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MicroRNAs, or miRNAs, are endogenously encoded small RNAs that play a key role in diverse plant biological processes. Jatropha curcas L. has received significant attention as a potential oilseed crop for the production of renewable oil. Here, a sRNA library of mature seeds and three mRNA libraries from three different seed development stages were generated by deep sequencing to identify and characterize the miRNAs and pre-miRNAs of J. curcas. Computational analysis was used for the identification of 180 conserved miRNAs and 41 precursors (pre-miRNAs) as well as 16 novel pre-miRNAs. The predicted miRNA target genes are involved in a broad range of physiological functions, including cellular structure, nuclear function, translation, transport, hormone synthesis, defense, and lipid metabolism. Some pre-miRNA and miRNA targets vary in abundance between the three stages of seed development. A search for sequences that produce siRNA was performed, and the results indicated that J. curcas siRNAs play a role in nuclear functions, transport, catalytic processes and disease resistance. This study presents the first large scale identification of J. curcas miRNAs and their targets in mature seeds based on deep sequencing, and it contributes to a functional understanding of these miRNAs.

When plants are exposed to stressful environmental conditions, the production of Reactive Oxygen Species (ROS) increases and can cause significant damage to the cells. Antioxidant defenses, which can detoxify ROS, are present in plants. A major hydrogen peroxide detoxifying system in plant cells is the ascorbate-glutathione cycle, in which, ascorbate peroxidase (APX) enzymes play a key role catalyzing the conversion of H2O2 into H2O, using ascorbate as a specific electron donor. Different APX isoforms are present in distinct subcellular compartments, such as chloroplasts, mitochondria, peroxisome, and cytosol. The expression ofAPX genes is regulated in response to biotic and abiotic stresses as well as during plant development. The APX responses are directly involved in the protection of plant cells against adverse environmental conditions. Furthermore, mutant plants APX genes showed alterations in growth, physiology and antioxidant metabolism revealing those enzymes involvement in the normal plant development.

MicroRNAs (miRNAs) are important post-transcriptional regulators of plant development and seed formation. In Brassica napus, an important edible oil crop, valuable lipids are synthesized and stored in specific seed tissues during embryogenesis. The miRNA transcriptome of B. napus is currently poorly characterized, especially at different seed developmental stages. This work aims to describe the miRNAome of developing seeds of B. napus by identifying plantconserved and novel miRNAs and comparing miRNA abundance in mature versus developing seeds. Members of 59 miRNA families were detected through a computational analysis of a large number of reads obtained from deep sequencing two small RNA and two RNA-seq libraries of (i) pooled immature developing stages and (ii) mature B. napus seeds. Among these miRNA families, 17 families are currently known to exist in B. napus; additionally 29 families not reported in B. napus but conserved in other plant species were identified by alignment with known plant mature miRNAs. Assembled mRNA-seq contigs allowed for a search of putative new precursors and led to the identification of 13 novel miRNA families. Analysis of miRNA population between libraries reveals that several miRNAs and isomiRNAs have different abundance in developing stages compared to mature seeds. The predicted miRNA target genes encode a broad range of proteins related to seed development and energy storage. This work presents a comparative study of the miRNA transcriptome of mature and developing B. napus seeds and provides a basis for future research on individual miRNAs and their functions in embryogenesis, seed maturation and lipid accumulation in B. napus.

Plants respond to temperature stress by synthesizing a set of heat shock proteins (HSPs), which may be responsible for the acquisition of thermotolerance. In this study, the induction of small HSPs (sHSPs) in eight common bean varieties was evaluated by Northern blot analysis using the W HSP 16.9 cDNA as heterologous probe. Cowpea was used, as a positive control since this plant, as opposed to common bean, is known to grow well under high temperature regimes such as that found in the Brazilian semi-arid region. After the growth period, the plants were submitted to two h of heat shock at 40 ºC. All varieties tested were able to induce sHSP mRNAs that hybridized with W HSP 16.9 probe. However, significant kinetic differences were found when comparing different varieties. SHSP mRNA levels induced after heat shock in cowpea was higher than the levels observed on the bean varieties displaying the highest expression of these proteins. Besides, the sHSP expression was also assessed at the protein accumulation level by Western-blot analysis for cowpea and both IPA 7 and Negro Argel varieties of bean plants. The revealed protein pattern confirmed that sHSPs are differentially expressed in distinct varieties of common bean according their heat stress tolerance. As plantas respondem ao estresse provocado por temperaturas elevadas através da síntese de um grupo de proteínas denominadas proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins-HSPs) que estão associadas com a obtenção de termotolerância. Nesse estudo, foi avaliada a indução de proteínas de choque térmico de baixo peso molecular (sHSPs) em oito cultivares de feijoeiro através de "Northern blot" utilizando o cDNA da W HSP 16,9 como uma sonda heteróloga. Caupi foi utilizado como controle, uma vez que, ao contrário do feijoeiro, é uma espécie que se apresenta bem adaptada às condições de temperaturas elevadas como as observadas no Semi-árido brasileiro. Após um período de crescimento, as plantas foram submetidas a um período de duas horas de choque térmico a 40 ºC. Todas as variedades avaliadas foram capazes de induzir mRNAs para sHSP que hibridizou com a sonda W HSP 16,9. Entretanto, foi observada uma diferença significativa no padrão de indução entre as diferentes variedades. Os níveis de mRNA e sHSPs induzidos em caupi após o choque térmico foram bem maiores que os observados para as variedades de feijoeiro. Além disso, a expressão de sHSPs foi também avaliada em relação ao acúmulo de proteínas através da análise de "Western-blot" para caupi e as variedades de feijoeiro IPA 7 e Negro Argel. O padrão de proteínas observado confirma que as sHSPs são diferencialmente expressas em diferentes variedades de feijoeiro de acordo com a tolerância ao estresse térmico.

O arroz (Oryza sativa L.) é uma das principais culturas alimentares do mundo, alimento básico para cerca de três bilhões de pessoas. Apesar de sua importância como fonte de carboidratos, o arroz branco possui baixas concentrações de nutrientes essenciais, dentre eles os micronutrientes ferro (Fe) e zinco (Zn), essenciais à saúde humana. Devido às mudanças climáticas, a temperatura pode aumentar 2,5 °C até 2050. Nesse cenário, eventos como ondas de calor seriam mais frequentes e de maior duração. O estresse por alta temperatura pode causar danos significativos às plantas com subsequente perda de rendimento e produtividade. O arroz é especialmente suscetível ao calor durante seu desenvolvimento e fertilização. O gênero Oryza inclui 27 espécies, dentre as quais duas espécies cultivadas, sendo distribuídas e adaptadas a diferentes ambientes ao redor do planeta, o que as torna uma fonte potencial de alelos e de novos mecanismos que podem contribuir para o melhoramento de características nutricionais e adaptabilidade a estresses bióticos e abióticos em Oryza sativa. Oryza australiensis é uma planta perene, amplamente distribuída ao norte de Queensland (Austrália), e a única representante do genoma EE no gênero Oryza. Em trabalhos já publicados, foi demonstrado que a espécie possui uma rubisco ativase (Rca) termotolerante que mantém suas variáveis fotossintéticas e de crescimento ativos quando exposta à altas temperaturas. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar a termotolerância de nove acessos de O. australiensis e identificar novos mecanismos envolvidos na termotolerância dessa espécie. Adicionalmente, avaliamos a concentração de macro e micronutrientes em folhas e sementes desses acessos. Em experimentos de estresse por calor o acesso AUS1 apresentou indução de crescimento de parte aérea e variáveis de fotossíntese comparáveis ao tratamento controle, ao contrário do que foi observado para O. meridionalis e O. sativa. Esse mesmo acesso teve aumento significativo apenas para Fe e Zn no grão, dos 14 elementos analisados, quando comparado com genótipos de O. sativa. Por fim, montamos o experimento de estresse por calor com plantas do acesso AUS1 e Oryza sativa cv. Nippombare e coletamos amostras de folha para análise de transcriptoma. As extrações de RNA já foram realizadas e as amostras serão enviadas para sequenciamento o mais breve possível. Com o transcriptoma, acreditamos que novos genes e mecanismos serão encontrados na resposta de tolerância ao calor de O. australiensis. Rice (Oryza sativa L.) is one of the main food crops in the world, a staple food for about three billion people. Despite its importance as a source of carbohydrates, white rice has low concentrations of essential nutrients, including the micronutrients iron (Fe) and zinc (Zn), essential to human health. Due to climate change, the temperature may rise by 2.5 °C by 2050. In this scenario, events such as heat waves would be more frequent and of longer duration. High temperature stress can cause significant damage to plants with subsequent loss of yield and productivity. Rice is especially susceptible to heat during development and fertilization. The Oryza genus includes 27 species, in addition to two cultivated species, being distributed and adapted to different environments around the planet, which makes them a potential source of alleles and new mechanisms that can contribute to the improvement of nutritional characteristics and adaptability to biotic and abiotic stresses in Oryza sativa. Oryza australiensis is a perennial plant, widely distributed in northern Queensland (Australia), and the only representative of the EE genome in the Oryza genus. In works already published, it was demonstrated that the species has a thermotolerant rubisco activase (Rca) that keeps the photosynthetic and growth parameters active when exposed to high temperatures. Thus, the present study aimed to evaluate the thermotolerance of nine accessions of O. australiensis and to identify new mechanisms involved in the thermotolerance of this species. Additionally, we evaluated the concentration of macro and micronutrients in leaves and seeds of these accessions. In heat stress experiments, the AUS1 access showed shoot growth induction and photosynthesis parameters comparable to the control situation, contrary to what was observed for O. meridionalis and O. sativa. This same access had a significant increase only for Fe and Zn in the grain, of the 14 elements analyzed, when compared with O. sativa genotypes. Finally, we set up the heat stress experiment with plants from the AUS1 and Oryza sativa cv. Nippombare and collected leaf samples for transcriptome analysis. The RNA extractions have already been carried out and the samples will be sent for sequencing as soon as possible. With the transcriptome, we believe that new genes and mechanisms will be found in the heat tolerance response of O. australiensis.

