª Drª Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/10/2017 Inclui referências: p. 84-100 Resumo: O câncer de mama é a neoplasia mais frequente em mulheres e apresenta o maior índice de mortalidade. A transição epitelial-mesenquimal (TEM) contribui para o processo metastático visto que é um evento onde células epiteliais neoplásicas ganham características mesenquimais. Para isso, uma série de mudanças podem ocorrer como alterações na expressão e no número de cópias dos genes. O gene VIM codifica a vimentina, uma proteína estrutural do citoesqueleto que contribui para a manutenção celular, garantindo a integridade citoplasmática, dando forma à célula e suporte às organelas. Quando a célula adquire a capacidade de deslocamento, a expressão de VIM se encontra alterada assim como a de CDH1. Este gene codifica a E-caderina, proteína que atua na adesão de células epiteliais apresentando baixa expressão quando relacionada com presença de metástase, diminuição da diferenciação do tumor e pior sobrevida. A análise da expressão destes genes e de dois mecanismos de regulação dos mesmos (número de cópias e status de metilação dos promotores) contribuirá para o entendimento da TEM em carcinomas primários de mama. As amostras (total de 137 tumores, 15 não tumorais e 28 linfonodos) foram cedidas pelo Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. As análises das expressões gênicas de CDH1 e VIM indicaram que nas amostras do sítio primário predominava o fenótipo epitelial. Posteriormente, foi observada a inversão das respectivas expressões com a progressão da doença, quando se analisou a expressão em linfonodo axilar metastático (2,85 para 0,30; 0,81 para 1,74, respectivamente para CDH1 e VIM). Foram analisados dois mecanismos que poderiam interferir na expressão gênica: o número de cópias gênicas e a metilação da região promotora. Para avaliar a variação do número de cópias foi utilizado PCR em tempo real, através da comparação com controle endógeno conhecido. Na análise de metilação da região promotora dos genes alvos foi utilizado o método de MSRE-PCR. Para o gene CDH1 verificou-se que a variação do número de cópias e a metilação parecem ter maior influência na regulação da expressão do que para o gene VIM. Em relação aos parâmetros clínicos e histopatológicos, verificou-se que a expressão dos genes e a alteração de seus números de cópias não são bons marcadores para distinguir subgrupos, porém o padrão de expressão é um forte indicador de progressão da doença. Palavras-chave: Câncer, transição, CDH1, VIM, TEM, gene, PCR Abstract: Breast cancer is the most frequent type of cancer in women and has the highest mortality rate. The epithelial-mesenchymal transition (EMT) contributes to the metastatic process since it is an event where neoplastic epithelial cells gain mesenchymal characteristics. For this, a number of changes may occur like changes in expression and in number of copies of genes. The VIM gene encodes vimentin, a structural protein of the cytoskeleton that contributes to cell maintenance by ensuring cytoplasmic integrity, giving cell shape and organelle support. When the cell acquires displacement capacity, the expression of VIM is altered, as well as CDH1 expression. This gene encodes E-cadherin, a protein that acts on the adhesion of epithelial cells, presenting low expression when related to the presence of metastasis, decreased tumor differentiation and worst survival. The analysis of gene expression, copy number and promoter methylation status of these genes will contribute to the understanding of EMT in primary breast carcinomas. The samples were provided by Hospital Nossa Senhora das Graças, Curitiba, PR. DNA extraction was performed using the Phenol-Chloroform method. Analysis of the CDH1 and VIM gene expression indicated that the epithelial phenotype predominated at the primary site samples. Subsequently, inversion of the respective expressions with disease progression was observed when the expression of metastatic axillary lymph node was analyzed (2.85 to 0.30, 0.81 to 1.74, respectively for CDH1 and VIM). Two mechanisms that could interfere with gene expression, number of gene copies and methylation of the promoter region, were analyzed. For the CDH1 gene it was found that the copy number variation and methylation appear to have a greater influence on the regulation of expression than for the VIM gene. Regarding the clinical and histopathological parameters, it was verified that the expression of genes and the alteration of their copy numbers are not good markers to distinguish subgroups, but the expression pattern is a strong indicator of disease progression. Keywords: Cancer, transition, CDH1, VIM, TEM, gene, PCR

Orientadora: Profa. Dra. Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientadores: Prof a. Dra. Danielle Malheiros Ferreira, Prof. Dr. Iglenir João Cavalli, Dra. Luciane Regina Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 25/10/2018 Inclui referências Resumo: O câncer de mama (CM) é a maior causa de morte por câncer em mulheres no mundo. A detecção precoce ainda é o fator determinante para um melhor curso da doença e aumento da sobrevida das pacientes e miRNAs derivados de vesículas extracelulares (VE-miRNAs) têm sido sugeridos como potenciais biomarcadores moleculares para o CM. Os VE-miRNAs estão associados a processos tumorigênicos no CM, como invasão, metástase e angiogênese, e a investigação de suas funções no contexto da doença é importante para uma melhor compreensão da patogênese. Apesar de uma série de marcadores moleculares terem sido descritos com potencial diagnóstico e prognóstico no CM, a utilização de VE-miRNAs como biomarcadores não é comprovada. Neste estudo, o objetivo foi avaliar o potencial diagnóstico e prognóstico de VE-MiRNAs isoladas de amostras de biópsias líquidas de pacientes com CM e controles, além de investigar a sua ação na modulação do potencial tumorigênico em linhagens celulares de mama. A expressão diferencial de VE-miRNAs foram identificadas por análise de RNAseq em amostras de soro de pacientes em comparação com controles. As VEs foram isoladas utilizando um kit de precipitação e o seu RNA extraído com kit comercial. A caracterização das VEs foram feitas por análise de rastreamento de partículas, microscopia eletrônica de transmissão e western blotting. O painel composto por alta expressão de miR-142-5p, miR- 320a e miR-4433b-5p, foi capaz de diagnosticar o CM com uma acurácia de 0,84 (sensibilidade de 93,33%, especificidade de 68,75%), e a combinação da alta expressão dos miR-142-5p e miR-320a gerou uma área sob a curva (AUC) de 0,94, com 100% de sensibilidade e 93,80% de especificidade para distinguir o subgrupo Luminal A. Foi verificado também que a baixa expressão dos miR-142-5p e miR-150-5p foi associada com grau de tumor 3 (p

Orientadora: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientadores: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli e Dr. Rodrigo Coutinho de Almeida Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 29/03/2018 Inclui referências: p.70-78 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais frequente na população feminina brasileira, sem considerar os tumores de pele não melanoma e mundialmente é considerado a principal causa de morte por câncer entre as mulheres. Tumores têm alterações genéticas que afetam os produtos da expressão gênica e, neste contexto, os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel importante no desenvolvimento do câncer, modulando a expressão de oncogenes e genes supressores de tumor. Polimorfismos localizados em genes que codificam miRNAs são capazes de alterar sua interação com o substrato, o RNA mensageiro, interferindo, gerando ou removendo os sítios de ligação dos miRNAs e alterando seu nível de expressão. Essas variantes genéticas podem ser de grande impacto para a biologia pois cada miRNA regula diferencialmente um grande número de alvos. No presente estudo foi avaliado o polimorfismo rs2910164, localizado na região seed do miR-146a, em 326 pacientes portadoras de câncer de mama esporádico e em 411 controles sem histórico de neoplasias, provenientes de uma população brasileira da cidade de Curitiba, PR. Para a genotipagem dos pacientes e controles foi utilizada a técnica de PCRSSP e, para complementar, foram realizadas análises in silico para se acessar dados de expressão do MIR146A no banco de dados de câncer TCGA. A análise da variância e o teste do Qui-Quadrado foram utilizados, respectivamente, na comparação entre as médias das idades e na análise de parâmetros histopatológicos (invasão de linfonodos regionais, grau de diferenciação tumoral e subtipo imunoistoquímico) dentre os diferentes genótipos. O estudo de associação caso-controle indicou presença de associação positiva quando analisados os genótipos CC/GC versus o genótipo GG (OR=1,38 - IC95%=1,03- 1,85). O teste do Qui-Quadrado de homogeneidade também foi utilizado para o teste do modelo dominante do alelo de risco (C) corroborando o resultado do OR com ?²= 4,66 e p

Orientadora: Profa. Dra. Enilze M. S. F. Ribeiro Coorientadores: Profa. Dra. Luciane R. Cavalli, Prof. Dr. Iglenir J. Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa : Curitiba, 23/03/2018 Inclui referências Resumo: As disparidades da saúde consistem em diferenças no status de saúde de indivíduos estratificados em grupos específicos devido a alguma característica ou fator epidemiológico específico. Os tumores mamários triplo-negativos (TNBC) constituem um subtipo de carcinoma mamário clinicamente agressivo, frequentemente diagnosticado em mulheres jovens e de grupos populacionais específicos como negras americanas, hispânicas e latinas. Essas diferenças na incidência e prognósticos do TNBC em determinadas populações indicam a existência de disparidades da saúde do câncer de mama. Os TNBC são um grupo bastante heterogêneo uma vez que são caracterizados apenas pela ausência de expressão dos receptores hormonais de estrogênio e progesterona, e a não superexpressão do HER2. Neste estudo, foram analisados os padrões de alterações de números de cópias de DNA (CNA) e de expressão de microRNA de amostras TNBC e não-TNBC (NTNBC) de pacientes negras americanas (AA), brancas americanas não-hispânicas (NHW) e brasileiras (LA). Um total de 164 amostras foi obtido do Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brasil) e do Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). A análise comparativa da expressão de microRNAs foi realizada entre os subtipos TNBC e NTNBC de cada grupo populacional, resultando em 194 miRNAs diferencialmente expressos (DEmiRNAs) entre as pacientes AA, 336 DEmiRNAs entre as pacientes NHW, e 163 DEmiRNAs entre as pacientes LA. A determinação dos DEmiRNAs entre as amostras AA TNBC e NHW TNBC resultou em 256 miRNAs diferencialmente expressos entre os dois grupos; a análise integrada com dados de CNAs das amostras AA TNBC resultou em um painel de 26 miRNAs que apresentaram dados concordantes de expressão de miRNAs e CNAs. Análises de curva de ROC indicaram um bom poder discriminatório desses miRNAs individuais e do painel em diferenciar as amostras AA TNBC e NHW TNBC. Análises de bioinformática indicaram que os 26 miRNAs podem estar envolvidos em vias de sinalização importantes na carcinogênese como via do PI3K-Akt, MAPK e Insulina. Entre os 26 miRNAs, o miR-150-5p foi selecionado para estudos funcionais que permitiram a determinação de seu potencial oncogênico no câncer de mama, principalmente em AA TNBC. A modulação da expressão do miR-150-5p através da utilização de inibidores e mimetizadores foi realizada seguida de análises da capacidade proliferativa (MTS e Ensaio Clonogênico), migratória, expressão de marcadores de transição epitelial-mesenquimal (EMT) e resistência a tratamento. A análise integrada dos dados de expressão de miRNAs e CNAs das pacientes LA resultou em um painel de 17 miRNAs com dados concordantes das duas análises. Este painel apresentou alto poder de discriminar amostras TNBC e NTNBC de pacientes brasileiras, com valor de AUC de 0.953. Em resumo, foram observadas diferenças biológicas no nível molecular (DNA e RNA) entre os tumores mamários das três populações estudadas que podem auxiliar na elucidação das disparidades de saúde observadas. Estes resultados indicam que os miRNAs são importantes na tumorigênese mamária e a integração com dados de CNAs permitem uma seleção de miRNAs para estudos como biomarcadores de diagnóstico, prognóstico e desenvolvimento de tratamentos. Palavras-chave: Câncer de mama. microRNAs. Disparidades de saúde. Abstract: Health disparities are differences in health status of individuals separated in specific groups because of specific characteristic or epidemiological factor. Triple negative breast cancer (TNBC) is a clinically aggressive subtype of breast cancer frequently presented in younger women from specific populations as African American, Hispanic and Latina. The differences in TNBC incidence and prognosis of specific populations show that breast cancer presents health disparities. TNBC is a highly heterogeneous group of diseases characterized by lack of expression of estrogen and progesterone receptors and lack of superexpression of HER2. In this study we analyzed DNA copy number alterations (CNA) and microRNAS expression patterns of TNBC and non-TNBC samples from African American (AA), non-Hispanic white (NHW) and Brazilian (LA) women. One hundred sixty four samples were obtained from Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR, Brazil) and Lombardi Comprehensive Cancer Center Georgetown University (Washington, DC, EUA). Comparative analysis of miRNA expression were performed between TNBC and NTNBC samples of each population, resulting in 194 differentially expressed miRNAs (DEmiRNAs) between AA subgroups, 336 DEmiRNAs between NHW subgroups, and 163 DEmiRNAs between LA subgroups. Two hundred and fifty six DEmiRNAs were obtained when AA TNBC and NHW TNBC samples were compared; integrative analysis of miRNA expression and CNA data of TNBC samples resulted in 26 miRNAs with concordant data of both analysis. ROC analysis indicates a good power of both individual miRNAs and combined panel of 26 miRNAs in discriminating AA TNBC and NHW TMBC samples. Bioinformatic analysis indicate that these 26 miRNAs may be involved in important signaling pathways for carcinogenesis, as PI3K-Akt, MAPK and Insulin pathways. Among the 26 miRNAs, miR-150-5p was selected for further functional analysis uncovering its oncogenic potential in breast cancer, especially in AA TNBC. Modulation of miR-150-5p expression by using inhibitors and mimics was performed followed by proliferation (MTS and Clonogenic Assay), migration, epithelial-tomesenchymal transition (EMT) markers expression and cytotoxic assays. Integrative analysis of miRNA expression and CNA data of LA patients resulted in 17 miRNAs with concordant data. This panel presented high power in discriminating TNBC and NTNBC subtypes of the Brazilian patients, with AUC of 0.953. In conclusion, there are biological differences at molecular levels (DNA and RNA) among breast tumors of the three populations of this study that might help elucidate health disparities observed. These results indicate that miRNAs are important for breast tumorigenesis and integration with CNA data allow a fine selection of miRNAs as diagnostic, prognostic biomarkers and for treatment development. Key-words: Breast cancer. microRNAs. Health disparities

