Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan interaksi terbaik antara jenis kapang dengan lama fermentasi pucuk tebu berdasarkan parameter kandungan lignin, kecernaan BK, BO, PK, NDF, ADF, selulosa dan hemiselulosa serta karakteristik cairan rumen (pH, VFA, dan NH3) terbaik secara In-vitro. Penelitian ini terbagi menjadi 2 tahap. Penelitian tahap pertama merupakan fermentasi pucuk tebu dengan perlakuan sebagai berikut: A1B1= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Pleurotus ostreatus selama 14 hari, A1B2= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Pleurotus ostreatus selama 21 hari, A1B3= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Pleurotus ostreatus selama 28 hari, A2B1= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Aspergillus oryzae selama 14 hari, A2B2= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Aspergillus oryzae selama 21 hari, A2B3= Pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Aspergillus oryzae selama 28 hari. Rancangan yang digunakan dalam tahap pertama ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 2x3, dimana faktor A adalah jenis kapang (Pleurotus ostreatus dan Aspergillus oryzae) dan faktor B adalah lama fermentasi (14,21, dan 28 hari). Pada penelitian tahap kedua diambil masing-masing 2 hasil yang terbaik untuk setiap jenis kapang sehingga dihasilkan 4 perkuan terbaik yaitu: A= Pucuk tebu yang difermentasi dengan Pleorotus ostreatus selama 21 hari, B= Pucuk tebu yang difermentasi dengan Pleorotus ostreatus selama 28 hari, C= Pucuk tebu yang difermentasi dengan Aspergillus oryzae selama 21 hari, D= Pucuk tebu yang difermentasi dengan Aspergillus oryzae selama 28 hari. Kecernaan fraksi serat dan karakteristik cairan rumen diukur dengan metoda In-vitro pada lama fermentasi 48. Rancangan yang digunakan pada tahap 2 adalah Rancangan Acak Kelompok (RAK) dengan 4 perlakuan dan 3 kelompok sebagai ulangan. Hasil penelitian tahap 1 menunjukkan bahwa tidak terdapat pengaruh interaksi antara jenis kapang dan lama fermentasi terhadap kandungan lignin (P>0,05), tetapi terdapat interaksi terhadap aktivitas enzim laccase, LiP, dan MnP (P0,05). Disimpulkan bahwa pucuk tebu yang difermentasi dengan kapang Pleurotus ostreatus selama 28 hari menghasilkan kecernaan PK (57,90%), kecernaan Selulosa (50,25%), kecernaan Hemiselulosa (62,65%), aktivitas enzim Laccase (2,68 U/ml), aktivitas enzim LiP (19,44 U/ml), aktivitas enzim MnP (3,74 U/ml), VFA (111,67 mM), dan NH3 (10,48 mg/100ml) yang terbaik dibandingkan dengan perlakuan lainnya.