O ferro é um micronutriente essencial para saúde humana e desenvolvimento vegetal por estar envolvido em diversos processos metabólicos, como transporte de oxigênio, síntese de DNA e transporte de elétrons. No Brasil, o estado do Rio Grande do Sul é o maior produtor de arroz do país e possui caracteristicamente solos ácidos ricos em ferro. Mesmo com a alta disponibilidade de ferro para as plantas, os grãos de arroz acumulam muito pouco deste mineral. Os mecanismos envolvidos no transporte de ferro para as sementes, visando a biofortificação de grãos de arroz, ainda são pouco conhecidos. Os transportadores vacuolares de ferro OsVIT1 e OsVIT2 são altamente expressos em folhas bandeira, nós e camada de aleurona, regulando o transporte de ferro e zinco através do tonoplasto para o vacúolo, aprisionando os metais nesses tecidos. Mutantes perda de função para cada gene acumularam mais ferro nas sementes de arroz, tornando-os bons alvos para biofortificação. Para elucidar a participação de OsVIT1 e OsVIT2 na translocação de ferro, dois mutantes perda-de-função osvit1/2.1 e osvit1/2.2 foram gerados utilizando CRISPR/Cas9. Os mutantes osvit1/2 não apresentaram alterações significativas no desenvolvimento vegetativo e reprodutivo, assim como nenhuma redução na produtividade de sementes foi observada em condições controle. Entretanto, a presença dos genes VIT é relevante para produção de sementes em situações de deficiência de ferro, assim como para a homeostase de Mg2+ e Cu2+ na base da parte aérea. Ambos os mutantes osvit1/2 apresentaram maior acúmulo de ferro nos embriões de sementes, entretanto a quantificação desse aumento deve ser realizada em breve. Investigações sobre o processo de translocação de Fe das raízes e folhas bandeira para as sementes também estão em curso, visando um melhor entendimento desse processo para geração de arroz biofortificado. Iron is an essential nutrient for human health and plant development because is involved in a wide variety of metabolic processes, including oxygen transport, DNA synthesis and electron transport. In Brazil, the state of Rio Grande do Sul is the major producer of rice in the country and have characteristically iron-rich acid soils. Even with the high iron availability to the plants, rice seeds accumulate low amounts of this mineral. The mechanisms that lead to iron transport to seeds allowing rice grain biofortification are still poorly understood. The rice vacuolar iron transporter genes OsVIT1 and OsVIT2 are expressed in the flag leaves, nodes and aleurone layer, regulating the transport of iron and zinc through the tonoplast to the vacuole, imprisoning those metals in these tissues. Loss-of-function mutants for each gene presented higher accumulation of iron on the seed, making them good targets for rice biofortification. To investigate the role of OsVIT1 and OsVIT2 on Fe translocation, we used CRISPR/Cas9 to generate two independent double knockout mutants, osvit1/2.1 and osvit1/2.2. No significative alterations were observed during osvit1/2 vegetative and reproductive developments, nether concerning seed production under control conditions. Although, VITs seem to be important for seed production under low Fe treatments, as well as for Mg2+ and Cu2+ homeostasis at the shoot basal region. Both osvit1/2 mutants displayed higher Fe deposition on seed’s embryos, although the enhancement needs to be yet quantified. Further investigations regarding the Fe translocation through the roots and flag leaves to the seeds are ongoing, aiming for a better understanding of this process to facilitate the development of biofortified rice.

Novas fontes de combustíveis e produtos não baseados no óleo de petróleo são necessárias na sociedade moderna. Uma das alternativas é o óleo derivado de plantas. Os triglicerídeos (TAGs), componentes dos óleos vegetais, são os principais lipídeos de estoque em plantas. O entendimento de como os triglicerídeos são formados é importante para o desenvolvimento de estratégias visando melhorar o conteúdo e a composição de óleos nutricionais e industriais. As diacilglicerol aciltransferases (DGATs) são as enzimas chave para biossíntese de TAGs e catalisam a condensação do diacilglicerol (DAG) e dos ácidos graxos à formação de triglicerídeos. Diversos tipos de genes DGAT já foram identificados em plantas. DGAT1 e DGAT2 são enzimas ligadas a membranas já bem caracterizadas, mas pouco é sabido sobre a isoforma DGAT3 solúvel na maioria de espécies de plantas. O objetivo deste estudo foi caracterizar as duas isoformas de DGAT3 (GmDGAT3A e GmDGAT3B) de soja (Glycine max), a principal fonte de óleo vegetal do Brasil, e de mamona (Ricinus communis, RcDGAT3), oleaginosa que possui altos níveis de ácido ricinoleico em sua semente. Plantas de Arabidopsis thaliana expressando de forma heteróloga a RcDGAT3 de mamona não apresentaram diferença no perfil de ácidos graxos em suas sementes. Leveduras mutantes para a biossíntese de TAGs foram incapazes de recuperar o fenótipo mutante quando expressam GmDGAT3A, GmDGAT3B, ou RcDGAT3. A suplementação dessas leveduras com ácido linoleico, ou ácido linolênico não resultou na síntese de triglicerídeos, indicando que GmDGAT3A e GmDGAT3B necessitam de um conjunto diferente de substratos não encontrados nas células de leveduras. Folhas de Nicotiana benthamiana expressando fusões traducionais de GmDGAT3A, GmDGAT3B, ou RcDGAT3 com proteínas fluorescentes, mostraram que GmDGAT3B é parcialmente co-localizada com o retículo endoplasmático, enquanto GmDGAT3A é concentrada em pequenos pontos citosólicos, e simultaneamente espalhada pela célula. A expressão heteróloga de RcDGAT3-CFP tanto em folhas de N. benthamiana, quanto em folhas de Arabidopsis mostrou uma localização similar a GmDGAT3A-GFP, ou seja, as proteínas estavam localizadas em pontos no citosol das células vegetais. O principal papel da DGAT3 nessas oleaginosas ainda não é claro, mas é provável que estas enzimas tenham propriedades bioquímicas diferentes dos ortólogos já descritos. New fuel sources and non-petroleum oil based products are needed in modern society. One of the alternatives is the oil derived from plants. Triacylglycerides (TAGs) are main components of vegetal oil and constitute the major stock of lipids in plants. The understanding of how triacylglycerides are produced is important for the development of strategies aiming to improve the content and composition of nutritional and industrial oils. Diacylglycerol Acyltransferases (DGATs) are the key enzymes for TAG biosynthesis as they catalyze the condensation of diacylglycerol (DAG) to fatty acids for triacylglycerides formation. Several types of DGAT have been identified in plants. DGAT1 and DGAT2 are well characterized membrane-bound enzymes, but little is known about the soluble DGAT3 isoform in most plant species. The aim of this study was to characterize the two DGAT3 isoforms (GmDGAT3A and GmDGAT3B) of soybean (Glycine max), the main plant oil source in Brazil, and the castor bean DGAT3 isoform (Ricinus communis, RcDGAT3), oleaginous plant that contains high levels of ricinoleic acid in its seeds. Arabidopsis thaliana plants heterologously expressing RcDGAT3 from castor bean did not display differences in their seed fatty acid profiles. Mutant yeast for TAG biosynthesis was unable to recover the mutant phenotype when GmDGAT3A, GmDGAT3B, or RcDGAT3 are expressed. Even with supplementation of linoleic acid, or linolenic acid, triacylglyceride synthesis did not take place, indicating that GmDGAT3A and GmDGAT3B need different substrates not found in yeast cells. Nicotiana benthamiana leaves expressing translational fusions of GmDGAT3A, GmDGAT3B, or RcDGAT3 with fluorescent proteins, showed that GmDGAT3B is partially co-localized with the endoplasmic reticulum, whereas GmDGAT3A is either concentrated in small cytosolic spots or widespread in the cell. The heterologous expression of RcDGAT3-CFP either in N. benthamiana leaves or in Arabidopsis leaves showed similar localization to GmDGAT3A-GFP, in which the proteins are localized in cytosolic spots in plant cells. The DGAT3 main role in these oleaginous plants is still unclear, but it is likely that these enzymes display different biochemical properties from the previously described orthologues.

O arroz (Oryza sativa) é uma das espécies mais importantes do mundo e um excelente modelo para entender a interação entre genes e as mudanças ambientais. Entretanto, sua produtividade é comumente desafiada por muitos estresses, como os abióticos e oxidativos. As glutationa peroxidases (GPXs) fazem parte do mecanismo pelo qual as plantas lidam com o estresse oxidativo. GPXs podem controlar a equilíbrio redox atuando também na sinalização celular. Neste trabalho investigou-se o papel do gene GPX3 de arroz em resposta ao estresse salino, usando plantas RNAi com o gene OsGPX3 silenciado (GPX3s). Os resultados indicam que essas plantas são mais sensíveis à salinidade, mostrando menor biomassa, assimilação de CO2, condutância estomática e pressão parcial intercelular de CO2. Plantas GPX3s também apresentaram significantes danos na atividade do fotossistema II e declínio no conteúdo de clorofila. O estresse salino induziu acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ERO) em ambas plantas, NT (não transformadas) e GPX3s, indicando que a sensibilidade das plantas GPX3s ao sal não é devida à uma significante deficiência no equilíbrio redox. Para elucidar as rotas reguladas por OsGPX3, utilizou-se a técnica de proteômica livre de marcação, comparando plantas NT e GPX3s. Plantas GPX3s apresentaram alterações na abundância de proteínas relacionadas com resposta ao ABA e processos epigenéticos. RT-qPCR e coloração usando linhagens repórter mostraram que o gene OsGPX3 é induzido pelo tratamento com ácido abscísico (ABA), sugerindo que esse gene pode desempenhar um importante papel na via de sinalização do ABA. A aplicação exógena de ABA não inibiu a germinação das sementes, tampouco induziu acumulação de ERO e o fechamento estomático em GPX3s. Ademais, GPX3s e NT apresentaram fenótipo similar ao de plantas submetidas ao estresse de seca. Entretanto, GPX3s foram mais sensíveis à indução da senescência no escuro promovida por ABA. Esse trabalho fornece importantes informações sobre a interrelação entre cloroplastos e mitocôndrias, mostrando a importância da proteína GPX3 na aquisição da tolerância à salinidade em arroz via mecanismos independente da acumulação de ERO. Além disso, é um estudo pioneiro demonstrando o papel do OsGPX3 na sinalização do ABA, corroborando com o fato de enzimas antioxidantes agirem em diferentes e complexas vias nas células. Rice is one of the world’s most important crops and an excellent model system for understanding the interaction between genes and environmental changes. However, its productivity is often challenged by stresses, as abiotic and oxidative. Glutathione peroxidases (GPXs) are part of the mechanism by which plants cope with oxidative stress. GPXs can control redox homeostasis and also play a role in redox signaling. Here, we investigated the rice GPX3 role in plant responses to salt stress using OsGPX3-RNAi silenced rice plants (GPX3s). Results indicate that GPX3s plants are more sensitive to salinity showing decreased biomass, CO2 assimilation rate, stomatal conductance, and intercellular CO2 partial pressure. These plants also present significant damage to photosystem II activity and decline in chlorophyll content. Salt stress induced ROS accumulation in both non-transformed (NT) and GPX3s plants, indicating that GPX3s sensibility to salt stress was not due to the significant impairment in redox equilibrium. To elucidate the routes regulated by OsGPX3 we performed a proteomic approach comparing NT and GPX3s. The GPX3s plants presented altered the abundance of proteins involved in abscisic acid (ABA) response and epigenetic processes. RT-qPCR and GUS-staining using reporter gene lines to GPX3 promoter showed that OsGPX3 is induced by ABA treatment, suggesting that this gene could be important in ABA pathway. The analysis of ABA-related responses showed that ABA is unable to inhibit seed germination, ROS accumulation and stomata closure in GPX3s plants. GPX3s and NT plants presented similar phenotype under drought stress. However, GPX3s were more sensitive to dark-induced senescence after ABA treatment compared with NT plants. Together, this work provides new light into the cross-talk between chloroplasts and mitochondria, showing GPX3 protein importance in rice to achieve salt stress tolerance via an ROS-accumulation independent mechanism, not acting as the major ROS-scavenger enzyme. Moreover, it also suggests a novel role to this enzyme beyond its role as ROS-scavenger, as a signaling compound. This is a pioneer study demonstrating that OsGPX3 play a role in ABA signaling and corroborate that redox homeostasis enzymes can act in different and complex pathways in plants cells.