Orientadora : Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Coorientadora : Profª. Drª. Angelica Beate Winter Boldt Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 25/11/2016 Inclui referências : f. 123-144 Área de concentração Resumo: Os Menonitas são um grupo Anabatista cristão que foi perseguido na Europa devido à sua crença, passando a constituir grupos fechados, em que a prática de casamentos consanguíneos se tornou frequente. Ao migrarem para o Brasil formaram comunidades como a Colônia de Witmarsum (PR). O câncer é um conjunto de doenças que apresenta diversas causas e uma grande complexidade podendo ocorrer de forma hereditária, quando uma mutação ocorre na linhagem germinativa e é transmitida ao longo das gerações de uma família dando origem às síndromes familiais. A comunidade de Witmarsum, por intermédio de uma representante, manifestou o desejo de ser estudada devido à percepção de que ali ocorriam muitos casos de câncer. Deste modo, foi proposto um estudo voluntário para se realizar o levantamento dos casos de câncer nas famílias desta comunidade e o aconselhamento genético. Dez famílias se voluntariaram, das quais três preencheram os critérios estabelecidos para síndromes conhecidas, como a Síndrome de Câncer de Mama e Ovário Hereditária (HBOC) em duas famílias e a Neurofibromatose do Tipo 1 (NF1) em uma terceira. Membros destas famílias foram selecionados para análises moleculares, que confirmaram os diagnósticos clínicos. Em ambos os casos foram encontradas mutações que alteram o quadro de leitura levando à produção de proteínas truncadas, sendo c.1961delA em BRCA1 no indivíduo da família com HBOC e c.3601delT em NF1 em cinco indivíduos da família com Neurofibromatose do Tipo 1. As demais famílias analisadas não preencheram critérios clínicos para síndromes já descritas e foram classificadas como portadoras de casos esporádicos de câncer. Palavras-chave: Menonita. Aconselhamento genético. Câncer hereditário. Abstract: Mennonites are a Christian Anabaptist group that were persecuted in Europe due to their belief, and since then constitute closed groups, where the practice of consanguineous marriage has become common. In Brazil, they migrated and formed communities such as "Witmarsum Community (PR)". Cancer is a multifactorial and complex group of diseases that can occur in hereditary form, when a germline mutation happens and is transmitted through family generations, giving rise to familial syndromes. The Witmarsum Community, through an agent, expressed the desire to be studied once they have noticed a high number of cancer cases in their population. In this way, a voluntary study was proposed to carry out the survey of cancer cases in the families of this community and the genetic counseling. Ten families volunteered, of which three met the established criteria for known syndromes. Two families were classified as Hereditary Breast and Ovarian Cancer (HBOC) and one as Neurofibromatosis type 1. Families members were selected for molecular analysis, that confirmed the diagnosis. In both cases were found frameshift mutations, that cause the production of truncated proteins, which are c.1961delT in BRCA1 in the HBOC family and c.3601delT in NF1 in the Neurofibromatosis type 1 family. The other families analyzed did not meet clinical criteria for syndromes already described and were classified as presenting sporadic cases of cancer. Key-words: Mennonite. Genetic counseling. Hereditary cancer

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Profº Dr. Juliano Javert Lourenço e Profº Dr.Iglenir João Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 14/02/2011 Inclui referências : f. 64-80-94-99 Área de concentração Resumo: O Câncer de Cólon e Reto (CCR) é um dos cânceres mais frequentes do mundo. Esta doença compreende subgrupos que se caracterizam por alterações genéticas e anatomopatológicas específicas e pode ser dividida em câncer esporádico e hereditário, sendo o Câncer de Cólon e Reto Hereditário Não-Polipomatoso (HNPCC) uma das formas mais comuns de CCR hereditário. Essa síndrome tem como principal característica a instabilidade de microssatélites (MSI), porém cerca de 10 a 15% dos CCR esporádicos também apresentam MSI. A análise da mutação V600E no proto-oncogene BRAF foi proposta para identificar CCR esporádico com MSI, e distingui-lo do HNPCC. O objetivo deste trabalho foi estimar a frequência da mutação V600E em CCRs esporádicos em uma população do Sul do Brasil e verificar se há correlação com MSI correlacionando os resultados com os dados clínicos e anátomopatológicos. Para isso, foi realizada a extração do DNA de 84 amostras em parafina, a amplificação dessas por PCR e, em seguida, para identificação da V600E foi realizado o sequenciamento. A mutação V600E não foi encontrada em nenhuma das amostras analisadas. Já para a análise de instabilidade de microssatélites foram genotipados três marcadores: BAT25, BAT26 e CAT25. A MSI foi observada em 12 (14,28%) amostras, sendo sete (58,33%) classificadas com alta instabilidade de microssatélites (MSI-H) e cinco (41,67%) com baixa instabilidade de microssatélites (MSI-L). Em relação à correlação de MSI-H com os dados clínicos e anátomopatológicos encontramos que um (10%) paciente apresentava idade ? 50 anos; três (8,33%) variavam entre 51-69 anos; e dois (6,45%) apresentavam idade ? 70 anos. Dos sete casos com MSI-H, cinco (10,87%) eram do sexo feminino e em, 17,85% os tumores estavam localizados no cólon direito/proximal. A proporção de MSI encontrada neste estudo foi a esperada e demonstrou associação com o local do tumor, reafirmando sua importância na abordagem inicial dos pacientes com CCR por se caracterizar como um importante auxiliar prognóstico e preditivo. Palavras-chave: Câncer de Cólon e Reto. BRAF V600E. Instabilidade de Microssatélites Abstract: The Colorectal Cancer (CRC) is one of the most frequent cancers worldwide. Itcomprises sub-groups which are characterized by genetic and pathological alterations and can be divided into sporadic and hereditary cancer. One of the most common forms of hereditary CRC, is the Hereditary Nonpolyposis Colorectal Cancer (HNPCC). The main feature of this syndrome is the microsatellite instability (MSI), but MSI also have been reported in 10-15% of sporadic CRC. A V600E mutation the BRAF proto-oncogene has been proposed to identify sporadic CRC with MSI, and distinguish it from HNPCC. The aim of the present study was to determinate the frequency of V600E mutation in sporadic CRCs of the southern Brazil population, its association with MSI and evaluate the association between clinical and anatomic pathological data. Initially, the extraction of DNA of 84 samples formalin-fixed paraffinembedded was performed. The samples were amplified by PCR. Sequencing was utilized to analyze the V600E. The V600E mutation was not detected in any of the samples. For the microsatellite analysis, it was done a genotyping of three markers: BAT25, BAT26 and CAT25. MSI was observed in 12 samples (14.28%), seven (58.33%) of them presented high microsatellite instability (MSIH) and five (41,67%) low microsatellite instability (MSI-L). As regards the correlation of MSI-H with clinical and pathological anatomical data, we observed that one (10%) patient was ? 50 years old; three (8.33%) were between 51-69 years old; and two (6.45%) were ? 70 years old. Of the seven patients with MSIH, five (10.87%) of them were female and 17.85% tumors were located in right/proximal colon. The proportion of MSI in this study was as expected and demonstrated association with the tumor location, it reaffirms its importance inthe initial approach to patients with CRC for assisting in the prognostic and predictive. Key-words: Colorectal Cancer. BRAF V600E. Microsatellite Instability.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadora : Profª. Drª. Enilze M. S. F. Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 22/11/2016 Inclui referências : f. 63-80 Resumo: O câncer de mama é o tipo mais comum dos casos de câncer diagnosticados em adultos com mutações germinativas no gene TP53, representando 27% de todos os tipos de câncer que apresentam mutação nesse gene. O estudo do gene supressor de tumor TP53 possibilitou a identificação da mutação R337H TP53 que se caracteriza por codificar uma histidina no lugar de arginina (R337H), no exon 10 do gene TP53, no domínio de tetramerização da proteína p53. Esta mutação ocorre em 95% dos pacientes pediátricos do Sul do Brasil portadores de Tumor de Córtex Adrenal (TCA), sendo de 0,27% a sua frequência populacional. Em uma análise de 171.649 recém-nascidos do Estado do Paraná, as famílias de indivíduos com a mutação R337H TP53 foram analisadas, sendo observado que o câncer de mama foi o tipo mais frequente de neoplasia encontrada nos adultos, correspondendo a 14,55% dos casos. O objetivo principal deste trabalho foi verificar, através da técnica de discriminação alélica pelo sistema TaqMan e Sequenciamento de Sanger, a frequência da mutação R337H TP53 em uma amostra de DNA tumoral de 700 pacientes portadoras de carcinomas mamários atendidas nos Hospitais Nossa Senhora das Graças e de Clínicas de Curitiba, PR, e analisar a instabilidade genômica, por array-CGH, nas pacientes com (n=5) e sem (n=9) a mutação R337H TP53. Das 700 pacientes, onze eram heterozigotas para a mutação estudada, com frequência genotípica de 0,0157 e alélica de 0,0079. A frequência genotípica observada na amostra analisada foi demonstrada ser 5,93 vezes maior do que a descrita previamente (0,27%), em uma amostra de 171.649 recém-nascidos do Estado do Paraná, indicando a relevância desta mutação na carcinogênese mamária. Após a comparação dos dados clínicos histopatológicos das pacientes com e sem a mutação, foi observada diferença estatisticamente significativa entre as médias de idade dos dois grupos de pacientes (t=1,97; P