A morte celular programada (do inglês, Programmed Cell Death) é um processo geneticamente controlado que provoca o suicídio celular em organismos eucarióticos e procarióticos. A PCD ocorre em plantas durante seu desenvolvimento e quando expostas a diferentes condições de estresses caracterizados por estresses abióticos e bióticos. Diversos estudos foram realizados para entender os mecanismos relacionados à PCD em plantas, utilizando principalmente Arabidopsis thaliana. Recentemente, uma rede chamada "deathosome LSD1" foi sugerida em Arabidopsis e mostra as interações entre os reguladores de morte celular conhecidos, como o LSD1 (Lesion Simulating Disease 1), um gene central nessa rede, e seus parceiros de interação. O gene At1g52200 que codifica uma proteína do motivo PLAC8 (placent specific 8) foi descrito como componente dessa rede, mas sua função não foi estudada até o momento. O objetivo geral deste trabalho é estudar AtPLAC8-11.1 e verificar a existência do transcrito alternativo AtPLAC8-11.2 previsto in silico. Para isso, os insertos amplificados a partir de cDNA de A. thaliana, AtPLAC8-11.1 e AtPLAC8-11.2 foram clonados no vector de entrada pENTR/D-TOPO, e o AtPLAC8-11.1 foi subclonado em vetores binários de destino. Plantas transgênicas de Arabidopsis superexpressando AtPLAC8-11.1 foram geradas via floral dipping. Além disso, via banco de sementes Arabidopsis Stock Center (ABRC), linhagens mutantes knockdown e knockout para AtPLAC8-11.1, com inserção de T-DNA no promotor e primeiro éxon do gene, respectivamente foram adquiridas e genotipadas. As plantas knockout plac8-11.1 apresentaram maior comprimento de raiz, quando comparado ao tipo selvagem, indicando um possível papel deste gene no desenvolvimento radicular. Nossos resultados mostraram a existência de AtPLAC8-11.2, no entanto, o nível de transcritos é baixo na parte aérea de Arabidopsis, quando comparado ao AtPLAC8-11.1. Estudos preliminares indicam a localização subcelular de AtPLAC8-11.1 na membrana plasmática e eventual reciclagem por vesículas secretoras. Dificuldades na fase de seleção de plantas de Arabidopsis transformadas contendo a construção para super-expressão de AtPLAC8-11.1 indicam a possibilidade de que altos níveis transcricionais de AtPLAC8-11.1 possam ser prejudiciais à planta, especialmente em condições de estresse. Estes resultados indicam o envolvimento de AtPLAC8-11.1 no processo de PCD em Arabidopsis. Programmed Cell Death (PCD) is a genetically controlled process triggering cellular suicide in both eukaryotic and prokaryotic organisms. PCD occurs in plants during their development and when exposed to different stress conditions characterized by abiotic and biotic stresses. Several studies were performed to understand the mechanisms related to PCD in plants, mainly using Arabidopsis thaliana. Recently, a network called deathosome LSD1 has been suggested in Arabidopsis and it shows the interactions between known cell death regulators such as LSD1 (Lesion Simulating Disease 1), a central gene in this network, and their interaction partners. The At1g52200 gene encoding a PLAC8 (placent specific 8) motif was described as a component of this network, but its function has not yet been characterized. The general objective of this work is to study AtPLAC8-11.1 and verify the existence of the alternative transcript AtPLAC8-11.2 predicted in silico. For this, the inserts amplified from A. thaliana cDNA, AtPLAC8-11.1 and AtPLAC8-11.2, were cloned into the pENTR/D-TOPO entry vector, and AtPLAC8-11.1 was subcloned into binary destination vectors. Arabidopsis transgenic plants overexpressing AtPLAC8-11.1 were generated via floral dipping. In addition, via the Arabidopsis Stock Center (ABRC) seed bank, mutant knockdown and knockout for AtPLAC8-11.1, with insertion of T-DNA into the promoter and the first exon of the gene, were respectively acquired and genotyped. The plac8-11.1 knockout plants presented increased root lenght, when compared to wild type, indicating a possible role of this gene in root development. Our results showed the existence of AtPLAC8-11.2, however, the level of transcripts are low in Arabidopsis shoots, when compared to AtPLAC8-11.1. Preliminary studies indicate the subcellular localization of AtPLAC8-11.1 in the plasma membrane and with possible recycling by secretory vesicles. Difficulties in the selection phase of transformed Arabidopsis plants containing the construct for overexpression of AtPLAC8-11.1 indicate the possibility that high transcriptional levels of AtPLAC8-11.1 may be detrimental to the plant, especially under stress conditions. These results indicate the involvement of AtPLAC8-11.1 in the PCD process in Arabidopsis.

O arroz (Oryza sativa L.) é extremamente versátil, é planta modelo das monocotiledôneas, seu grão é base alimentar de milhões de pessoas ao redor do mundo, e é amplamente cultivado, agregando valor econômico e social à cultura. As proteínas do tipo bHLH (basic helix-loop-helix) são membros de uma das maiores famílias de fatores de transcrição em plantas e participam da regulação de uma grande variedade de processos. Para entender a função de um membro desta família, foi realizado um ensaio de mono-híbrido em levedura, que permitiu identificar três membros da família GRF (Growth Regulating Factor), OsGRF3, OsGRF4 e OsGRF11, como reguladores transcricionais do gene OsbHLH35. A fim de fornecer informações adicionais sobre a função de OsbHLH35 e para confirmar a regulação de OsGRF11 sobre OsbHLH35 in vivo, plantas de arroz superexpressando os genes separadamente foram previamente obtidas através de transformação de calos embriogênicos de arroz via Agrobacterium tumefaciens. Quatro linhagens de OsbHLH35 e sete de OsGRF11 foram obtidas e analisadas molecularmente através da análise da expressão relativa dos genes OsbHLH35 e OsGRF11 que confirmou a superexpressão dos genes de interesse. A análise fenotípica das plantas superexpressando OsbHLH35 mostrou que essas plantas produziam significativamente menor número de sementes que as plantas não transformadas, além de apresentarem fenótipo de pálea e lema abertas, flores não fecundadas e poucas sementes maduras. Ao realizar uma análise detalhada da flor, foram observadas anteras com aspecto curvo. Para abordar em quais tecidos OsbHLH35 é expresso, um estudo do promotor foi realizado em plantas de arroz expressando o gene repórter da β-glucuronidase sob o controle do promotor de OsbHLH35. Através dessa abordagem observou-se a expressão de OsbHLH35 na antera, nos primórdios florais, na pálea e lema, e no ovário. A análise da expressão relativa de OsGRF11 e OsbHLH35 ao longo do desenvolvimento da panícula em plantas do tipo selvagem mostrou que OsGRF11 é altamente expresso em todos os estágios de desenvolvimento analisados, enquanto a expressão de OsbHLH35 é baixa nas mesmas condições. Entender como OsbHLH35 está envolvida no desenvolvimento da antera, quais são os genes regulados por esse fator de transcrição, e como é sua relação com outras bHLHs permitirá elucidar onde este gene está inserido no processo de desenvolvimento floral de arroz. Rice (Oryza sativa L.) is not only a monocotyledonous model plant, but also a food base for millions of people, and is widely cultivated having social and economic importance. Basic helix-loop-helix (bHLH) proteins are members of one of the largest families of transcription factors in plants and participate in the regulation of a wide variety of processes. To understand the role of one member of this family, a yeast monohybrid assay was performed which identified three members of the Growth Regulating Factor (GRF) family, OsGRF3, OsGRF4 and OsGRF11, as transcriptional regulators of the OsbHLH35 gene. In order to provide additional information on OsbHLH35 function and to confirm the regulation of OsGRF11 on OsbHLH35 in vivo, rice plants overexpressing the genes separately were obtained previously by transformation of embryogenic rice calli via Agrobacterium tumefaciens. Four lines of OsbHLH35 and seven lines of OsGRF11 were obtained and molecularly analyzed. Analysis of relative expression of the OsbHLH35 and OsGRF11 genes confirmed overexpression of these genes. Phenotypic analysis of plants overexpressing OsbHLH35 showed that these plants produced significantly fewer seeds than untransformed plants, besides presenting open palea and lemma phenotype, nonfertilized flowers and few mature seeds. When performing a detailed analysis of the flower, curved anthers were observed. To address which tissues OsbHLH35 are expressed, a promoter study was performed on rice plants expressing the β-glucuronidase reporter gene under the control of the OsbHLH35 promoter. Through this approach, the expression of OsbHLH35 was observed in the anther, floral primordia, palea and lemma, and in the ovary. Analysis of the relative expression of OsGRF11 and OsbHLH35 throughout panicle development in wild type plants showed that OsGRF11 is highly expressed at all developmental stages analyzed, while OsbHLH35 expression is low under the same conditions. Understanding how OsbHLH35 is involved in anther development, which genes are regulated by this transcription factor, and how it relates to other bHLHs will allow us to clarify where this gene is inserted in the floral development process of rice.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são subprodutos usuais do metabolismo aeróbico e estão envolvidas em rotas de transdução de sinal, porém, podem reagir com macromoléculas biológicas causando danos celulares. Portanto, seus níveis devem ser estritamente controlados. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que plantas silenciadas nas ascorbato peroxidases citosólicas, APX1 e APX2, possuem níveis aumentados de H2O2, entretanto, essas plantas não apresentam fenótipos de estresse, sugerindo que existe um mecanismo de compensação à diminuição da atividade de APX. Análises de transcriptoma mostraram a expressão diferencial de 58 genes, entre eles, o gene OsbHLH35 teve sua expressão induzida nessas plantas. A caracterização funcional dos genes diferencialmente expressos nessas plantas contendo níveis alterados de peróxido de hidrogênio pode revelar os mecanismos compensatórios induzidos nessas plantas que permitem que as mesmas de desenvolvam normalmente. Além disso, o estudo da regulação da expressão desses genes diferencialmente expressos pode permitir entender como a alteração do estado redox da célula é percebido e transduzido. Dessa maneira, o gene OsbHLH35 foi caracterizado funcionalmente, assim como os fatores de transcrição que regulam a sua expressão, visando a contribuir para a elucidação dos mecanismos de defesa sinalizados pelo peróxido de hidrogênio. A expressão do gene OsbHLH35 foi avaliada em resposta a diferentes estresses, tendo sido demonstrada a modulaçao de sua expressão em resposta à salinidade, à dessecação, ao ABA, à luz UV-B, ao H2O2, e ao frio. No intuito de identificar os fatores de transcrição responsáveis pela regulação da expressão do gene OsbHLH35, um fragmento do promotor foi submetido a experimentos de mono-híbrido em levedura e foram identificados quatro fatores de transcrição como reguladores putativos da sua expressão, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF11 e IDEF1. A ligação dos fatores de transcrição ao promotor de OsbHLH35 foi confirmada em ensaios de mono-híbrido, e OsGRF11 foi capaz de reprimir a transcrição do gene repórter em ensaios de transativação. A análise de plantas silenciadas via RNAi nos genes OsGRF3 e OsGRF4 revelou que, além de tamanho reduzido, essas plantas produzem menor número de panículas que as plantas WT. Além disso, plantas superexpressando OsbHLH35 e OsGRF11 foram geradas. Até o momento, as plantas atingiram a fase de florescimento, no entanto, não produziram sementes. O estudo da história evolutiva da família GRF em Viridiplantae revelou que essa família existe pelo menos desde as algas carófitas, tendo sofrido uma expansão nas plantas terrestres, principalmente com duplicações nos ancestrais das monocotileôneas e das eudicotiledôneas, e que eventos de WGD tiveram importância na expansão dessa família. Além disso, sugerimos a origem do GRF ancestral a partir da subunidade SNF2 do complexo de remodelamente da cromativa SWI2/SNF2, provavelmente em uma duplicação no ancestral das carófitas. Reactive oxygen species (ROS) are common byproducts of aerobic metabolism and are involved in signal transduction pathways; however, they may react with biological macromolecules causing cellular damage. Therefore, their levels should be strictly controlled. Previous studies of our group have shown that plants silenced in the ascorbate cytosolic peroxidases, APX1 and APX2, have increased levels of H2O2. However, these plants do not present stress phenotypes, suggesting that there is a mechanism of compensation for the decrease in APX activity. Transcriptome analyses showed the differential expression of 58 genes, among them, the OsbHLH35 gene had its expression induced in these plants. The functional characterization of genes differentially expressed in these plants, containing altered levels of hydrogen peroxide, may reveal the compensatory mechanisms induced in the plants that allow them to develop normally. Also, the study of the regulation of the expression of these differentially expressed genes may allow understanding how alteration of the redox state of the cell is perceived and transduced. In this way, the OsbHLH35 gene was functionally characterized, as well as the transcription factors that regulate its expression, aiming to contribute to the elucidation of the defense mechanisms signaled by hydrogen peroxide. Expression of the OsbHLH35 gene was evaluated in response to different stresses, modulating its expression in response to salinity, desiccation, ABA, UV-B light, H2O2, and cold. To identify the transcription factors responsible for the regulation of OsbHLH35 expression, a fragment of its promoter was used in yeast one-hybrid assays. Four transcription factors were identified as putative regulators of its expression, OsGRF3, OsGRF4, OsGRF11, and IDEF1. Binding of the transcription factors to the OsbHLH35 promoter was confirmed in yeast one-hybrid assays, and OsGRF11 was able to repress the transcription of the reporter gene in transactivation assays. The analysis of plants silenced by RNAi in the genes OsGRF3 and OsGRF4 revealed that, in addition to reduced size, these plants produce fewer panicles than WT plants. Also, we generated plants overexpressing OsbHLH35 and OsGRF11. So far, the plants have reached the flowering stage; however, they have not produced seeds. The study of the evolutionary history of the GRF family in Viridiplantae revealed that this family existed at least since charophyte algae, having undergone an expansion in land plants, mainly with duplications in the ancestors of monocots and eudicots, and that events of WGD were important for the expansion of this family. In addition, we suggested the origin of the ancestral GRF from the SNF2 subunit of the remodeling complex SWI2/SNF2, probably in a duplication in the ancestor of the charophytes.

Previsões indicam que o Brasil deverá assumir a liderança na exportação de produtos agrícolas a partir de 2024. Em 2017, estima-se que a agricultura brasileira poderá ter a maior safra da história. Nesse contexto, investimentos em pesquisas científicas em plantas modelo e em espécies relevantes economicamente são de vital importância a fim de permitir a manutenção do crescimento do setor agrícola em nosso país. Embora o cenário seja positivo e bastante promissor, diversos estresses ambientais afetam a agricultura, ocasionando perdas severas em produtividade e rendimento. Estresses bióticos e abióticos, como seca, alagamento, doenças e patógenos são grandes contribuintes para a diminuição do potencial genético de desenvolvimento e reprodução das culturas agrícolas. Os mecanismos moleculares envolvidos na tolerância/resistência a estresses têm sido intensamente estudados, com grande ênfase nos mecanismos de resposta inerentes aos estresses individuais. Em plantas, um dos processos desencadeados em resposta a estresses é conhecido como Morte Celular Programada (Programmed cell death-PCD). A ocorrência de PCD em plantas é anteriormente marcada pela resposta de hipersensibilidade (hypersensitive response – HR), uma forma de PCD seguida por autólise. Diversas famílias gênicas são sabidamente envolvidas com o processo de PCD em plantas e foram recentemente propostas como integrantes de uma rede de controle de PCD, conhecida como morteossomo (deathsome). Entre essas famílias envolvidas com PCD, muitas são apenas conhecidas superficialmente ou apresentam alguns poucos genes já caracterizados, como as família LSD (Lesion Simulating Disease), Metacaspase, NF-Y (Nuclear Factor Y), PLAC8 (Placenta Specific 8) e GILP (GSH-induced LITAF domain protein). Devido à importância dos mecanismos desencadeados em estresses, investigações detalhadas dos genes atuantes em HR e PCD podem contribuir expressivamente para a completa compreensão das rotas de resposta induzidas durante esses processos. A presente tese enquadrou-se no contexto atual de valer-se de diferentes ferramentas de bioinformática, tendo como objetivo final a caracterização in silico de cinco famílias gênicas relacionadas com PCD em plantas: LSD, Metacaspase, NF-Y, PLAC8 e GILP. A identificação de todos os genes pertencentes a essas famílias, bem como a descrição detalhada da estrutura gênica e proteica permitiu a determinação de muitos aspectos próprios de cada família, os quais podem explicar seu envolvimento em PCD. Somados a esses dados, aspectos evolutivos de cada família gênica também foram investigados. Nossos resultados servem como base para trabalhos aprofundados considerando genes específicos, além de representar o ponto inicial para a compreensão da função dessas famílias em plantas, especialmente no mecanismo de PCD. Predictions indicate that Brazil should reach the leadership in the exportation of agricultural products until 2024. In 2017, it is estimated that Brazilian agriculture may have the highest harvest in the history. In order to maintain the growth of the agricultural sector in our country, investments in scientific research in model plants and in economically relevant species are very important. Although the scenario is very positive and promising, numerous environmental stresses affect agriculture, causing severe losses in productivity and yield. Biotic and abiotic stresses, such as drought, flooding, diseases and pathogens are major contributors to a decrease in the genetic potential for development and reproduction of agricultural crops. The molecular mechanisms involved in tolerance/resistance to biotic and abiotic stresses have been intensively studied, with focus in the response mechanisms inherent to individual stresses. In plants, one of the processes triggered in response to stresses is known as Programmed Cell Death (PCD). The occurrence of PCD in plants is marked by the previously hypersensitivity response (HR), a form of PCD followed by autolysis. Several gene families are known to be involved with the PCD process in plants and have been recently described as members of a PCD network, known as deathsome. The majority families involved with PCD are poor understood. Some of them present few genes already characterized, such as the Metacaspase, NF-Y (Nuclear Factor Y), PLAC8 (Placenta Specific 8) and GILP (GSH-induced LITAF domain protein) family. Due to the importance of the mechanisms triggered in stresses, detailed investigations considering the genes involved in HR and PCD can contribute for a complete understanding of the responses induced during these processes. The present thesis is based on bioinformatics tools, aiming the in silico characterization of five gene families related to PCD in plants: LSD, Metacaspase, NF-Y, PLAC8 and GILP. The identification of all genes belonging to these families, as well as a detailed description of gene and protein structure allowed a determination of several aspects own of each family, which can explain their involvement in the PCD. In addition, evolutionary aspects from each family were also investigated. Our results will serve as a basis for future deep studies considering specific genes and represents the starting point for understand the role of these gene families in plants, especially in PCD mechanism.

O tabaco (Nicotiana tabacum) pertence à família Solanaceae, sendo uma cultura de grande importância econômica. O Brasil é o segundo maior produtor e o maior exportador de tabaco em folha do mundo, e os três estados do sul do país são responsáveis por mais de 90% da produção. As plantas do gênero Nicotiana são conhecidas pela sua composição de alcaloides. A nicotina é o principal alcaloide encontrado nas plantas desse gênero, seguida por nornicotina, anabasina e anatabina. Contudo, a composição de alcaloides pode variar muito dependendo da espécie de Nicotiana. Os alcaloides são compostos muito importantes para as plantas, pois atuam na defesa contra herbívoros. A nicotina é sintetizada nas raízes das plantas através de um processo complexo, envolvendo diversas enzimas e transportadores. Após sintetizada, a nicotina é translocada pelo xilema até as folhas, onde é estocada nos vacúolos e/ou metabolizada em outros alcaloides. O primeiro capítulo deste trabalho consistiu em um artigo de revisão sobre a biossíntese, o transporte e o metabolismo da nicotina em Nicotiana. Assim, pode-se identificar as questões ainda não esclarecidas sobre essas vias, e que merecem mais atenção em futuros trabalhos. A nornicotina é o segundo alcaloide mais encontrado em Nicotiana, sendo sintetizada a partir da desmetilação da nicotina. A reação de desmetilação é catalisada por enzimas nicotina N-desmetilases (NND), codificadas por genes da subfamília CYP82E. A nornicotina, por sua vez, pode reagir espontaneamente com óxidos de nitrogênio presentes nas folhas de tabaco, dando origem a N-nitrosonornicotina (NNN), uma substância cancerígena do grupo das Nitrosaminas Específica do Tabaco (TSNA – Tobacco Specific Nitrosamines). Considerando a importância dessa TSNA para a saúde humana, diversos estudos têm sido realizados a fim de reduzir a produção do seu precursor, a nornicotina, pelas plantas de tabaco. No segundo capítulo deste trabalho, apresentamos a identificação de novos genes putativos da subfamília CYP82E em diferentes espécies do gênero Nicotiana, e uma filogenia incluindo os novos genes identificados. Além disso, as sequências encontradas foram caraterizadas utilizando ferramentas in silico, e algumas predições em comum foram observadas para a maioria das sequências. Assim, conhecer todos os genes que codificam enzimas NND, bem como caracterizar essas enzimas e entender a organização da subfamília gênica CYP82E, podem ser fatores essenciais para desenvolver novas soluções com o objetivo de reduzir substâncias cancerígenas em produtos de tabaco, especialmente as TSNA. Tobacco (Nicotiana tabacum) belongs to the Solanaceae family, being a crop of great economic importance. Brazil is the second largest producer and the largest exporter of tobacco leaf in the world, and the three southern states account for more than 90% of production. Nicotiana plants are known by its alkaloid composition. Nicotine is the main alkaloid found in plants of this genus, followed by nornicotine, anabasine and anatabine. However, the alkaloid composition may vary widely depending on the Nicotiana species. The alkaloids are very important compounds to the plants, since they act in the defense against herbivores. Nicotine is synthesized in the plant roots though a complex process involving several enzymes and transporters. After synthesized, nicotine is translocated via xylem to the leaves, where it is stored in the vacuoles and/ or metabolized in other alkaloids. The first chapter of this work consisted of a review article on nicotine biosynthesis, transport and metabolism in Nicotiana. Thus, it was possible to identify the questions not yet clarified about these pathways, and that need further investigation. Nornicotine is the second most commonly found alkaloid in Nicotiana, being synthesized from nicotine demethylation. The demethylation reaction is catalyzed by nicotine N-demethylase enzymes (NND), encoded by genes of the CYP82E subfamily. Nornicotine, on its turn, can spontaneously react with nitrogen oxides present in the plant leaves, giving rise to N-nitrosonornicotine (NNN), a carcinogen from Tobacco Specific Nitrosamine (TSNA) group. Considering the importance of NNN to the human health, several studies have been carried on to reduce the production of its precursor, nornicotine, by tobacco plants. In the second chapter of this work, we present the identification of new putative CYP82E genes in different Nicotiana species, and a phylogenetic analysis including the new genes identified. In addition, the sequences found were characterized using in silico tools, and we observed some identical predictions among most of the sequences. Thus, the identification of all genes encoding NND enzymes, as well as the characterization of these enzymes and the understanding of CYP82E subfamily organization, can be essential factors in the development of new solutions aiming the reduction of carcinogenic substances in tobacco products, especially the TSNA.