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Prof. Dr.Iglenir João Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 26/06 2015 Inclui referências : f. 89-119 Resumo: O câncer de mama é o tipo de câncer mais comum entre as mulheres e cerca de 57.000 novos casos são esperados para a população brasileira em 2015. Um conhecimento sólido sobre a expressão proteica é essencial para a compreensão biológica, diagnóstico precoce e tratamento do câncer de mama. Os principais objetivos deste trabalho foram identificar proteínas diferencialmente expressas entre amostras pareadas de carcinoma ductal invasivo e tecido não tumoral de mama, e na seleção de possíveis alvos, avaliar e comparar a expressão de RNAm e proteica de STIP1 entre amostras de tecido de mama tumoral, não tumoral e de linfonodo metastático. A análise proteômica comparativa foi realizada pelo método de eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida para cinco amostras pareadas, sendo consideradas apenas as bandas com diferença de expressão acima de duas vezes (p

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/03/2015 Inclui referências : f. 80-92 Área de concentração Resumo: O câncer de mama é uma das principais causas de morte nas mulheres em todo o mundo, sendo este tipo de câncer o mais incidente na população feminina, desconsiderando o de pele não melanoma. Os tumores mamários são divididos em diferentes subtipos de acordo com o padrão de expressão gênica, no entanto, na prática laboratorial, usa-se a imuno-histoquímica como forma de classificação, baseando-se no status dos receptores hormonais e do HER2, subdividindo os tumores nos subtipos Luminal A, Luminal B, HER2+ e Triplo-Negativos. A região cromossômica 11q13 é comumente encontrada amplificada em tumores de mama e os genes FOSL1, GSTP1 e CCND1, localizados nesta região, têm sido apontados como genes alvos para a iniciação e progressão tumoral. Com o objetivo de avaliar a presença ou ausência de alteração do número de cópias dos referidos genes de acordo com os subtipos de tumores de mama, 77 amostras foram analisadas, sendo 26 luminal A, 29 luminal B, 10 HER2+ e 12 triplo-negativas. Verificamos que houve ganho de cópias nos três genes analisados, sendo 70% para o FOSL1, 23% para o GSTP1 e 26% para o CCND1. Através do teste de Kruskal-Wallis, observamos que FOSL1 foi o único gene que apresentou diferença estatisticamente significativa (p < 0,0001) entre os subtipos de tumor, tendo maior número de cópias os tumores triplo-negativos em relação aos luminais A e B. Pelo teste de regressão linear, foi possível observar que a alteração do número de cópias deste gene é dependente do subtipo de tumor (b = 0,79 ± 0,20; t = 3,95; p < 0,001) e independente das alterações nos outros dois genes. Análises de alteração do número de cópias de acordo com os parâmetros clínicos e histopatológicos não apresentaram diferença estatisticamente significativa para nenhum dos genes. Em conclusão, a alteração observada no gene FOSL1 sugere que este é um potencial marcador prognóstico e para a diferenciação dos subtipos de tumores. Palavras-chave: Câncer de mama. FOSL1, GSTP1, CCND1. Subtipo tumoral. Número de cópias de DNA. Abstract: Breast cancer is a leading cause of death in women worldwide. This type of cancer is the most frequent in the female population, after non-melanoma skin cancer. Mammary tumors are divided into subtypes according to the pattern of gene expression, however, in the laboratory routine, it is used a immunohistochemistry classification, based on the hormonal receptor and HER2 status, thus subdividing the tumors in subtypes Luminal A, Luminal B, HER2+ and triple-negative. The 11q13 region is commonly found amplified in breast tumors. FOSL1, GSTP1 and CCND1 genes are located in this region, and have been identified as target genes for tumor initiation and progression. Aiming to evaluate the copy number of these genes according to the subtypes of breast tumors, 77 samples were analyzed, 26 out of those were luminal A, 29 luminal B, 10 HER2+ and 12 triple-negative. We found gain in the copy number in all genes analyzed, 70% for FOSL1, 23% for GSTP1 and 26% for CCND1. Through Kruskal-Wallis test, we found that FOSL1 was the only one that showed a statistically significant difference (p < 0.0001) among tumor subtypes, with more copies in triple-negatives tumors compared to luminal A and luminal B. By linear regression test, we found that the change in the number of copies of this gene is dependent on the tumor subtype (b = 0.79 ± 0.20; t = 3.95; p < 0.001) and independent of the alterations in the other two genes. Copy number alteration according to the clinical and histopathological parameters showed no statistically significant differences for any of the genes. In conclusion copy number alterations in FOSL1 suggest that this gene may be a potential prognostic marker and for the differentiation and tumor subtypes. Keywords: Breast Cancer. FOSL1, GSTP1, CCND1. Tumor subtype. DNA copy number.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/09/2015 Inclui referências : f.86-96 Resumo: As alterações no número de cópias de DNA e na expressão gênica são fatores importantes no câncer de mama. Nosso objetivo foi investigar a possível associação dos genes FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD e CCND1, selecionados a partir de uma análise de CGHarray prévia, no desenvolvimento e na progressão dos tumores, assim como sua possível função como preditores de prognóstico. Com este objetivo, foram selecionadas amostras de pacientes com tumor primário sem (LN-) e com (LN+) metástase nos linfonodos axilares, e usando esse parâmetro como marcador da progressão da doença. O número de cópias de DNA e a expressão do RNAm foram analisadas utilizando ensaios TaqMan® em 137 tumores primários, sendo 53 LN- e 84 LN+. Todos os genes estudados mostraram aumento do número de cópias de DNA (58,07% da amostra total) com ênfase para os genes NTSR1, FADD e CCND1. Com exceção do gene FADD no grupo LN+, o nível de RNAm não mostrou dependência do número de cópias de DNA, sugerindo que outros mecanismos podem estar envolvidos na regulação. Em relação aos parâmetros clínicos e histopatológicos (tamanho, grau e estágio do tumor, expressão dos receptores hormonais e evolução clínica), não foi observada associação com as alterações de número de cópias de DNA. Os resultados indicam que o aumento do número de cópias em NTSR1, FADD e CCND1 provavelmente esteja envolvido nos estágios iniciais da tumorigênese mamária, uma vez que não foram observadas diferenças ao comparar LN- e LN+. Palavras-chave: Número de cópias de DNA, expressão gênica, câncer de mama, linfonodos, metástase, FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD, CCND1. Abstract: Changes in genes copy number and mRNA expression are important factors in breast cancer. We aimed to investigate the possible association of the genes FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD and CCND1, selected after previous array-CGH analysis, in tumor development and progression as well their possible role as prognostic predictors. With this objective, we selected samples from patients with primary tumors without (LN-) or with (LN+) metastasis in lymph nodes, taking this parameter as a marker of disease progression. The DNA copy number and mRNA expression were analyzed using TaqMan® assays in 137 primary breast tumors being 53 LN- and 84 LN+. All genes studied showed an increased copy number (58.07% of the total sample) with emphasis to NTSR1, FADD and CCND1. With the exception of FADD in LN+ group, the mRNA level did not show dependency of the copy number, suggesting that other mechanisms can be involved in the regulation. Regarding the histopathological and clinical parameters (tumor size, grade and stage, the hormonal receptors status and clinical evolution) no association with the copy number alterations were observed. The results indicated that the increased copy number in NTSR1, FADD and CCND1 is probably involved in the early stages of breast tumorigenesis, since no difference were observed when LN- and LN+ were compared. Key words: DNA copy number, gene expression, breast cancer, lymph node, metastasis, FOSL1, GSTP1, NTSR1, FADD, CCND1.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/03/2015 Inclui referências : f. 97-114;138-143 Área de concentração Resumo: A glândula mamária humana apresenta uma estrutura complexa, com um sistema integrado de renovação tecidual, regulado por diversos fatores que, em conjunto, atuam no remodelamento cíclico da mama. As constantes alterações na estrutura e nos níveis de fatores reguladores do desenvolvimento podem predispor o tecido a doenças mamárias, incluindo o câncer. A tumorigênese mamária é um evento complexo, com diferentes proteínas envolvidas. Alterações na expressão de proteínas-chave podem comprometer múltiplas vias relacionadas à proliferação, inibição da apoptose, migração, invasão e metástase. O estabelecimento do perfil proteico para o tecido mamário não tumoral, incluindo o contralateral pela sua localização em relação ao tumor, é fundamental para caracterizar a mama em estado saudável e possibilitar a inferência de alterações envolvidas na transformação e progressão neoplásica. Neste contexto, a proteômica consiste em um método de relevância para a caracterização de proteomas, contribuindo para a identificação de biomarcadores de utilidade no diagnóstico, na terapêutica e no prognóstico. No presente estudo, a eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida (2D-PAGE) combinada com a espectrometria de massa MALDI-TOF foram utilizadas para analisar as proteínas expressas pelo tecido mamário não tumoral contralateral, comparando com respectivas amostras de tumor. Cento e dez spots foram identificados e corresponderam a 62 proteínas distintas, categorizadas em nove classes funcionais. Para 45 spots, verificou-se a mesma identificação no tecido não tumoral da mama com o tumor e o matching entre este e o tecido contralateral indicou relevante similaridade entre ambos. A comparação com o tumor primário resultou na identificação de seis proteínas diferencialmente expressas, sendo duas exclusivas para o tumor, duas para o tecido contralateral e três comuns a ambos, com expressão elevada no tecido sadio. Os dados apresentados fornecem informações adicionais para a caracterização do tecido mamário não tumoral e indicam proteínas que podem ter função na tumorigênese mamária como alvos relevantes para futuras análises. Palavras-chave: Câncer de mama; tecido mamário não tumoral contralateral; proteoma; proteômica. Abstract: The human mammary gland presents a complex cellular structure, with an integrated system of tissue renewal that is controlled by several factors acting in cyclic remodeling of the breast. Continuous changes in the structure and in the levels of development-regulating factors may predispose the breast tissue to diseases, including cancer. The mammary tumorigenesis is a complex event, with different proteins involved. Expression changes in protein keys can compromise multiple pathways related to cell proliferation, inhibition of apoptosis, migration, invasion and metastasis. The establishment of the protein profile to the non-tumoral breast tissue, including the contralateral tissue according to its location in relation to the tumor, is essential to characterize the breast in healthy state and can allow the inference of changes involved in the transformation and neoplasic progression. In this context, the proteomics consists in an important method for the characterization of proteomes, contributing for the identification of useful biomarkers in the diagnosis, treatment and prognosis. In the present study, the two-dimensional gel electrophoresis (2D-PAGE) combined with mass spectrometry MALDI-TOF were used to analyze the proteins expressed in contralateral non-tumor breast tissue, compared with the respective tumor samples. There was identified 110 spots and corresponded for 62 distinct proteins, categorized into nine functional classes. For 45 spots, the same identification was found in contralateral and ipsilateral non-tumor breast tissues, indicated relevant similarity between both healthy tissues. Comparison with primary tumor resulted in the identification of six differentially expressed proteins, two exclusive for tumor tissue, one for the contralateral tissue and three were common, with increased expression in healthy tissue. These data provide additional information for the characterization of non-tumor breast tissue and indicate proteins that may have function in the mammary tumorigenesis as relevant targets for future analysis.Keywords: Breast cancer; contralateral non-tumor breast tissue; proteome; proteomics.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As Neoplasias Mieloproliferativas são originadas por uma proliferação clonal de um progenitor hematopoético. Descrita inicialmente em 1951 como “Doenças Mieloproliferativas” e reavaliada pela Organização Mundial da Saúde em 2011, as Neoplasias Mieloproliferativas agrupam a Policitemia Vera, Trombocitemia Essencial e Miefibrose Primária em um subgrupo chamado de BCR-ABL negativo. De acordo com a revisão dos critérios adotados para o diagnóstico das Neoplasias Mieloproliferativas a presença da mutação JAK2 V617F é considerada critério de maior importância para o diagnóstico do subgrupo BCR-ABL negativo representando um marcador clonal. A Policitemia Vera é principalmente diagnosticada por um aumento na massa eritrocitária independente de fator estimulante, aumento de leucócitos no sangue periférico, esplenomegalia e trombocitose. Ocorre, geralmente, em homens e mulheres com faixa etária de 60 anos, com incidência de 0,7 a 2,6/100.000 habitantes/ano. A mutação V617F no gene JAK2 produz uma proteína alterada que ativa constitutivamente a via JAK-STAT e outras vias downstream de modo que, as proteínas de ativação transcricional e transdutoras de sinal (STAT do inglês Signal Transducerand Activator of Transcription) são fosforiladas posteriormente impactando na expressão de genes envolvidos na regulação da apoptose e proteínas regulatórias, além de alterar a taxa de proliferação das células hematopoéticas. Neste trabalho foram selecionados 26 pacientes com Policitemia Vera, os quais foram atendidos na cidade de Juiz de Fora, Minas Gerais. Foram realizadas análises de mutações no gene JAK2 a partir do material genético isolado do sangue periférico. Os dados clínicos de cada paciente foram relacionados entre si e correlacionados com os dados moleculares. Myeloproliferative neoplasms (MPN) are caused by a clonal proliferation of a hematopoietic progenitor. First described in 1951 as “Myeloproliferative Diseases” and reevaluated by the World Health Organization in 2011 (WHO, 2011), the Myeloproliferative Neoplasms gather the Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia and Primary Mielofibrose in a subgroup called negative BCR-ABL. According to WHO the revised diagnosis criteria for myeloproliferative neoplasms, the presence of JAK2 V617F mutation, is considered the most important criterion for the diagnosis of negative BCR-ABL subgroup representing a clonal marker. The Polycythemia Vera is primarily diagnosed by an independent stimulating factor in red cells mass increasing, followed by an increase of leukocytes in peripheral blood, spleen and thrombocytosis. It usually occurs in men and women of all age groups with higher incidence in 60-year-old patients ranging from 0.7 to 2.6/ 100.000 hab/year. The V617F mutation in the JAK2 gene produces an altered protein that activates constitutively the JAK-STAT pathway and other pathways downstream as a result the protein transcriptional activation and signal transduction (STAT) are subsequently phosphorylated causing impact in the expression of genes involved in regulation of apoptosis and regulatory proteins, as well as altering the rate of proliferation of hematopoietic cells. In this study 26 patients with Polycythemia Vera were selected in Juiz de Fora, Minas Gerais. The peripheral blood was used for genetic material isolation (JAK2 mutation). The clinical data of each patient were related to each other and correlated with the molecular data.