A enzima ascorbato peroxidase (APX) desempenha um papel essencial no controle dos níveis intracelulares de peróxido de hidrogênio (H2O2). O H2O2 é uma molécula continuamente produzida pelo metabolismo aeróbio, sendo citotóxica quando presente em níveis elevados, mas em níveis adequados pode atuar como uma molécula de sinalização. Para entender a função de um gene que codifica uma APX peroxisomal (OsAPX4) do arroz (Oryza sativa L), foram estudadas linhagens transgênicas silenciadas no referido gene (RNAiOsAPX4), através de uma caracterização fenotípica detalhada ao longo dos diferentes estádios de desenvolvimento. Após 40 dias de crescimento, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram maior número de folhas senescentes quando comparadas com as plantas não transformadas (NT). No entanto, as plantas não apresentaram diferenças significativas em altura, no conteúdo de espécies reativas de oxigênio (ERO) e nos parâmetros de eficiência do fotosistema II das folhas bandeira. Curiosamente, as plantas RNAiOsAPX4 apresentaram floração antecipada, de aproximadamente uma semana em relação às plantas NT. A viabilidade do pólen e o número de grãos de pólen por antera não diferiram entre os genótipos. Além disso, os fragmentos de folhas RNAiOsAPX4 foram mais suscetíveis à senescência induzida por escuro. Foi realizada uma análise de transcriptoma para identificar os genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e NT, comparando bibliotecas de mRNA preparadas de folhas de diferentes idades de uma mesma planta (análise ainda está sendo concluída). As comparações realizadas nesta análise demonstraram que as folhas 1 (folha mais antiga) das plantas RNAiOsAPX4 e NT, possui 11 genes diferencialmente expressos com “fold-change” maior ou igual a 2, enquanto que as comparações realizadas entre as bibliotecas preparadas com o material das folhas 2 (folha mais jovem) mostraram 71 genes diferencialmente expressos e cinco genes sobrepostos nas plantas transformadas e não-transformadas. A comparação entre as bibliotecas das folhas 1 e 2 da mesma planta mostrou apenas 2 genes diferencialmente expressos em plantas RNAiOsAPX4 e nenhum gene em plantas NT. Em conclusão, o silenciamento do gene OsAPX4, por conseguinte, a menor expressão de seu produto não afeta o crescimento da planta, mas influencia o tempo de floração e a senescência foliar, sugerindo um papel importante para o gene OsAPX4 na sinalização de ERO. Ascorbate peroxidase (APX) enzyme plays an essential role in the control of intracellular H2O2 levels. H2O2, which is continually produced by aerobic metabolism, is a cytotoxic molecule when in high levels, but in low levels it can act as a signalling molecule. To understand the function of a gene encoding a peroxisomal APX (OsAPX4) from rice (Oryza sativa L), silenced transgenic lines (RNAiOsAPX4) were studied. A careful phenotypic characterization was carried out, following all growth stages of RNAiOsAPX4 and non transformed plants (NT). Under growth chamber conditions, 40 days old RNAiOsAPX4 plants clearly displayed more senescent leaves than NT plants. However, the plants did not present significant differences in height, in the ROS content on flag leaves and in efficiency parameters of photosystem II of flag leaves. Interestingly, RNAiOsAPX4 plants started to flower a week earlier than NT plants. Assessments of pollen viability and the number of pollen grains per anther did not differ between genotypes. In addition, RNAiOsAPX4 leaf fragments were more susceptible to dark induced senescence. A transcriptome analysis to identify differentially expressed genes in RNAiOsAPX4 and NT plants was performed comparing leaves of different ages within a plant and the results are under evaluation. The comparisons between leaf 1 (older leaf) of RNAiOsAPX4 and NT plants showed 11 genes differentially expressed with ≥ 2 fold-change, while the comparisons of leaf 2 (younger leaf) showed 71 genes differentially expressed, with five overlapping genes. The comparison between leaves 1 and 2 within the same plant showed only 2 genes differentially expressed in RNAiOsAPX4 plants and no genes in NT plants. In conclusion, silencing of OsAPX4 gene does not affect plant growth, but it does influence flowering time and leaf senescence, suggesting a role for OsAPX4 gene in ROS signaling.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado de grande importância econômica, e sua produtividade está diretamente relacionada à dormência. Além dos genes responsáveis pelo controle molecular, uma série de proteínas e metabólitos também é recrutada para proteger a integridade da gema dormente, destacando-se as desidrinas (DHN) e as enzimas galactinol sintases (GolS). As DHNs são proteínas que atuam na resposta adaptativa vegetal a estresses abióticos, enquanto que GolS são enzimas responsáveis pela síntese de galactinol, essencial à síntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs), os quais se acumulam em resposta a estresses abióticos. O objetivo do presente trabalho foi explorar a adaptação das gemas a condições de estresse a que são submetidas na dormência, visando identificar genes com potencial uso biotecnológico. Para tal, foram identificados e caracterizados os genes codificadores de DHNs e GolS no genoma da macieira por meio da utilização de ferramentas in silico para estudar a evolução, experimentos a campo e sob condições controladas, análises de expressão, localização subcelular, e geração de plantas transgênicas. As análises evolutivas sugerem que eventos de duplicação do genoma inteiro (WGD) foram responsáveis por moldar a evolução e diversificação dos genes GolS em macieira, enquanto que no caso das DHN eventos de duplicação em tandem e WGD nortearam a sua evolução. Nossos resultados sugerem que DHNs, galactinol e rafinose integram uma série de mecanismos que agem em conjunto durante a dormência a fim de proteger a integridade da gema, além dos carboidratos constituírem uma fonte de energia para a brotação. Ao longo da evolução, o aparecimento de novas estruturas e programas de desenvolvimento, tais como a gema e a dormência, necessitaram de adaptação de vias moleculares já estabelecidas, o que ajuda a explicar por que as dormências de gemas e de sementes compartilham rotas moleculares comuns. Finalmente, o gene MdDHN11 foi funcionalmente caracterizado e nossos resultados fornecem evidências de que MdDHN11 desempenha importantes papéis durante o desenvolvimento da semente de maçã, protegendo o embrião e o endosperma de alterações no status da água. Além disso, apenas a planta superexpressando MdDHN11 sobreviveu ao ensaio de simulação de seca, confirmando o potencial uso biotecnológico de DHNs de macieira no aumento da tolerância ao déficit hídrico. Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related to bud dormancy. Besides genes responsible for the molecular control of the process, a number of proteins and metabolites are also recruited to protect bud integrity, such as dehydrins (DHN) and galactinol synthases (GolS). DHNs are proteins that act on plant adaptive responses to abiotic stresses, while GolS are enzymes that catalyze for the synthesis of galactinol, an essential carbohydrate in the synthesis of raffinose family oligosaccharides (RFOs), which also accumulate in response to abiotic stresses. The objective of this work was to explore bud adaptation to stress conditions that occur during dormancy to identify genes with potential biotechnological applications. DHN and GolS genes were identified and characterized in the apple genome employing in silico tools, experiments under field and controlled conditions, expression analysis, subcellular localization assays, and the generation of transgenic plants. Evolutionary analyses suggest that whole genome duplication (WGD) events were responsible for shaping the evolution and diversification of GolS genes in apple, whereas WGD and tandem duplication events could be held accountable for DHN evolution. Our results suggest that DHNs, galactinol and raffinose integrate a series of mechanisms that act together during dormancy in order to protect bud integrity, besides the carbohydrates being an energy source for budbreak. During evolution, the appearance of new structures and developmental programs, such as buds and dormancy, required the adaptation of already established molecular pathways, partially explaining why bud and seed dormancy share common pathways. Finally, the MdDHN11 gene has been functionally characterized and our results provide evidences that MdDHN11 plays important roles during apple seed development by protecting the embryo and the endosperm from water deficit. Moreover, only the plant overexpressing MdDHN11 survived the water withholding assay, confirming the potential biotechnological use of apple DHNs in increasing tolerance to drought.

As proteínas E2 promoter binding factor (E2F) estão presentes em quase todos os organismos eucarióticos e são essenciais para o controle de muitos processos celulares, como a progressão do ciclo celular, divisão celular, replicação do DNA, e apoptose. A família E2F compreende dois tipos diferentes de proteínas: os E2F típicos e os E2F atípicos, que diferem estruturalmente e possuem funções específicas. Desde a descoberta desta família gênica muitos estudos focaram nos seus aspectos funcionais, porém a história evolutiva desta família gênica estava fracamente entendida em plantas. Nossas descobertas sugerem que os E2F típicos são mais similares a proteína ancestral que os E2F atípicos (DEL). As proteínas E2F surgiram logo após a emergência das espécies eucarióticas, enquanto as proteínas DEL parecem ter surgido antes da separação entre fungos, metazoários e plantas. As proteínas DEL provavelmente emergiram por uma duplicação parcial do gene que codificava a proteína E2F ancestral. Nossos dados também sugerem que a divergência entre E2Fs ativadores e repressores emergiu duas vezes durante a evolução, uma na linhagem embriófita de plantas e outra na linhagem metazoária. Os E2Fs típicos possuem membros que são reguladores positivos para os seus genes alvo e dados recentes estabeleceram um link entre a resposta a danos ao DNA e genes E2F específicos em células de mamíferos, porém o envolvimento da família genica E2F na sinalização ao reparo de DNA em plantas ainda permanece desconhecido. Nós estudamos o envolvimento dos genes E2F em resposta a dano genotóxico em plantas de arroz e Arabidopsis thaliana. Foram conduzidos experimentos com plântulas de arroz e arabidopsis usando UV-B e MMS (Methyl Methanesulfonate) como fonte de danos genotóxicos. Em resposta a estes estresses E2F ativadores específicos aumentaram sua expressão relativa quando comparados com plantas em condições controle. Os resultados obtidos nos experimentos de estresse genotóxicos nos levaram a sugerir que membros específicos da família E2F de arroz e arabidopsis estão envolvidos com as respostas ao dano de DNA. The E2 promoter binding factor (E2F) proteins are present in almost all eukaryotic organisms and are essential to control several cellular processes, such as the cell cycle progression, cell division, DNA replication, and apoptosis. The E2F family comprises two different types of proteins: the typical E2Fs and atypical E2Fs, which differ structurally and have specific functions. Since the discovery of this gene family several studies have focused on the functional aspects, but the evolutionary history of this gene family was poorly understood in plants. Our findings suggest that typical E2F is more similar to the ancestral protein than atypical E2F (DEL). The E2F proteins arose early after the emergence of the eukaryotic species, while DEL proteins appear to have arisen after the separation of fungi, metazoan and plants. The DEL proteins probably emerged through a partial duplication from the gene that encodes the ancient E2F protein. Our data also suggest that the divergence of the E2Fs between activators and repressors emerged twice during evolution, once in the embryophyte lineage and another in the metazoan lineage. The typical E2Fs has members that are positive regulators for their target genes and recent data have established a link between response to DNA damage and specific E2F genes in mammalian cells, but the involvement of the E2F gene family in the signaling of DNA repair in plants still unknown. We studied the involvement of E2F genes in response to genotoxic damage in rice and Arabidopsis thaliana plants. Experiments were conducted with rice and A. thaliana plantlets using UV-B and MMS (Methyl Methanesulfonate) as genotoxic damage souce. In response to these stresses specific activator E2F genes increased their relative expression compared to plants in control condition. The results obtained in the genotoxic stress experiments lead us to suggest that specific members of the E2F family of rice and arabidopsis are involved with responses to DNA damage.

As espécies reativas de oxigênio (ROS) são importantes moléculas sinalizadoras, ou mensageiros secundários, em uma complexa rede de sinalização, que em plantas, é fundamental para o desenvolvimento, e para a resposta a diferentes estímulos ambientais. Por outro lado, estas moléculas representam uma ameaça oxidativa à celula, e em altas concentrações podem danificar diferentes componentes celulares. Dessa forma, as vias de produção e eliminação de ROS devem ser finamente moduladas. Apesar destas vias terem sido amplamente estudadas, incontáveis aspectos ainda permanecem desconhecidos. Este trabalho objetivou estudar os mecanismos de geração e eliminação de ROS nas mitocôndrias e cloroplastos, e seus efeitos no desenvolvimento e na resposta de plantas ao estresse. Assim, foi demonstrado que a enzima succinato desidrogenase (SDH), correspondente ao complexo II da respiração, é um importante sítio de geração de ROS em células vegetais. Além disso, a manipulação da geração de ROS em organelas, como a mitocôndria e o cloroplasto, promoveu alterações claras no padrão de desenvolvimento e nas respostas de plantas a diferentes estresses. Enquanto a indução da geração mitocondrial de ROS via SDH inibiu o desenvolvimento e levou a ativação da expressão de genes de defesa. Por outro lado, alterações nas respostas antioxidantes no cloroplasto, via manipulação genética das ascorbato peroxidases cloroplastídicas (OsAPX7 e OsAPX8), embora tenham afetado em menor grau o desenvolvimento da planta, modularam os parâmetros fisiológicos e a resposta ao estresse. Desta forma, plantas de arroz silenciadas, ou nocaute, para a isoformas cloroplastídicas de APX apresentaram um padrão diferenciado de abertura estomática e tolerância ao estresse hídrico. Além disso, experimentos de monohíbrido permitiram a identificação dos fatores de trasncrição OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, como potenciais reguladores da expressão de OsAPX8. A complexidade das respostas induzidas por ROS indicam que estas possuem uma alta especificidade e dependem da localização subcelular e da atividade de cada um dos componentes dessa intricada rede de sinalização, assim como o nível de expressão de cada um deles. O conjunto dos resultados obtidos amplia a visão do papel das ROS no desenvolvimento vegetal e nos mecanismos de respostas de plantas a estímulos ambientais geradores de estresse oxidativo. The reactive oxygen species (ROS) are important signaling molecules, or secondary messengers, involved in a complex signaling network, which, in plants, is essential for development, and different environmental stimuli responses. Moreover, these molecules represent an oxidative risk to the cell, and at high concentrations may damage various cellular components. Thus, the ROS production and elimination routes should be finely regulated. Although these pathways have been extensively studied, many aspects remain unknown. Here we investigated the mechanisms of generation and elimination of ROS in mitochondria and chloroplasts, and its effects in plant development and stress responses. The results demonstrated that the enzyme succinate dehydrogenase, which corresponds to the mitochondrial complex II, is an important site of ROS production in plant cells. In addition, the control of ROS production in cellular organelles, such as mitochondria and chloroplast, promotes changes in development patterns and in plant stress response. While the induction of mitochondrial ROS production by SDH inhibit the development and activated defense genes expression, changes in chloroplast antioxidant response, by genetic manipulation of chloroplastic ascorbate peroxidases (OsAPX7 e OsAPX8), modulates physiologic parameters and stress response, despite inducing lower changes related to plant development. In this way, rice plants silenced or knockout for chloroplastic isoforms of APX showed a differential stomata opening pattern and drought stress tolerance. In addition, one-hybrid experiments, allowed the identification of the transcription factors OsDST, OsABF7, Os11g28270 e OsVOZ1, as potential regulators of the OsAPX8 expression. The complexity of the responses induced by ROS indicates that these mechanisms have a high specificity and is dependent of the subcelullar location, their activity, and the expression of each one of the components of this signaling network. The results obtained expands our vision of the role of ROS in plant development and in plant responses to environmental stimuli related to oxidative stress.

Os estresses abióticos impostos à planta no campo, tais como o estresse salino, toxidez por alumínio, frio, seca, entre outros, afetam seu crescimento, desenvolvimento e produtividade. Dentre as gramíneas cultivadas, o arroz (Oryza sativa) é uma das culturas de maior importância no Brasil, cuja oscilação na produção acarreta prejuízos consideráveis à economia brasileira. Dessa forma, o estudo das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais é fundamental para um conhecimento detalhado desses mecanismos. O arroz é um dos cereais mais tolerantes ao alumínio (Al), sendo um ótimo modelo para o estudo de mecanismos de tolerância. Neste trabalho, foi estudado o papel das proteínas ASR na tolerância ao Al. A expressão dos genes ASR (ABA, Stress and Ripening) é induzida por ABA, estresses e amadurecimento do fruto. Essas proteínas foram caracterizadas como chaperonas e fatores de transcrição. Os genes da família OsASR também têm o nível de transcritos aumentado em resposta ao Al, sendo OsASR1 e OsASR5 os genes com expressão mais abundante em arroz. No entanto, as regiões promotoras responsivas ao Al e os fatores de transcrição reguladores da expressão desses genes ainda não foram descritos. Assim, este trabalho tem como objetivo geral a identificação dos fatores que regulam a transcrição dos genes OsASR1 e OsASR5. Para tanto, construções contendo fragmentos dos promotores desses genes dirigindo a expressão do gene repórter GUS foram obtidas, visando ensaio de expressão transiente em protoplastos de arroz submetidos ao tratamento com Al. Os fragmentos das regiões promotoras de ambos os genes OsASR1 e OsASR5 foram todos responsivos ao Al. Também foi realizado ensaio de transativação em protoplastos de Arabidopsis thaliana para verificar a existência de auto-regulação nesses genes. Tanto ASR1 quanto ASR5 foram capazes de transativar seus próprios promotores. Além disso, foi realizada uma triagem de biblioteca de cDNAs por mono-híbrido em levedura com fragmento da região promotora de OsASR5. Com essa abordagem, foram identificados sete genes candidatos a codificadores de fatores capazes de interação DNA-proteína. The abiotic stress that plants in the field are subjected to, such as salt, aluminum, cold, drought, among others, affect their growth, development and productivity. Among cultivated grasses, rice (Oryza sativa) is one of the most important crops in Brazil, whose oscillation in production causes considerable costs to the Brazilian economy. Thus, the study of interactions between abiotic stresses and plant responses to these environmental stimuli is essential to a detailed knowledge of these mechanisms. Rice is one of the most Al-tolerant crops, being a great model for studying Al-tolerance mechanisms. In this work, the role of ASR proteins in Al tolerance was studied. The expression of ASR (ABA, Stress and Ripening) genes is induced by ABA, stresses and fruit ripening. These proteins were characterized as chaperones and transcription factors. The OsASR genes also have increased transcript accumulation in response to Al, and OsASR1 and OsASR5 have the most abundant expression in rice. However, the Al-responsive promoter regions and the transcription factors that regulate these genes have not yet been described. Therefore, the goal of this work is to identify regulating factors of OsASR1 and OsASR5 gene transcription. For this, vectors containing promoter fragments of these genes driving the expression of the GUS gene were constructed and transient expression assays were performed in rice protoplasts subjected to Al treatment. All of the promoter fragments were Al-responsive for both OsASR1 and OsASR5 genes. Transactivation assays in Arabidopsis thaliana protoplasts were also conducted in order to verify the existence of auto-regulation in these genes. Both ASR1 and ASR5 were able to transactivate its own promoters. Furthermore, a library screening was performed by yeast one-hybrid using a promoter fragment from OsASR5. With this approach, seven candidate genes encoding transcription factors capable of DNA-protein interactions were identified.

Peroxidases atuam catalisando a redução do peróxido de hidrogênio à água a fim de minimizar o dano celular e modular, direta ou indiretamente, respostas celulares dependentes da sinalização operada por esta espécie reativa de oxigênio. Análises prévias, feitas em bancos de dados de sequências genômicas, permitiram a identificação de uma nova heme peroxidase não-animal (ascorbato peroxidase-relacionada ou APx-R), a qual foi descrita pela primeira vez em 2011 em um estudo publicado pelo nosso grupo de pesquisa. O trabalho detalhado nos próximos capítulos desta tese teve como objetivo caracterizar a participação de APx-R no metabolismo antioxidante vegetal através de abordagens filogenéticas e funcionais. Os resultados apresentados nos capítulos dois e três mostram que APx-R é uma peroxidase de classe I, filogeneticamente relacionada à ascorbato peroxidase, citocromo-c peroxidase e catalase peroxidase. Em Arabidopsis thaliana, APx-R codifica uma proteína cloroplastídica que atua regulando os processos de germinação e maturação da semente. A superexpressão de APx-R in planta afetou drasticamente a viabilidade das sementes, sugerindo que os níveis de expressão deste gene devem ser rigorosamente controlados para permitir o desenvolvimento da planta. Além disso, as análises filogenéticas aqui apresentadas levaram à identificação de uma nova família de peroxidases (intitulada ascorbato peroxidase-like ou APx-L), adicionando um novo componente ao complexo sistema antioxidante vegetal. Peroxidases act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cell injury and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genome databases, we identified a non-animal heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) present from basal to vascular plants, which was initially described in a study published by our group in 2011. The work described hereafter aimed to characterize APx-R participation in the antioxidant metabolism through phylogenetic and functional approaches. The results presented on chapters two and three showed that APx-R is a class I peroxidase, phylogenetically related to ascorbate peroxidase, cytochrome-c peroxidase and catalase peroxidase. In Arabidopsis thaliana, APx-R gene encodes a chloroplast protein which acts regulating germination and seed maturation processes. The overexpression of APx-R in planta impaired seed viability, showing that APx-R expression level must be tightly controlled in order to enable plants to develop properly. In addition, the phylogenetic analysis here presented allowed the identification of a new peroxidase family, called ascorbate peroxidase-like (APx-L), which adds a new component into plant antioxidant metabolism.