Orientador : Prof. Dr. Ricardo Lehtonen R. de Souza Co-orientadoras : Profª Drª Enilze M. S. Ribeiro e Profª Drª Valéria Maria Sperandio Roxo Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/03/2014 Inclui referências Área de concentração : Genética Resumo: O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais frequente no mundo e o mais incidente entre as mulheres. Mais de 90% das mortes relatadas por câncer de mama, não são causadas pelo tumor primário e sim por suas metástases mamárias. Tais células migratórias são as manifestações mais agressivas do processo do câncer. Embora muitos estudos estejam sendo realizados, não há marcadores moleculares disponíveis para predizer o estadiamento dos cânceres de mama. A proteína Ciclina D1 têm sido amplamente estudada ao longo das últimas décadas, por seus diversos papéis nos processos fisiológicos de células normais e cancerosas. Suas funções, que incluem o controle do ciclo celular e a coregulação da transcrição gênica de sequências específicas, tem se mostrado associadas à tumorigênese. Diante disso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a importância do gene CCND1 como potencial marcador de progressão tumoral em carcinomas mamários. Foram utilizadas 41 amostras parafinizadas de carcinomas mamários do subtipo ductal invasor. Estas amostras foram subdivididas em tumores metastáticos e não-metastáticos de acordo com a informação sobre a presença de metástases em linfonodos axilares regionais. Foram realizadas análises de expressão gênica (mRNA), através da PCR quantitativa em tempo real, e proteica, por imunohistoquímica. Não foram identificadas diferenças nos níveis de mRNA de CCND1 e da proteína Ciclina D1 entre os tumores mamários metastáticos e não-metastáticos, sugerindo que, nesta amostra, a expressão gênica de CCND1, ao nível de mRNA e proteína, não influenciou significativamente no processo metastático. Na literatura, a Ciclina D1 apresenta valor diagnóstico e prognóstico bem definido em linfomas, onde é um critério diagnóstico no Linfoma de Células do Manto. Para a maioria dos cânceres sólidos, porém, ainda é controverso, com alguns autores diferenciando o significado biológico da amplificação gênica e da superexpressão da proteína, desde que estas não são interdependentes. Devido a estas controvérsias, mais estudos devem ser realizados, na tentativa de esclarecer o valor diagnóstico e prognóstico da Ciclina D1, bem como os vários mecanismos que desencadeiam sua superexpressão em tumores. PALAVRAS-CHAVE: Câncer de mama. Expressão gênica. CCND1. Metástases. Progressão tumoral. Abstract: Breast cancer is the second most common cancer worldwide and the most frequent among women. Over 90% of reported deaths from breast cancer are not caused by the primary tumor, but by their mammary metastases. These migratory cells are the most aggressive manifestations of the cancer process. Although many studies are being conducted, there are no molecular markers available to predict the staging of breast cancers. The Cyclin D1 protein has been extensively studied over the past decades by its many roles in the physiological processes of normal and cancer cells. Its functions, ranging from cell cycle control to the specific sequences of gene transcription co-regulation, have been associated with tumorigenesis. Therefore, the aim of this study was to evaluate the importance of CCND1 gene as a potential marker of tumor progression in breast carcinomas. Forty-one paraffin embedded samples of invasive ductal breast carcinomas subtype were used. These samples were subdivided into metastatic and non-metastatic tumors according to the information about the presence of regional metastases in the axillary lymph nodes. Gene expression analyses (mRNA) were performed by quantitative real-time PCR, and protein expression by immunohistochemistry. No differences were observed in mRNA levels of CCND1 and Cyclin D1 protein between metastatic and non-metastatic breast tumors, suggesting that, in this sample, the gene expression of CCND1 no significantly influenced the metastatic process. In literature, the diagnostic and prognostic value of Cyclin D1 is well defined in lymphomas, which is a diagnostic criterion in Mantle Cell Lymphoma. For most cancers, however, it is still controversial, with some authors distinguishing between the biological significance of gene amplification and protein overexpression, since these are not interdependent. Because of these controversies, further studies should be conducted in an attempt to clarify the value of Cyclin D1 as a marker in breast cancer, as well as the various mechanisms which trigger its overexpression in tumors. KEYWORDS: Breast cancer. Gene expression. CCND1. Metastases. Tumor progression.

Resumo: A descoberta de novos marcadores moleculares como ferramentas no diagnóstico, prognóstico e tratamento de diversas doenças, incluindo o câncer, é de extrema importância. A proteína HLA-G apresenta função de imunotolerância, auxiliando as células tumorais a escaparem do reconhecimento e destruição pelo sistema imune. Níveis aumentados de expressão do produto do gene HLA-G já foram identificados e associados com piores prognósticos em diversos tipos de neoplasias malignas como no câncer de pulmão, colo-retal, mama, melanomas e leucemias, sendo, portanto considerado, um potencial marcador. Neste estudo a expressão de HLA-G foi analisada através da técnica de imunoistoquímica (IHQ) em 202 carcinomas ductais infiltrantes de mama (IDC) e 104 tecidos mamários normais emblocados em parafina. Dentre estas amostras, 64 IDC e 14 normais foram avaliados por PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Dos 202 IDC, 38 (18,8%) coraram positivamente para HLA-G. Diferentemente destes, somente uma (0,9%) das 104 amostras de tecido não tumoral corou positivamente para HLA-G (p

Orientadora : Profª Drª Enilze M. S. F. Ribeiro Co-orientadores : Profª Drª Luciane R. Cavalli, Prof. Dr. Iglenir J. Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 28/03/2014 Inclui referências Área de concentração: Genética Resumo: Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de moléculas de RNA não codificadoras que apresentam um papel na tumorigênese mamária, regulando genes envolvidos no ciclo celular, proliferação celular, invasão e metástase. Os diferentes subtipos de câncer de mama apresentam diferentes padrões de expressão de miRNAs, dessa forma essas moléculas podem ser potenciais marcadores terapêuticos para subtipos agressivos, como os tumores mamários triplo negativos (TN). Os tumores TN são clinicamente agressivos e possuem baixa ou nenhuma expressão dos receptores de estrogênio (ER), progesterona (PR) e HER2, dessa forma não respondem efetivamente a terapias alvos disponíveis atualmente. No presente trabalho, foi analisado o padrão de expressão de miRNAs de 83 tumores TN e 12 não-TN, juntamente com dados de alterações de números de cópias de DNA por array-CGH obtidos das mesmas amostras, a fim de identificar os miRNAs mais relevantes e seus respectivos genes alvos que podem estar envolvidos na patogênese dos tumores de mama TN. 117 miRNAs foram encontrados com expressão diferencial em tumores TN, quando comparados com os não-TN. A análise combinada de miRNA/aCGH resultou em 17 miRNAs que apresentaram dados concordantes de expressão de miRNA e alterações de números de cópias (ganho/perda de aCGH com alta/baixa expressão de miRNA, respectivamente). Análises de sistemas biológicos downstream de alvos conhecidos e possíveis alvos dos miRNAs selecionados indicaram as vias de sinalização do TGF-beta, PI3K-Akt e HER2, assim como vias envolvidas na adesão celular e outros processos relacionados ao câncer. Estes resultados sugerem que os 17 miRNAs e seus respetivos genes alvos podem ser futuramente estudados como marcadores moleculares específicos para tumores TN, sugerindo a necessidade de estudos de análise funcional e biológica que comprovem suas participações na tumorigênese mamária de tumores do tipo TN. Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are a class of non-coding endogenous RNA molecules that play a role in breast tumorigenesis regulating genes involved in cell cycle, proliferation, invasion and metastasis. Different subtypes of breast cancer presents different expression of miRNAs, and they can be potential therapeutic markers for aggressive subtypes as triple negative breast cancers (TNBC). TNBC are clinically aggressive tumors that lack the expression of ER, PR and HER2 receptors, therefore they do not respond effectively to the available target therapies. In the present study, we investigated miRNA expression pattern of 83 TNBC and 12 non-TNBC tumors and integrated the data with DNA copy number alterations data by array-CGH from the same samples, to obtain the most relevant miRNAs and their respective target genes that may be involved in the pathogenesis of TNBC. 117 miRNAs were found as differentially expressed in TNBC, when compared to non-TNBC. The combined analysis (miRNA/aCGH) resulted in 17 miRNAs that presented miRNA concomitant genomic gains and losses by aCGH and miRNA increase or decrease expression, respectively. KEGG pathway enrichment analysis of the selected 17 miRNAs revealed that their main pathways involved in TGF-beta signaling pathway, PI3K-Akt and HER2 signaling pathways as well as the ones involved in adherence junction and other cancer related processes. Our results suggest that the 17 miRNAs and their target genes may be studied as specific molecular markers for TNBC, suggesting the need for functional and biological analysis that proves their roles in TN tumorigenesis.