O trigo (Triticum aestivum L.) é uma importante cultura no Brasil. Poucas cultivares são recomendadas para produção do tipo sequeiro no Bioma Cerrado onde a escassez de água limita o rendimento de grãos. Aqui reportamos uma análise de transcriptoma do MGS1 Aliança (cultivar de trigo adaptada ao Cerrado) sob estresse de seca. Um grupo de 4.422 transcritos diferencialmente expressos foi encontrado em raízes e folhas. O número de transcritos reprimidos em raiz (1.102) foi menor que os transcritos induzidos (1.706), enquanto o oposto ocorreu em folhas (1,017 induzidos e 647 reprimidos). O número de transcritos comuns entre ambos órgaõs foi 1.249, enquanto 2.124 foram específicos para raíz e 1.049 específicos para folhas. Análises de RT-qPCR de 35 transcritos selecionados ao acaso revelou uma correlação de 0,78 com os dados de transcriptoma. Os transcritos diferencialmente expressos foram distribuídos por todos os cromossomos e componentes do genoma. O número de transcritos no genoma B foi maior do que nos genomas A e D. Ainda, um grande número de transcritos relacionados à seca foi mapeado nos cromossomos 3B, 5B e 2B. Quando consideramos ambos órgãos, 116 diferentes rotas metabólicas foram alteradas. Uma rota em comum, entre as três mais alteradas em ambos órgãos, foi o metabolismo do amido e da sacarose. A comparação de transcritos derivados de raiz e de folha permite a identificação de transcritos importantes relacionados à respota ao estresse de seca em cada um destes órgãos. Os dados obtidos, também, abrem caminho para o desenvolvimento de futuros marcadores e seleção de genes candidatos ligados à característica. Estes resultados são úteis para o entendimento de rotas metabólicas envolvidas na tolerância à seca em trigo. A informação gerada será usada, a mais longo prazo, para propósitos de transgenia. Para isto, a metodologia de duplo-haploides é desejável e uma primeira investigação sobre a eficiência de protocolo se mostrou necessária. Micrósporos são células gaméticas com capacidade de dar origem a uma nova planta via embriogênese in vitro. Plantas duplo-haploides geradas pela cultura de micrósporos isolados são completamente homozigotas e representam uma importante ferramenta para estudos genéticos e melhoramento de plantas O processo androgenético é desencadeado por diferentes pré-tratamentos de estresse, os quais são empregados para mudar os micrósporos da rota gametofítica para a rota esporofítica. Embora a cultura de micrósporos isolados tenha inúmeras vantagens, importantes limitações tem impedido sua apliação em larga escala. Diferenças genotípicas na resposta androgenética e na formação de plantas albinas ainda constituem desafios. Embora o albinismo seja principalmente uma característica genética, pré-tratamentos e meios de cultura apropriados podem evitar este fenômeno até certo ponto. A resposta androgenética de cinco genótipos de trigo brasileiro foi avaliada no presente estudo. Dois pré-tratamentos foram testados: frio (4°C) e ácido 2-hidroxinicotinico (100 mg/L). O frio foi melhor que o pré-tratamento químico, produzindo mais plantas verdes em quatro de cinco genótipos. Somente dois genótipos brasileiros tratados com ácido 2-hidroxinicotinico produziram plantas, e um deles apenas uma única planta albina. Nossos reultados mostram, também, que o meio semilíquido (contendo 10% de Ficoll) promoveu uma maior resposta androgenética que o meio líquido, aumentando o número de embriões e plantas regeneradas. Wheat (Triticum aestivum L.) is an important crop cultivated in Brazil. Few cultivars are recommended for rainfed production in the Cerrado Biome where water scarcity limits grain yield. Here we report a transcriptome analysis of MGS1 Aliança (a wheat cultivar adapted to the Cerrado) under drought stress. A set of 4,422 differentially expressed transcripts was found in roots and leaves. The number of down-regulated transcripts in roots (1,102) was lower than the up-regulated transcripts (1,706), while the opposite occurred in leaves (1,017 induced and 647 repressed). The number of common transcripts between the two tissues was 1,249, while 2,124 were specific to roots and 1,049 specific to leaves. Quantitative RT-PCR analysis of 35 randomly selected transcripts revealed a 0.78 correlation with the transcriptome data. The differentially expressed transcripts were distributed across all chromosomes and component genomes. The number of transcripts on the B genome was greater than on the A and D genomes. Additionally, a greater number of drought related transcripts was mapped on chromosomes 3B, 5B and 5D. When considering both tissues, 116 different metabolic pathways were changed. One common pathway, among the top three changed pathways in both tissues, was starch and sucrose metabolism. The comparison of root- and leaf-derived transcripts allows the identification of important transcripts related to water stress response in each of these tissues. It also paves the way for future marker development and selection of candidate genes linked to that trait. These results are useful for understanding the metabolic pathways involved in wheat drought response. The information generated will be used for transgenic wheat purposes. For this the doubled-haploid method is desirable and an investigation about the protocol eficiency is needed. Microspores are gametic cells with capacity to give rise to a new plant via in vitro embryogenesis. Doubled haploid plants generated by isolated microspore culture are completely homozygous and represent an important tool for plant genetics and breeding research. This process is triggered by different stress pretreatments, which are employed to switch microspores from gametophytic to a sporophytic pathway. Although isolated microspore culture has innumerous advantages, important limitations have prevented its application on a large scale. Genotypic differences in androgenic response and the formation of albino plants remain great challenges. Although albinism is a major genetic characteristic, appropriated pretreatments and culture medium can avoid this phenomenon to some extent. The androgenic response of five Brazilian wheat genotypes was evaluated in the present study. Two pretreatments were tested: cold (4°C) and 2-hydroxynicotinic acid (100 mg/L). Cold was better than chemical pretreatment, producing more green plants in four out of five genotypes. Only two Brazilian genotypes treated with 2-hydroxynicotinic acid produced plants, and one of them produced a single albino plant. Our results also show that semi-liquid medium (containing 10% Ficoll) promoted a higher androgenic response than did liquid medium, increasing the number of embryos and regenerated plants.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie pertencente a família Fabacea (leguminosas), de grande importância econômica no mundo. Por isso, foi recomendada como planta modelo para estudos genéticos e moleculares (Gepts et al., 2005). O sucesso na cultura dessa espécie pode ser limitado por diversos fatores bióticos e abióticos. Dentre os fatores bióticos, destacam-se as doenças, entre elas, a Ferrugem Asiática causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi, enquanto a desidratação causada pela seca é um dos fatores abióticos de maior relevância. A introdução de cultivares resistentes tem se mostrado uma alternativa eficiente para a redução de perdas na produtividade causada por esses estresses por patógeno e pela seca. Vários genes que codificam fatores de transcrição têm sido utilizados como tentativa para aumentar a tolerância de plantas a condições adversas. Entre as famílias de fatores de transcrição, a família bHLH (basic helix-loop-helix) destaca-se como a maior família de fator de transcrição de plantas e está envolvida em diferentes rotas regulatórias conferindo maior tolerância a diferentes estresses ambientais. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a caracterização funcional de genes que codificam fatores de transcrição bHLH em resposta aos estresses gerados por Phakopsora pachyrhizi e seca. Na tentativa de esclarecer o papel de genes bHLH no desenvolvimento de planta de soja, foram produzidas plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana superexpressando o gene bHLH (Gm06g01430) de soja, o qual mostrou-se diferencialmente expressos em condições de estresses. Estas plantas transgênicas apresentaram a emissão e a abertura dos cotilédones, assim como a emissão das folhas precocemente, em relação aos mesmos parâmetros observados na planta selvagem. Ainda, a fim de elucidar prováveis rotas sinalizadoras em que os fatores de transcrição bHLH estão envolvidos, identificou-se, através de um screening de duplo híbrido em leveduras, uma interação da proteína bHLH (Gm05g02110) com a proteína polyamina oxidase 2 (PAO2). Essa interação foi confirmada em ensaios de BiFC em protoplastos de arabidopsis que demonstrou que esta interação ocorre no citoplasma e no núcleo das células. Os resultados sugerem que Gm05g02110 está relacionado à resposta de suscetibilidade ao patógeno causador da ferrugem asiática. A proteína por ele codificada, provavelmente liga-se ao motivo de DNA G-box (CACGTG) e sua interação com a proteína PAO2 pode estar relacionada ao mecanismo de regulação da resposta a estresses bióticos e abióticos. Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is a species belonging to Fabacea family (legumes), of great economic importance in the world. Therefore, it was recommended as a model plant for genetic and molecular studies (Gepts et al., 2005). The successful culture of this species may be limited by various biotic and abiotic factors. Among the biotic factors, there are the diseases, among them, the soybean rust caused by Phakopsora pachyrhizi, while the dehydration caused by drought is one of the abiotic factors most relevant. The introduction of resistant cultivars has proven to be an effective alternative for reducing yield losses caused by these stresses by pathogen and drought. Several genes encoding transcription factors have been used in an attempt to increase the tolerance of plants to adverse conditions. Among the families of the bHLH (basic helix- loop - helix) transcription factor,family stands out as the largest family of transcription factores plants and is involved in different regulatory routes conferring tolerance to various environmental stresses. In this context, the aim of this work was the functional characterization of genes encoding bHLH transcription factor in response to stresses generated by Phakopsora pachyrhizi and dry. In an attempt to clarify the role of the bHLH genes in the development of soybean plants, transgenic Arabidopsis thaliana plants overexpressing the bHLH gene (Gm06g01430) of soybean, which proved to be differentially expressed under conditions of stress were produced. These transgenic plants showed the emission and the opening of the cotyledons, and the emission of advance sheets to the same parameters observed in wild plant. Further, in order to elucidate signaling likely routes that are involved bHLH transcription factor, it was identified through a two-hybrid screening in yeast, the interaction of the bHLH protein (Gm05g02110) with polyamina oxidase 2 (PAO2) proteins. This interaction was confirmed in assays BiFC in Arabidopsis thaliana protoplasts which demonstrated that this interaction occurs in the cytoplasm and nucleus of cells. The results suggest that Gm05g02110 response is related to susceptibility to the causative pathogen of soybean rust, probably binds to the motif of DNA G -box (CACGTG) and its interaction with the protein PAO2 can be related to the mechanism of regulation of response to stress biotic and abiotic.

As plantas são organismos sésseis que continuamente enfrentam situações ambientais adversas, o que acarreta em reduções significativas da biomassa e da produtividade. O trabalho, aqui exposto, teve como objetivo avaliar o papel dos fatores de transcrição ASR (do ingles ABA, stress and ripening) na resposta a estresses abióticos em plantas de arroz. Também teve como objetivo avaliar as respostas de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse produzido nos momentos iniciais da exposição ao metal alumínio. O capítulo 1 da presente tese, compara a expressão de miRNAs entre plantas silenciadas para o gene ASR5 (ASR5_RNAi) e plantas não transformadas (controle). De um total de 279 miRNAs maduros identificados, distribuídos em 60 famílias, 159 foram diferencialmente expressos quando as duas bibliotecas foram comparadas. Uma correlação negativa entre o MIR167 e seu gene alvo (LOC_Os07g29820) também foi confirmada por PCR em tempo real. Este é o primeiro trabalho sugerindo o envolvimento das proteínas ASR na regulação da expressão de miRNAs em planta. O segundo capítulo apresenta o estudo das proteínas ASR na manutenção da homeostase do pH em plantas de arroz. Verificou-se uma diminuição do crescimento radicular em plantas silenciadas em solução ácida, quando comparadas com plantas não transformadas nas mesmas condições. Também foi analisada a viabilidade da ponta de raízes quanto ao dano causado pelo baixo pH e diferentes concentrações de Ca+2, demonstrando que a adição de CaCl2 é capaz de aliviar o efeito tóxico do excesso de protons H+. Diversos genes reprimidos nas plantas silenciadas e envolvidos no mecanismo de manutenção do pH em células vegetais, também foram investigados. O terceiro e último capítulo é dedicado ao estudo da resposta inicial de plantas de Arabidopsis thaliana ao estresse por alumínio. Plantas com 7 dias de idade foram expostas a uma concentração de 25 μM de AlCl3 durante 3 horas e modificações na abundância de proteínas foi investigada com a técnica de espectrometria de massa. Um total de 3.213 proteínas foram identificadas, sendo que destas, 293 apresentaram variação no nível de expressão. Diversas proteínas com expressão induzida são funcionalmente associadas com a detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ROS), indicando que o tratamento ocasionou estresse oxidativo nas raízes de A. thaliana. Também foram identificadas uma proteína mitocondrial carreadora de substrato e uma acyl-CoA oxidase com possível papel nos mecanismos de defesa em resposta a alumínio e com potencial para futuros estudos funcionais na planta modelo. De uma maneira geral, os resultados aqui apresentados mostram, pela primeira vez, que ASR5 está envolvida na regulação de miRNAs e na homeostase do pH em plantas de arroz, além de identificar proteínas responsivas ao estresse por alumínio em A. thaliana. Plants are sessile organisms that continuously face adverse environmental situations, leading to a significant reduction in biomass and yield. The aim of the present work was to further study the ASR (ABA, stress and ripening) transcription factors in rice plants. Moreover, the responses of Arabidopsis thaliana to aluminum stress were also analyzed. The chapter 1 of this thesis compares the expression of mature miRNAs in the ASR5 silenced plants (ASR5_RNAi) and in non-transformed plants (control). From a total of 279 mature miRNA of 60 families, 159 were differentially expressed. A negative correlation of MIR167 and its target gene (LOC_Os07g29820) was also confirmed by real time RT-qPCR. This is the first report showing the involvement of ASR proteins in miRNA gene expression regulation. The second chapter presents the study of participation of ASR proteins in the maintenance of pH homeostasis in rice plants. The evaluation of root growth in ASR5_RNAi plants upon acid solution showed inhibition of root growth when compared to non-transformed plants in the same condition. Root tip feasibility and damage caused by low pH and different concentrations of Ca+2 was also analyzed. The results indicate that addition of CaCl2 is capable of alleviating the toxic effects of H+ protons. Several genes downregulated in silenced plants and involved in pH maintenance in plant cells have also been investigated. This work demonstrates the importance of ASR transcription factors in a biological process not yet described. The third and final chapter describes the study of the initial response of Arabidopsis thaliana to aluminum stress. Seven-day old seedlings were treated with 25 μM AlCl3 for 3 hours and submitted to quantitative analyses by mass spectrometry. A total of 3,213 proteins were identified, from which 293 proteins were differentially responsive upon aluminum treatment. Several proteins with increased expression in response to the treatment are functionally associated with reactive oxygen species (ROS), indicating that the Al3+ exposure caused oxidative stress in the roots of A. thaliana. A mitochondrial substrate carrier (At1g78180) and an acyl-CoA oxidase (At3g51840) with a putative role in Al defense were also up-regulated and constitute interesting targets for functional studies of aluminum toxicity in the model plant. Overall, the results here presented show for the first time that ASR5 is involved in miRNA and pH homeostases regulation in rice plants and also identify proteins responsive to aluminum stress in A. thaliana.