Orientador : Prof. Dr. Gerard P. Zambetti Co-orientadora : Profª. Drª. Enilze Maria de Souza F. Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 21/11/2014 Inclui referências Área de concentração Resumo: Os tipos histológicos e localizações dos tumores diagnosticados em pacientes portadores de mutação hereditária no gene TP53 são semelhantes aos encontrados nos pacientes com mutação esporádica no TP53. Entretanto, os pacientes com mutação hereditária tendem a desenvolver os tumores mais precocemente. O tecido adrenocortical é aparentemente muito mais sensível à perda da atividade da proteína p53, especialmente nos primeiros anos de vida quando comparado ao córtex adrenal adulto. Em adição, mais de 50% dos tumores do córtex adrenal (TCA) de crianças apresentam algum tipo de mutação no TP53. Células de TCA com mutação no TP53 apresentam mais perdas e ganhos de cromossomos do que TCA sem mutação no TP53. Acredita-se que a mutação isolada no gene TP53 é insuficiente para o desenvolvimento tumoral, sendo necessário contribuições de outros fatores genéticos e/ou ambientais para o inicio da tumorigênese. Carcinoma adrenocortical pediátrico (CCA) é um tumor raro, maligno, e com prognóstico reservado. O objetivo deste trabalho foi analisar 37 TCAs de crianças pelo sequenciamento genômico completo, sequenciamento do exoma e/ou sequenciamento do transcriptoma. O critério de seleção dos TCAs (carcinomas e adenomas) considerou a distribuição dos diferentes tipos histológicos (benigno e maligno), presença ou ausência de mutação no gene TP53, TCAs com a mutação TP53 R337H, ou outras mutações no gene TP53 com elevada penetrância. A perda de heterozigose (LOH) do braço curto do cromossomo 11 (ch11p) ocorreu em 91% dos casos, e em todos os casos analisados a perda foi do cromossomo materno. O gene IGF-2, localizado dentro de um conjunto de genes sob controle de imprinting no ch11p, apresentou elevada expressão em 100% dos tumores analisados. Mutações no gene TP53 em combinação com LOH do cromossomo 17 (ch17) foi observado em 28/37 casos de TCAs (76%), quando comparado com TCAs que apresentaram o p53 selvagem. LOH dos cromossomos ch11p e ch17 ocorreu no início da tumorigênese, sugerindo serem estes eventos iniciadores da formação tumoral. Outras alterações genéticas encontradas nos TCAs incluem mutações somáticas recorrentes nos genes ATRX, CTNNB1, e integração do virus herpes humano-6 (HHV6) na região telomérica do ch11p. O pior prognóstico foi identificado nos pacientes com CCAs que apresentaram mutações no TP53 e ATRX associadas a outras anormalidades genômicas, incluindo as variações estruturais complexas. No conjunto, estes resultados demonstram o caráter, a ordem temporal e o possível significado prognóstico de alterações genéticas fundamentais nos TCAs pediátricos, como também delinearam uma proposta de modelo da tumorigênese no córtex adrenal do grupo pediátrico. Palavras-chave: Tumor de córtex adrenal; criança; genoma; TP53; mutação. Abstract: The spectrum of tumors in patients with TP53 germline mutation is similar to that found in sporadic tumors, but inherited tumors tend to develop much earlier. The adrenocortical tissue of younger children are highly sensitive to the loss of p53 activity, much more than the adult adrenal cortex, and over 50% of the adrenocortical tumours (ACT) of children have some kind of TP53 mutation. ACT cells with TP53 mutations exhibit more deletions and gains of chromosomes than ACTs without TP53 mutation. It is believed that cells with TP53 mutations to undergo transformation require contributions from environmental contaminants and / or other mutations to initiate tumorigenesis. Pediatric adrenocortical carcinoma is a rare malignancy with poor prognosis. Here we analyzed 37 childhood ACTs by whole genome, whole exome and/or transcriptome sequencing. The criteria for selecting ACTs (carcinomas and adenomas) considered the well-known distribution of different ACT types, including benign and malignant tumors, presence or absence of mutations in the TP53 gene, and also ACTs with the TP53 R337H mutation or other mutation in the TP53 gene with higher penetrance. Loss of heterozygosity (LOH) of chromosome 11p occurred in 91% of ACTs and all informative cases selected against the maternal chromosome. IGF2, which is located within a cluster of imprinted genes on chromosome 11p, was overexpressed in 100% of the tumors. TP53 mutations and chromosome 17 LOH with selection against wild-type TP53 were observed in 28 ACT cases (76%). Copy neutral- LOH of chromosomes 11p and 17 occurred early during tumorigenesis, suggestive of tumor driver events. Additional genetic alterations included recurrent somatic mutations in ATRX and CTNNB1, as well as integration of human herpesvirus-6 (HHV6) in the telomeric region of chromosome 11p. A very poor outcome was predicted by concomitant TP53 and ATRX mutations and associated genomic abnormalities, including massive structural variations and a high background mutation rate. Collectively, these findings demonstrate the nature, timing and potential prognostic significance of key genetic alterations in pediatric ACT and outline a hypothetical model of pediatric adrenocortical tumorigenesis. Keywords: Adrenocortical tumour; children; genome, TP53; mutation.

Resumo: A leucemia de lactentes difere das demais por apresentar diversas características epidemiológicas e biológicas particulares, com destaque à alta freqüência do envolvimento do gene MLL que é rearranjado com uma variedade de outros genes (cerca de 50 já descritos), gerando produtos de fusão comprovadamente leucemogênicos, apesar de o mecanismo exato ser ainda desconhecido. A identificação do envolvimento do MLL é por si só de grande importância prognóstica e terapêutica, porém a identificação das seqüências parceiras assume importância desde que traz informações sobre os mecanismos básicos de leucemogênese, de possíveis alvos para terapias e pesquisa de doença residual mínima. Com o objetivo de estimar a freqüência e caracterizar os diferentes rearranjos do gene MLL em uma amostra brasileira de lactentes portadores de leucemia aguda de novo, foram analisados 112 pacientes provenientes do "Grupo Brasileiro de Estudos Colaborativos sobre Leucemia Aguda em Lactentes". Vários métodos laboratoriais foram utilizados de forma complementar (citogenética convencional e molecular, RT-PCR, Southern Blotting, LDI-PCR e seqüenciamento), de acordo com um fluxograma previamente estabelecido. Vinte pacientes (17,85%) eram portadores de alterações recorrentes e bem caracterizadas nas leucemias e foram excluídos da análise do gene MLL. Dentre os 92 restantes, 56 pacientes eram portadores de rearranjos no gene MLL (61%) e 36 não (39%). A alteração mais freqüentemente observada foi o rearranjo MLL/AFF1, observado em nove dentre os 56 pacientes positivos para o rearranjo considerando os diversos métodos (16,1%). O estudo corrobora a importância da utilização de diversas metodologias complementares na identificação do rearranjo do gene MLL e de seus parceiros, destacando a alta sensibilidade do método de hibridização in situ por fluorescência (FISH), que foi capaz de identificar 49 pacientes positivos em 82 (59,8%) em que a hibridização foi possível incluindo 38 casos que, sem esta análise, seriam dados como normais. Considerando que a limitação deste método é a não identificação do gene parceiro, a análise por LDI mostrou-se extremamente eficaz na complementação, identificando 9 de 13 casos analisados (69,2%), sendo que um destes rearranjado ao gene Nebulette, caracterizando um novo gene de fusão.

Resumo: O câncer é uma doença genética, de caráter multifatorial, resultantes de alterações genômicas como mutações pontuais, rearranjos, deleções e amplificações que determinam modificações na expressão dos oncogenes e de genes supressores de tumor. A incidência e mortalidade por câncer vem aumentando a cada ano no mundo, tornando-se um dos maiores problemas de saúde pública. O câncer de mama é a segunda neoplasia mais comum e a principal causa de morte em mulheres em todo o mundo. A análise de expressão gênica, através de PCR em tempo real, de PDIA3 e PDIA6 foi realizada em pacientes que apresentavam câncer de mama primário. Estes genes codificam proteínas que estão envolvidas no controle do estresse celular e são abundantes no retículo endoplasmático. Além disso, quando alteradas, podem estar relacionadas a várias etapas do processo carcinogênico. O presente trabalho analisou a expressão destes genes comparado-a entre o tecido mamário tumoral e não tumoral, e no primeiro entre diferentes parâmetros clínicos, como presença ou ausência de metástase nos linfonodos, receptores hormonais, estrogênio e progesterona, positivos e negativos (ER+/PR+;ER-/PR-), e grau histológico do tumor. Foi observada diferença estatisticamente significativa (U=57,50, p= 0,0009) na expressão do gene PDIA3 entre o tecido tumoral e não tumoral, sendo maior no primeiro, na presença e ausência de metástase nos linfonodos (t= 2.185, p= 0.0099) e entre diferentes graus histológicos (U= 68.00, p= 0.0244). Para o gene PDIA6, a significância da diferença entre as médias de expressão foi verificada entre a presença e ausência de metástase (U= 99.00, p = 0.0476) e ER+/PR+//ER-/PR- (U= 61.50, p= 0.0351). Estes resultados sugerem que o gene PDIA3 influencia nos processos iniciais e de progressão do câncer de mama, e o gene PDIA6 está principalmente envolvido na progressão.

Orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 24/04/2013 Inclui referências : f. 69-72; 111-132 Área de concentração Resumo: O câncer de mama é a malignidade mais comum entre as mulheres em todo o mundo. É definido como um conjunto de doenças complexas causadas por alterações genéticas e epigenéticas que podem resultar em alterações em mecanismos como a proliferação celular, apoptose e angiogênese. Aproximadamente 20% a 30% dos pacientes diagnosticados apresentam doença metastática que é considerada a maior causa de mortalidade associada ao câncer de mama. A proteômica é utilizada como ferramenta na busca de marcadores que possam auxiliar no diagnóstico precoce e no prognóstico do câncer. O objetivo deste trabalho consiste em uma análise comparativa entre o tumor primário e o linfonodo axilar metastático identificando proteínas diferencialmente expressas entre os dois tecidos através das técnicas de eletroforese bidimensional (2D-SDS-PAGE) e espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Sete amostras de tumor primário e respectivo linfonodo axilar metastático foram analisados em pacientes com carcinoma ductal. Foram excisados spots com valor de 0,001

Resumo: No Brasil os carcinomas mamários são os mais comuns entre as mulheres. O câncer de mama é uma doença heterogênea, cuja classificação é baseada na morfologia celular e na presença de receptores específicos. Esta classificação é útil na predição do prognóstico e no direcionamento do tratamento, e permitiu o desenvolvimento de terapias adjuvantes atualmente em uso na clínica. Estudos revelaram a presença de cinco subtipos intrínsecos de câncer de mama, quanto ao padrão de expressão gênica e às alterações genéticas: luminal-A, luminal-B, normal-like, ERBB2+ e basallike (incluindo-se aqui os tumores triplo negativos -TNBC). Considerando estes padrões de expressão, novas estratégias terapêuticas têm sido sugeridas. A análise da expressão de genes envolvidos nas vias de reparo do DNA e de outros genes importantes ao metabolismo celular, apresenta relevância clínica e para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. O objetivo principal do trabalho foi analisar a expressão de genes da via de reparo do DNA FA-BRCA, e do gene MTAP, propondo novas possibilidades terapêuticas em câncer de mama de acordo com o comportamento destes genes em diferentes subtipos tumorais. Foram utilizadas 46 amostras não-parafinizadas de carcinomas primários da mama, dez amostras não-parafinizadas de tecido não-tumoral da mama contralateral, 85 amostras paranifizadas de tumores de mama TNBC, 66 amostras parafinizadas de tumores de mama do grupo Luminal-A e sete linhagens celulares de carcinomas mamários. O gene FANCD2 foi aproximadamente duas vezes mais expresso no grupo tumoral (36) em relação ao grupo não-tumoral (10), quando se analisou um grupo de carcinomas ductais invasores. As amostras não-parafinizadas foram também classificadas conforme os subtipos intrínsecos do câncer de mama. O gene BRCA1 foi aproximadamente três vezes menos expresso no grupo Luminal-B (14) em relação ao grupo Luminal-A (23). Nas amostras parafinizadas, o gene MTAP se mostrou aproximadamente duas vezes menos expresso no grupo TNBC (85) em relação ao grupo Luminal-A (66). MTAP foi inativado em uma linhagem celular que expressa o gene, e foram realizados ensaios citotóxicos com fármacos que interferem na via da biossíntese de poliaminas. As células MTAP-negativas apresentaram maior sensibilidade ao fármaco 5'- fluorouracil (5'-FU) em relação às células MTAP-positivas. O aumento da expressão gênica de FANCD2 no grupo tumoral pode ser um indicador da ativação da via, o que contribui para o processo carcinogênico, e também já foi correlacionado com a resistência à ciclofosfamida e outros quimioterápicos. A redução da expressão de BRCA1 no grupo Luminal-B é considerada um indicador para a escolha de terapias adjuvantes baseadas em cisplatina, e para que tratamentos baseados em taxóis sejam evitados, devido ao maior risco de resistência. Tumores com expressão reduzida de MTAP, como o grupo TNBC, são mais sensíveis a inibidores da síntese de poliaminas, como o 5'- FU. Nossos resultados corroboram um esquema terapêutico proposto recentemente para tumores MTAP-negativos, baseado no uso de análogos de poliaminas e do substato MTA, sugerindo novas possibilidades terapêuticas para pacientes TNBC. O padrão de expressão dos genes FANCD2, BRCA1 e MTAP apresenta forte relevância clínica, influenciando a resposta a diversos fármacos, e também atuando como novos alvos terapêuticos no câncer de mama.

Orientadores : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli, Profª Drª Luciane R. Cavalli Co-orientadora : Profª Drª Enilze Maria S.F. Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 27/07/2012 Inclui referências : f. 86-101 Resumo: Tumores de mama triplo negativos (TN) formam um grupo biológico de tumores que possuem baixa ou nenhuma expressão dos receptores de estrogênio (RE), progesterona (RP) e HER2. Esses tumores são associados com um pior prognóstico clínico e altas taxas de mortalidade quando comparados com outros subtipos de câncer de mama. Pacientes com tumores TN não se beneficiam de terapias endócrinas ou imunológicas (como o traztuzumab). A quimioterapia sistêmica é atualmente o tratamento adotado, embora essas pacientes apresentem pior prognóstico após a quimioterapia do que pacientes com outros subtipos de tumor. A via de sinalização da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K/AKT) regula funções celulares importantes tais como crescimento, sobrevivência e proliferação. A desregulação dessa via é frequentemente associada ao desenvolvimento do câncer de mama e resistência à terapia. Assim, drogas que têm como alvo os componentes da via PI3K/AKT estão sendo desenvolvidas e testadas em monoterapia ou em combinação com outros agentes terapêuticos em inúmeros ensaios clínicos. Neste estudo, foram analisadas as alterações de número de cópias de cinco genes desta via, PIK3CA, AKT1, AKT2, PTEN e FGFR2 através das técnicas de aCGH, PCR em tempo real e FISH em tumores de mama triplo negativos (TN) e não-triplo negativos (N-TN). Um total de 54 amostras de tumores TN foram obtidos dos hospitais Nossa Senhora das Graças, Curitiba, Brazil e 65 amostras de tumores N-TN do Laboratório Nacional de Ciências da Saúde, cidade do Cabo, África do Sul. Os resultados dos estudos epidemiológicos realizados com os dados clínico-patológicos dessas pacientes (idade, envolvimento de linfonodos, tamanho e grau tumoral) encontraram uma frequência significativamente maior de tumores de grau III e menor de tumores de grau I nas pacientes TN do Brasil quando comparado as pacientes N-TN da África do Sul. Essa associação também foi encontrada quando as informações das pacientes TN foram comparadas com dados de pacientes N-TN provenientes da mesma região do Brasil , eliminando influências étnicas e corroborando estudos prévios que associam o fenótipo triplo negativo com característicos de prognóstico clínico agressivo. Alterações de número de cópias foram observadas em todos os cinco genes analisados e a perda de PTEN foi a alteração mais frequente tanto em tumores TN quanto em tumores N-TN. Além disso a perda desse gene foi associada significativamente com grau tumoral avançado (grau III) nas pacientes do subtipo TN. A análise das alterações de número de cópias dos cinco genes entre tumores TN e N-TN demonstrou que somente o aumento do número de cópias do gene FGFR2 foi significativamente associado com os tumores TN. Esses achados corroboram estudos prévios que associam a amplificação de FGFR2 com o fenótipo triplo negativo, sugerindo este gene como importante fator prognóstico e possível alvo terapêutico para esse subtipo tumoral. As frequências de alterações dos genes AKT1, AKT2, PIK3CA e PTEN não diferiram entre os tumores TN e N-TN e podem estar envolvidos no desenvolvimentos de ambos os subtipos de tumores. Em resumo, considerando o importante papel da via de sinalização PI3K/AKT na progressão tumoral e resistência à terapia nos tumores de mama triplo negativos, as informações das alterações de número de cópias dos genes dessa via são relevantes e podem ser utilizadas como marcadores moleculares no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Abstract: Triple negative breast cancer is defined as a biological group of tumors that lack expression of estrogen (ER) and progesterone receptor (PR), and HER2. These tumors are associated with poor prognosis and a high mortality rate when compared to other breast cancer subtypes. Women with triple negative breast cancer do not benefit from endocrine therapy or trastuzumab. Chemotherapy is currently the systemic medical treatment, although patients with triple negative disease have a worse outcome after chemotherapy than patients with other breast cancer subtypes. The phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K/AKT) signaling pathway mediates key cellular function such as cell growth, survival and proliferation. Frequent deregulation and aberrations of this pathway have been implicated in breast cancer development and in therapy resistance. Thus, multiple drugs targeting the PI3K/AKT pathway are in development and are been testing in clinical trials as monotherapy and in combination with other therapies in breast cancer patients. In this study, specific genes involved in PIK3/AKT pathway, PIK3CA, AKT1, AKT2, PTEN and FGFR2, were analyzed for DNA copy number changes in samples of Triple negative (TN) and non triple negative breast tumors (N-TN) by aCGH, real time PCR and FISH analysis A total of fifty-four samples of triple negative (TN) breast cancer were obtained from the Hospital Nossa Senhora das Gracas and Clinical Hospital, Curitiba, PR, Brazil and sixty-five samples of non triple negative (N-TN) tumors from National Laboratory of Health Sciences, Cape Town, South Africa. Epidemiological studies performed with the clinical pathological data of these patients (age, tumor size, histological grade and lymph node status) showed a significantly higher frequency of grade III tumors and lower frequency of grade I in TN when comparing with N-TN patients. This association was also observed when data of TN Brazilian patients were compared with N-TN patients from the same region of Brazil, corroborating previous studies that associated the triple-negative phenotype with features of poor prognosis. DNA copy number changes were observed in all the five genes studied and PTEN loss was the most frequently alteration in both TN and N-TN breast tumors. Besides, the analyzes between copy number alterations and clinic pathological parameters of patients showed that PTEN loss was significantly associated with advanced tumor grade (III) in the TN subtype. When the copy number changes of the five genes were compared between TN and N-TN, the high copy number of FGFR2 gene was significantly associated with TN tumors. These findings corroborate previous studies that associate FGFR2 gene amplification with triple-negative phenotype, suggesting this gene as an important prognostic factor and possible therapeutic target for triple negative tumors. The frequencies of AKT1, AKT2, PIK3CA and PTEN alterations did not differ significantly between the two subtypes of breast cancer and may play a role in the development of both tumor subtypes. Considering the crucial role that PI3K/AKT pathway plays in tumor progression and drug resistance among triple negative breast cancer patients, a better understanding of the genomic alteration of these genes provides relevant information to the development of new therapeutic targets and for the interpretation of clinical trials.

Resumo: O câncer de mama apresenta uma alta incidência, aparecendo como o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Apesar de ser considerado um câncer de bom prognóstico, se diagnosticado e tratado precocemente, as taxas de mortalidade no Brasil são elevadas provavelmente porque a doença é diagnosticada em estágios avançados. As pesquisas sobre o diagnóstico e tratamento desta doença permitiram avanços que refletiram na melhora do prognóstico e sobrevida destas pacientes nas últimas décadas. Entretanto, ainda não são claros os mecanismos básicos da carcinogênese mamária, cujo conhecimento é fundamental para a caracterização de novos marcadores moleculares tanto para o diagnóstico precoce como para o desenvolvimento de terapias específicas. Considerando que as análises proteômicas são de grande valia na identificação das funções biológicas e protéicas, além das inter-relações protéicas, o estudo comparativo do proteoma das pacientes com carcinoma lobular e ductal é uma interessante forma de se identificar proteínas diferencialmente expressas. Neste trabalho foram estudadas seis amostras de carcinomas mamários, três caracterizados como ductais (CD) e três como lobulares (CL). A análise comparativa do proteoma realizada por eletroforese bidimensional e espectrometria de massas possibilitou a identificação de 30 spots estatisticamente relevantes, correspondendo a 26 proteínas diferencialmente expressas entre as pacientes com CD e CL. Funcionalmente estas proteínas estão envolvidas numa série de processos biológicos, como apoptose, resposta ao estresse, organização do citoesqueleto, diferenciação, proliferação, progressão, angiogênese e regulação da divisão celular, que podem desempenhar um papel importante nas propriedades tipo-específicas de cada tumor. Nossos dados reforçam a diferença de expressão de algumas proteínas relatadas em trabalhos anteriores, além de apontar diferenças relevantes entre os dois subtipos tumorais, que devem ser confirmadas em amostras individuais. Como por exemplo, a baixa regulação da proteína de ligação à vitamina D, tropomiosina cadeia alfa-3, triose-fosfato isomerase e endoplasmina, encontrada no CL. Conseqüentemente, o CL difere do CD não somente nas características clínicas e histológicas, mas também no padrão de expressão protéica, fornecendo evidências complexas da inter-relação entre os subtipos histológicos. Os achados protéicos diferenciais tanto do CD quanto do CL podem trazer importantes aplicações clínicas como potenciais biomarcadores, inclusive para terapias direcionadas. No entanto, mais estudos são necessários para compreender as diferenças aqui observadas, quanto a fornecer informações consistentes sobre a correlação destas proteínas com o diagnóstico, tratamento e prognóstico de cada subtipo histológico.

Resumo: Os tumores de cabeca e pescoco apresentam uma alta incidencia no Brasil, permanecendo como uma das neoplasias com menor tempo de sobrevida para o paciente. Os metodos atuais para o diagnostico e tratamento desses tipos de tumores nao tem se mostrado eficazes, o que torna necessarios os avancos no estudo dos padroes genetico-moleculares da doenca. Alteracoes geneticas no braco curto do cromossomo 9 (9p), sugerem que esta regiao possa conter genes supressores tumorais, como os genes CDKN2A, CDKN2B e INFA, envolvidos no inicio e/ou progressao deste tipo de tumor. O envolvimento da regiao 9p foi investigado pela analise de marcadores microssatelites quanto a presenca de perdas de heterozigose (LOH) em 74 pacientes provenientes de Curitiba e Londrina-PR. Nas analises de LOH, foi utilizado DNA de sangue periferico de cada paciente como controle e DNA tumoral obtido de pecas a fresco para a avaliacao das perdas alelicas. As reacoes de PCR foram realizadas utilizando-se iniciadores marcados com agentes fluorescentes HEX (D9S200, D9S1748 e D9S157) e FAM (D9S169, D9S1749 e D9S171). Apos eletroforese em Sequenciador MegaBace 1000, os produtos foram analisados pelo software Fragment Profiler. Os calculos para a obtencao das frequencias de LOH foram realizados na sequencia. Em todos os locos analisados foram encontradas frequencias de LOH elevadas, variando de 21,31% a 51,51%. Dos seis marcadores analisados, dois (D9S157 e D9S200) mostraram frequencias de LOH superiores a 50%. A analise da frequencia de LOH em locos combinados tambem mostrou uma alta taxa de perda alelica, variando de 57,33% (em pelo menos um dos locos) a 8% (em quatro dos seis locos possiveis). Os marcadores microssatelites foram correlacionados a parametros histopatologicos e clinico. Apenas o parametro invasao de linfonodos regionais apresentou um resultado significativo para a analise conjunta dos marcadores (ƒÓ 21=4,121; P

Resumo: O câncer de mama é o segundo tipo de neoplasia mais freqüente em mulheres no mundo, responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade. A interação gene-ambiente contribui de modo distinto para a predisposição ao carcinoma mamário e para o desenvolvimento de um perfil tumoral característico, complexo e heterogêneo. A evolução no aspecto clínico do câncer de mama está associada a uma ascata de eventos que envolvem alterações em genes e/ou proteínas importantes no crescimento, proliferação, apoptose, angiogênese e metástase. A extensão da disseminação de células tumorais em vias linfáticas pode ser avaliada através do status de linfonodos axilares, atualmente utilizado como importante indicador clínico para prognóstico no câncer de mama. Os mecanismos moleculares subjacentes à etástase linfonodal, o grau de divergência clonal e a variedade genômica que caracterizam tumores primários e linfonodos axilares metastáticos, contudo, permanecem mal compreendidos. O objetivo principal este trabalho consiste numa análise proteômica comparativa entre amostras pareadas de tumores primários de mama e linfonodos axilares, utilizando as metodologias proteômicas de eletroforese bidimensional (2D-PAGE) e espectrometria de massa (MALDI-ToF). Sete amostras pareadas de tumores primários de mama e correspondente linfonodo metastático foram avaliadas de pacientes com „Carcinoma Ductal Invasivo.. Os géis bidimensionais revelaram uma sutil diferença entre o perfil proteômico de tumores primários e linfonodos axilares metastático quando comparados em conjunto. Em análise subseqüente, em amostras pareadas dos sete tumores primários e respectivos linfonodos axilares, diferenças qua titativas e qualitativas significativas foram observadas na comparação dos perfis individuais de cada paciente. As diferenças observadas nos dois tipos de análise são devidas provavelmente ao procedimento metodológico. Foram excisadas 163 bandas com valor de p

Resumo: A superfamília do citocromo P450 (P450s) de hemoproteínas é constituída por aproximadamente 500 membros distribuídos entre mais de 70 subfamílias encontradas em eucariotos e procariotos. O gene cyp2d15, ortólogo ao CYP2D6 humano, participa do metabolismo de mais de trinta drogas comercialmente disponíveis além de uma série de xenobióticos ambientais. Várias P450 humanas apresentam expressão polimórfica, principalmente a CYP2D6. Este polimorfismo é primariamente caracterizado por dois fenótipos: indivíduos com a atividade normal da CYP2D6 (metabolizadores rápidos) e indivíduos com diminuição essa atividade (metabolizadores lentos). Os modelos animais são muito utilizados no desenvolvimento pré-clínico de medicamentos a fim de prever o comportamento metabólico de novos compostos em humanos. Apesar dos membros da família do citocromo 450 possuírem seqüências altamente conservadas entre as espécies, ou seja, há relativamente poucas diferenças na seqüência primária de aminoácidos, até mesmo essas pequenas diferenças podem dar origem a mudanças significativas na especificidade do substrato e na atividade catalítica dessas enzimas, podendo levar também à ativação de procarcinógenos e à ormação de metabolitos tóxicos. O presente estudo contém uma revisão bibliográfica sobre o papel do gene do biometabolismo cyp2d15 e dois capítulos: o primeiro com a caracterização do gene em canídeos domésticos de diferentes raças e o segundo com a caracterização do gene em canídeos selvagens cativos sul-americanos. No primeiro capítulo a caracterização do gene cyp2d15 em 21 raças caninas onde oito xons foram analisados, revelou cinco SNPs distribuídos em três dos seis exons selecionados. Um total de 1.269 pb de seqüências codificadoras foram reseqüenciadas rendendo uma freqüência média de um SNP para cada 254 pb (1/254). Um total de quatro nsSNPs, os quais podem estar envolvidos na alteração da função protéica foram detectados. No capítulo II a caracterização do gene cyp2d15 em quatro diferentes espécies de canídeos selvagens cativos sul-americanos (Cerdocyon thous, Lycalopex gymnocercus, Speothos venaticuse Chrysocyon brachyurus), revelou oito SNPs distribuídos nos quatro exons elecionados.Um total de 771 pb de seqüências codificadoras foram reseqüenciadas rendendo uma freqüência média de um SNP para cada 96 pb (1/96). Um nsSNP, que pode estar envolvido na alteração da função protéica foi detectado. Com base nestes resultados, destaca-se a imp rtância de novos estudos que caracterizem os polimorfismos genéticos no gene cyp2d15 em canídeos domésticos e selvagens, devido à ausência destes dados na literatura corrente e da potencial importância em estudos pré-clínicos.

Resumo: O tecido mamário é controlado por um sistema complexo, envolvendo hormônios, que atuam através de seus receptores, e diversos fatores locais. As estruturas anatômicas do tecido mamário podem ser modificadas devido a fatores como a multiparidade, idade, estado pré-menstrual e terapia de reposição hormonal. Portanto, compreender os fatores e mecanismos que regulam as mudanças dependentes de hormônios no tecido mamário é crucial, pois alterações na estrutura da mama e suas funções durante o ciclo menstrual podem predispor este tecido ao desenvolvimento de doenças mamárias, incluindo o câncer. O câncer de mama é o tipo mais comum de câncer em mulheres. É o quinto tipo de câncer em mortalidade no mundo, devido principalmente pela detecção no estágio avançado da doença. A abordagem proteômica é um campo promissor que possui diversas aplicações potenciais, incluindo a identificação de biomarcadores para o diagnóstico, o prognóstico e a terapêutica. O objetivo deste estudo foi a análise proteômica de tecido mamário não tumoral de seis pacientes acometidas pelo câncer de mama, obtendo informações para a caracterização deste tecido e fornecendo dados para a análise comparativa com tecido de carcinomas mamários. A análise dos géis bidimensionais foi realizada no programa ImageMasterTM 2D Platinum v6.0. Setenta bandas foram removidas manualmente, digeridas in gel e submetidas à identificação por PMF na plataforma MASCOT. Esta identificação resultou em 44 proteínas diferentes distribuídas em nove categorias: Citoesqueleto e proteínas associadas (29%); Proteínas com funções de ligação (27%); Enzimas metabólicas (11%); Chaperonas moleculares / proteínas heat shock (7%); Detoxificação e proteínas redox (5%); Proteínas membrana-associadas com múltiplas atividades (5%); Crescimento celular e reguladores de proliferação (5%); Degradação protéica (2%); e Proteínas com outras funções (9%). Algumas destas proteínas têm função no controle da proliferação celular e adesão, podendo atuar na tumorigênese quando sua expressão é alterada. Portanto, a análise comparativa não deve se limitar ao estudo das proteínas expressas isoladamente em um dos tecidos, mas também considerar a variação da sua expressão. Estas informações são importantes para a caracterização do proteoma do tecido mamário não tumoral e posterior análise comparativa com tecido de carcinoma mamário.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João cavalli Coorientadoras: Profa. Dra. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro, Profa. Dra. Luciane Regina Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/09/2011 Bibliografia: fls. 113-137 Área de concentração: Genética Resumo: O câncer de mama é considerado uma das principais doenças potencialmente letais em mulheres. Atualmente, seu prognóstico é baseado em fatores histopatológicos e clínicos, sendo que a identificação de células tumorais nos linfonodos axilares é o fator prognóstico mais eficaz. O linfonodo sentinela (LNS) é o primeiro da linhagem linfática a apresentar células malignas nos cânceres de mama que metastatizam. Sua positividade é um indicativo para o esvaziamento axilar completo. Apesar dos avanços na biópsia do LNS, ainda há um grande número de resultados falso-positivos e falso-negativos. Portanto, a avaliação precisa do LNS, capaz de identificar até o menor foco metastático, é essencial antes da realização do esvaziamento axilar. O objetivo principal deste estudo é identificar a presença de alterações de número de cópias de DNA em diferentes regiões do genoma humano em metástases nos LNS, em comparação com os tumores primários (TP) de mama correspondentes. Amostras pareadas de TP e LNS foram analisadas através dos métodos de CGH (30 pares) e CGH-array (10 pares). Para validação do CGH-array, foram realizados os métodos de FISH (genes BP1 e HER2) e PCR em tempo real para número de cópias de DNA (genes AKT1, AKT2, BP1, FGFR2, HER2, PIK3CA e PTEN). Observamos, por CGH e CGH-array, mais ganhos do que perdas de material genético. Os principais ganhos, observados por CGH foram em 1p, 1q, 6p, 11p, 16, 17, 18q, 19, 20, 21 e 22. As perdas cromossômicas foram observadas principalmente em 1p, 2q, 4q, 6q, 12q, 13q, 18q e Xq. Por CGH-array, as alterações cromossômicas mais freqüentes, incluindo amplificações e deleções, ocorreram em 1q, 8q, 10q, 11q, 14q, 16p, 17q, 20q, 21q e Xq. A análise de FISH validou os resultados de CGH-array em 65% dos casos para o gene BP1 e 55% dos casos para o gene HER2. A validação por PCR em tempo real foi mais concordante para os genes BP1 (70,1%) e HER2 (64,7%), seguida pelos genes AKT2 (41,2%), AKT1 e FGFR2 (29,4% cada), PIK3CA (25,0%), e PTEN (11,8%). CGH e ou CGH-array são métodos muito sensíveis para a avaliação do número de cópias de DNA, podendo auxiliar na identificação de células tumorais no LNS. As alterações observadas, sendo validadas, poderão ser utilizadas como marcadores moleculares para a identificação de pacientes com câncer de mama com alto risco de desenvolvimento de metástases nos linfonodos axilares. Abstract: Breast cancer is considered a major life-threatening disease in women. Currently, the prognosis is based on clinical and histopathological factors; the identification of tumor cells in axillary lymph nodes is the most effective prognostic factor. The sentinel lymph node (SLN) is the first node in the axilla to harbor malignant cells in breast tumors with metastasis, and its positivity is an indication for axillary lymph node dissection. Despite significant advances in the sentinel lymph node biopsy, there are still a significant number of false negatives results, especially in the case of micrometastasis. Therefore the accurate evaluation of the SLN, to identify even the smallest metastatic foci is essential prior to complete axillary lymph node dissection. In this study, we proposed to characterize the tumor cells present at the SLN using CGH (Comparative Genomic Hybridization) and array-CGH, global genomic approaches to identify DNA copy number changes. Paired cases of primary breast tumors (PBT) and SLN metastasis were analyzed using CGH (30 pairs) and array-CGH (10 pairs). Validation of array-CGH was performed by FISH (genes: BP1 and HER2) and Taqman Copy Number Assay (genes AKT1, AKT2, BP1, FGFR2, HER2, PIK3CA and PTEN). CGH analysis revealed gains of chromosomal regions involving, most frequently, 1p, 1q, 6p, 11p, 16, 17, 18q, 19, 20, 21 and 22. Chromosomal losses were mainly observed in 1p, 2q, 4q, 6q, 12q, 13q, 18q and Xq. Array-CGH analysis detected both amplifications and deletions, affecting mostly the chromosome regions 1q, 8q, 10q, 11q, 14q, 16p, 17q, 20q, 21q and Xq regions. Array-CGH end FISH results were concordant for the BP1 gene in 65% of cases and for HER2 in 55%. Concordance between array-CGH results and by Taqman Copy Number Assay was higher for genes BP1 (70,1%) and HER2 (64,7%), followed by genes AKT2 (41,2%), AKT1 and FGFR2 (29,4% each), PIK3CA (25,0%), and PTEN (11,8%). The assessment of copy number changes in the SLN metastasis using genomic profiling is a very sensitive method and can lead to the identification of genomic alterations that can reliably characterize breast tumor cells at the SLN lesions. Once these alterations are validated, they can be used as potential molecular markers to identify breast cancer patients at higher risk of developing axillary lymph node metastasis.

Orientador : Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Profª Drª Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 30/04/2015 Inclui referências Área de concentração Resumo: O câncer é resultante do acúmulo de alterações genéticas e epigenéticas que ocorrem em genes que atuam no controle do ciclo celular desencadeando uma proliferação celular desordenada. O câncer de mama é o segundo mais frequente no mundo e o mais comum entre as mulheres, apresentando alta mortalidade, principalmente devido à detecção tardia da doença. A tumorigênese mamária é um evento extremamente complexo que envolve múltiplos fatores, incluindo hormônios e agentes físicos, químicos e ambientais. Diferentes proteínas podem estar envolvidas no processo, sendo super expressas ou sub-expressas, conduzindo a funções celulares distintas. A metodologia proteômica possui diversas aplicações, entre elas a identificação e validação de biomarcadores, utilizados para uma melhor compreensão, detecção e tratamento do câncer. O objetivo deste trabalho foi analisar seis amostras de carcinomas primários de mama pelo método proteômico, fornecendo dados para análise diferencial com o tecido normal adjacente. A análise dos géis bidimensionais foi realizada no programa ImageMasterTM 2D Platinum v6.0 (GE Healthcare). Oitenta bandas foram removidas manualmente e submetidas à identificação por PMF na plataforma MASCOT (http://www.expasy.org/tools/). Destas, 57 (71,25%) foram identificadas, resultando em 44 proteínas diferentes. Com base na literatura e nos bancos de dados UniProtKB/ Swiss-Prot e NCBI as proteínas foram distribuídas em onze categorias de acordo com suas funções biológicas: citoesqueleto e proteínas associadas (25%), chaperonas moleculares/ proteínas heat shock (14%), proteínas membrana-associadas com múltiplas atividades (4%), biossíntese de proteínas (2%), biossíntese de nucleotídeos (2%), crescimento celular e regulação da proliferação (11%), degradação protéica (5%), detoxificação e proteínas redox (11%), proteínas com função de ligação (16%), enzimas metabólicas (5%) e proteínas com outras funções (5%). Dentre as proteínas identificadas, muitas apresentam funções associadas a mecanismos moleculares envolvidos na tumorigênese do câncer de mama como, regulação da divisão celular, organização do citoesqueleto, detoxificação de carcinógenos, diferenciação, adesão e apoptose. Entretanto para a comprovação desta relação é importante o estudo diferencial da expressão destas proteínas. As informações obtidas neste trabalho são revelantes para a caracterização proteômica de carcinomas primários de mama e posterior análise comparativa com o tecido mamário normal. Palavras-Chave: Câncer de mama. Proteômica. Eletroforese bidimensional. Abstract: Cancer results from the accumulation of genetic and epigenetic changes that occur in genes acting in cell cycle control triggering an uncontrolled cell proliferation. Breast cancer is the second most frequent in the world and the most common among women, presenting high mortality mainly due to the late detection of the disease. The mammary tumorigenesis is an extremely complex event that involves multiple factors, including hormones and physical, chemical and environmental agents. Different proteins may be involved in the process, being overexpressed or under-expressed, leading to distinct cellular functions. The proteomics methodology has several applications, including the identification and validation of biomarkers, used for better understanding, detection and treatment of cancer. The objective of this study was to analyze six samples of primary breast carcinomas by proteomic method, providing data for differential analysis with the adjacent normal tissue. The 2-D gel electrophoresis was analyzed with ImageMasterTM 2D Platinum v6.0 (GE Healthcare). Eighty spots were removed and submitted to identification by Peptide Mass Fingerprinting (PMF) on platform MASCOT (http://www.expasy.org/tools/). 57 spots (71.25%) were identified, resulting in 44 different proteins. Based on the literature and UniProtKB/ Swiss-Prot and NCBI databases, the proteins were divided into eleven categories according to their biological functions: cytoskeleton and associated proteins (25%), molecular chaperones/ heat shock proteins (14%), membrane-associated proteins with multiple activities (4%), protein biosynthesis (2%), nucleotide biosynthesis (2%), cell growth and proliferation regulators (11%), protein degradation (5%), detoxification and redox proteins (11%), proteins with binding function (16%), metabolic enzymes (5%) and proteins with other functions (5%). Among the identified proteins, many have functions associated with molecular mechanisms involved in tumorigenesis of breast cancer as regulation of cell division, cytoskeletal organization, detoxification of carcinogens, differentiation, adhesion, and apoptosis. But to prove this relationship is important to study the differential expression of these proteins. The information obtained in this study is relevant to the proteomic characterization of primary breast carcinomas and subsequent comparative analysis with the normal breast tissue. Keywords: Breast cancer. Proteomics. 2-D gel electrophoresis.

Orientador: Prof. Dr. Jorge E. F. Matias Co-orientadora: Profa. Dra. Enilze M.S.F. Ribeiro Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Clínica Cirúrgica. Defesa: Curitiba, 18/12/2009 Inclui bibliografia

Orientador: Iglenir Joăo Cavalli Co-orientadora: Enilze M.S.F.Ribeiro Inclui apęndice Inclui bibliografia e anexos

Orientadora: Enilze M.S.F.Ribeiro Co-orientadora: Ilce Mara de Syllos Cólus Inclui apêndice Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia e anexos Área de concentração: Genética

Orientadora : Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Co-orientador : Iglenir João Cavalli Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia

Orientador : Iglenir João Cavalli Co-orientadores : Enilze M.S.F. Ribeiro e Luciane Regina Cavalli Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia

Orientador : Iglenir João Cavalli Co-orientadora : Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Inclui apêndices Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Genética. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia

Orientadora : Enilze Maria de Souza F. Ribeiro Co-orientador: Iglenir Joăo Cavalli Dissertaçăo (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Cięncias Biológicas, Programa de Pós-Graduaçăo em Genética. Defesa: Curitiba, 2005 Inclui bibliografia e anexos

Orientador: Prof. Dr. Iglenir João Cavalli Coorientadora: Profª. Drª. Enilze Maria de Souza Fonseca Ribeiro Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Curso de Pós-Graduação em Genética Inclui referências: p. 82-100 Resumo: Com o principal objetivo de contribuir para o conhecimento citogenético das lesões benignas e malignas da mama humana, foram analisadas citogeneticamente amostras de cinco lesões benignas da mama e cinco carcinomas mamários. As amostras de tecidos de lesões mamárias foram coletadas no Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná e no Hospital Nossa Senhora das Graças (Curitiba, PR) e foram processadas no laboratório de Citogenética Humana do Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná, utilizando-se a técnica de desagregação enzimática pela colagenase, seguida de cultura celular a curto prazo. Nas cinco lesões benignas mamárias foram analisadas 111 metáfases com bandeamento GTG (x=22,2±3,1), das quais 31 (27,9%) apresentaram cariótipos normais e 80 (72,1%) possuíam aberrações cromossômicas. Destas, 67 (83,7%) eram clonais e 13 (16,3%) não clonais. Das 333 aberrações clonais observadas (excluindo-se os cromossomos marcadores), as numéricas (331) foram mais freqüentes do que as estruturais (2), e entre as numéricas as trissomias (280) foram mais comuns que as monossomias (51). As aberrações clonais foram observadas mais freqüentemente nos cromossomos 21 (11,1%), 16 (8,4%), 19 (8,1%), 17 (7,5%), 20 (7,2%) e 18 (6,9%). Nos cinco carcinomas mamários foram analisadas 126 metáfases com bandeamento GTG (x=25,2±17,4), das quais 26 (20,6%) apresentaram cariótipos normais e 100 (79,4%) possuíam aberrações cromossômicas. Destas, 84 (84%) eram clonais e 16 (16%) não clonais. Das 136 aberrações clonais, as numéricas (106) foram muito mais freqüentes do que as estruturais (30) e entre as numéricas as trissomias (78) foram mais comuns que as monossomias (28). Os cromossomos mais freqüentemente envolvidos nas aberrações clonais foram: 21 (16,2%), X (15,4%), 8, 11 (9,6%) e 17 (8,8%). Comparando as aberrações cromossômicas clonais observadas nas lesões benignas e nos tumores malignos mamários, nas primeiras constatou-se em média 74,6±125,8 aberrações por lesão e nos últimos, uma média igual a 27,2±22,7 aberrações por tumor. Verificou-se também que as aberrações clonais numéricas e estruturais não se distribuem igualmente nos dois tipos de lesões (X²1=69,9; p