Metalochaperonas são proteínas chave para o transporte seguro de íons metálicos dentro das células. HIPPs (Heavy metal associated Isoprenylated Plant Proteins) são metalochaperonas que contém um domínio de ligação a metais pesados (HMA) e um motivo C-terminal de isoprenilação. Estudos anteriores demonstraram que HIPPs podem se ligar e transportar íons metálicos diferentes como Cu+2, Zn+2 e Cd+2 . Proteínas desta família foram descritas como envolvidas em diferentes processos: (i) homeostase de metais pesados e mecanismos de desintoxicação, em especial na tolerância a cádmio; (ii) resposta transcricional a frio e seca, e (iii) interações planta-patógeno. Devido a sua grande diversidade e possível redundância funcional entre proteínas semelhantes, as HIPPs foram pouco estudadas até o momento. A caracterização desta família gênica é importante não somente para a compreensão de seu papel na homeostase celular, mas também porque pode ter fortes aplicações no melhoramento de plantas cultivadas. No presente estudo, demonstramos que HIPPs compõem uma grande e diversa família de genes encontrados somente em plantas vasculares e que, em angiospermas podem ser divididos em cinco clusters distintos. Ao explorar dados da transcrição de HIPPs em Arabidopsis thaliana e arroz (Oryza sativa), observa-se que os genes desta família apresentam um amplo espectro de padrões de expressão. Análises de expressão por RT-qPCR permitiram mostrar que os genes HIPPs de arroz OsHIPP21, OsHIPP28 e OsHIPP41 são induzidos por cádmio. O gene OsHIPP41 também se mostrou altamente expresso em resposta a frio e seca. Em protoplastos de arroz, as proteínas OsHIPP21 e OsHIPP41 foram observadas no citosol e no núcleo da célula. Nossos resultados indicam que as proteínas da família HIPP desempenham um papel importante no desenvolvimento das plantas vasculares e na resposta das plantas a mudanças ambientais. Metallochaperones are key proteins for the safe transport of metallic ions inside the cell. HIPPs (Heavy metal associated Isoprenylated Plant Proteins) are metallochaperones that contain a metal binding domain (HMA) and a C-terminal isoprenylation motif. Previous studies demonstrated that HIPPs can bind and transport different metallic ions as Cu+2, Zn+2 and Cd+2. Proteins of this family are shown to be involved in diverse processes as (i) heavy metal homeostasis and detoxification mechanisms, especially those involved in cadmium tolerance; (ii) transcriptional responses to cold and drought, and (iii) plantpathogen interactions. Because of their diversity and possible functional redundance between similar proteins, few studies were made with HIPPs until now. The characterization of this family is important not only for the understanting of its role in cellular homeostasis, but also for its possible biotechnological application in crops improvement. In this study, we provided evidence that HIPPs compose a vast family of genes found only in vascular plants and that, in angiosperms, can be separated into five distinct clusters. Exploring transcriptional data from Arabidopsis thaliana and rice (Oryza sativa) it was observed that genes from this family show a broad spectrum of expression patterns. By RTqPCR analysis it was identified that the rice HIPP genes OsHIPP21, OsHIPP28 and OsHIPP41 are induced by Cd stress. The latter was also highly expressed in response to cold and drought stresses. In rice protoplasts, the proteins OsHIPP21 and OsHIPP41 were localized in the cytosol and the cell nucleus. Our results suggest that HIPPs play an important role in the development of vascular plants and in plant responses to environmental changes.

Brassica napus (canola) é a terceira cultura oleaginosa mais produzida no mundo, fornecendo cerca de 13% de toda a oferta mundial de óleo vegetal. Durante o desenvolvimento de sementes, B. napus acumula compostos de reservas em estádios e tecidos específicos. A maioria destes compostos de reservas são lípidos (30-40%) e proteínas (17-26%), sendo quase que exclusivamente armazenados nos cotilédones do embrião maduro. Os microRNAs (miRNAs) desempenham um papel essencial em diversos aspectos do desenvolvimento de sementes. A função destes pequenos RNAs (sRNAs) endógenos não-codificantes é regular a expressão gênica, principalmente através da clivagem e a inibição de tradução de mRNA alvo. Estudos recentes têm contribuído para a identificação de miRNAs em sementes de B. napus, mas a expressão temporal e as funções regulatórias dos miRNAs em sementes de B. napus, especialmente durante a maturação, são desconhecidas. Para entender os padrões de expressão temporal dos miRNAs durante o desenvolvimento de sementes por RT-qPCR, este trabalho se concentra primeiramente na determinação de genes de referência para serem utilizados como normalizadores em estudos de RT-qPCR e no perfil de expressão dos miRNAs durante o desenvolvimento de sementes. A estabilidade da expressão de 16 mRNA e 43 miRNAs de B. napus foi avaliada em amostras de folha, tecidos florais e diferentes estágios de desenvolvimento de sementes. Nossas análises demonstraram que os miRNAs apresentam uma maior estabilidade de expressão do que genes que codificam proteínas, e a combinação miR156-7, miR11-1 e miR408-1 foi a mais apropriada para ser utilizada como normalizadores em estudos de expressão gênica por RT-qPCR. O perfil de expressão de 40 miRNAs foi avaliado ao longo do desenvolvimento de sementes. A maioria dos miRNAs teve sua expressão induzida durante a maturação de sementes, enquanto um pequeno número foi preferencialmente expressos em estágios iniciais do desenvolvimento das sementes. Um miRNA inédito, denominado miR03-1, apresentou uma expressão diferencial entre os estágios precoces e tardios do desenvolvimento. A expressão do miR03-1 é fortemente induzida 21 dias após o florescimento. A partir de uma abordagem computacional para predição de possíveis genes-alvo de miRNAs de B. napus foi possível identificar um total de 481 alvos putativos para 104 sequências maduras de miRNAs. Todos os alvos preditos estão diretamente relacionados com o metabolismo lipídico, dentre estes fatores de transcrição e enzimas-chave do metabolismo lipídico. O estudo da regulação destes genes por miRNAs em diferentes estágios do desenvolvimento de semente contribuirá para o entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no metabolismo lipidico. Brassica napus (canola) is the third largest oilseed crop in the world, providing approximately 13% of the world's supply of vegetable oil. During seed development, B. napus build up storage reserves in specific stages and tissues. The vast majority of these reserves are made up of lipids (30–40%) and proteins (17–26%) that are almost exclusively stored in the cotyledons of the maturing embryo. MicroRNAs (miRNAs) play essential roles in various aspects of seed development, including embryo development and the timing of seeds maturation. The function of these endogenous small non-coding RNAs (sRNAs) is to regulate gene expression, mainly through cleavage and translation inhibition of target. Several recent studies have contributed to the identification of miRNAs in seeds from B. napus, but temporal expression and regulatory functions of miRNAs in seeds of B. napus, especially during seed maturation, are unknown. To understand the temporal expression patterns of miRNAs during seed development by RT-qPCR, this work focuses primarily on the determination of appropriate reference genes for use in RT-qPCR studies and in the expression profile of miRNAs during seed development. The expression stability of 16 previously reported reference genes and 43 B. napus miRNAs have been evaluated in leaf and flower tissues, as wel in different seed development stages. Our analyses showed that miRNAs presented higher expression stability than protein-coding genes and the combination of miR156-7, miR11-1 and miR408-1 was appropriate as normalizers in studies of gene expression by RT-qPCR. In addition, the expression profile of 40 miRNAs was studied throughout seed development. The majority of miRNAs increased their expression during seed maturation, while a small part of the miRNAs was preferentially expressed at early seed developmental stages. A new miRNA named miR03-1 showed differential expression between the early and late stages of seed development and is strongly induced 21 days after flowering. In parallel, a computational approach was carried out to predict candidate target genes for B. napus miRNAs. A total of 481 putative targets were predicted for 104 sequences of mature miRNAs. All predicted targets are directly related to the lipid metabolism, such as transcription factors and key enzymes of lipid metabolism. The study of regulation of these genes by miRNAs in different stages of seed development will contribute to understanding the molecular mechanisms involved in lipid metabolism.

LSD (Lesion Simulating Disease) é uma família de proteínas dedo de zinco descritas como importantes na resposta hipersensitiva (HR – hipersensitive response), limitando a área da lesão e a morte celular programada (PCD – programmed cell death), regulando negativamente as espécies reativas de oxigênio (ROS – reative oxygen species) geradas em condições de estresse biótico e abiótico. Até o presente momento, a maioria dos estudos incluindo genes LSD foi realizada em Arabidopsis thaliana, havendo poucos relatos em outros organismos. Além disto, a identificação completa dos genes LSD não foi ainda descrita, o que dificulta a reconstrução da história evolutiva desta família. Assim, os objetivos deste estudo foram identificar sequências de genes LSD em diferentes genomas, realizar a análise filogenética dessa família e avaliar o perfil de expressão de genes GmLSD em diferentes órgãos de soja e sob condições de estresse. Nossos resultados permitiram a identificação de 117 possíveis genes LSD exclusivamente em Viridiplantae. Os organismos basais Volvox carteri e Chamydomonas reinhardtii apresentaram uma cópia de genes LSD. Além disso, a expansão do número de cópias gênicas parece ter ocorrido no clado Embriófita. As sequências identificadas foram analisadas quanto à presença do domínio dedo de zinco característico, sendo encontradas proteínas com uma, duas e três cópias de domínios LSD. Foi observada uma ampla conservação das três sequências de domínios LSD, indicando a manutenção destas ao longo da evolução da família. A análise filogenética mostrou que a arquitetura de proteínas com três domínios LSD representa a condição mais ancestral, sendo presente desde os organismos basais. As proteínas com dois domínios LSD foram identificadas somente no clado Embriófita e proteínas que possuem um domínio LSD foram altamente representadas no clado gramíneas. Os genes de monocotiledôneas e dicotiledôneas não formaram grupos separados, indicando que a expansão da família LSD foi anterior à diversificação entre esses clados. A análise de expressão dos genes GmLSD em diferentes órgãos de soja mostrou que estes tem expressão variável dependente do órgão. Foi avaliada a expressão dos genes GmLSD em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador da ferrugem asiática da soja (ASR – Asian Soybean Rust). A abordagem de RNA-seq (no qual foi analisada somente a região da lesão) permitiu a identificação de GmLSD1, GmLSD3 e GmLSD4 nos genótipos suscetível (EMBRAPA48) e resistente (PI561356), enquanto que GmLSD6 e GmLSD8 foram detectados somente no genótipo resistente PI561356. Por outro lado, o experimento de RT-qPCR (em que foram analisadas folhas de soja infectadas por P. pachyrhizi) revelou que todos os genes GmLSD foram responsivos a inoculação do fungo, embora GmLSD1, GmLSD4 e GmLSD8 tenham sido modulados exclusivamente no genótipo resistente PI561356. A análise do perfil de expressão dos genes GmLSD em raízes e folhas de plantas de soja em condições de déficit hídrico mostrou que a maioria dos genes GmLSD foi modulada em resposta ao estresse. No entanto os genes GmLSD5 (folhas), GmLSD1 e GmLSD2 (raízes) foram diferencialmente expressos somente na cultivar tolerante EMBRAPA48. Esses resultados sugerem um possível envolvimento dos genes GmLSD na PCD causada por estresses bióticos e abióticos, assim como observado em Arabidopsis thaliana. Análises futuras com os genes GmLSD são particularmente interessantes para avaliar o potencial biotecnológico destes genes, sobretudo visando o desenvolvimento de plantas de soja mais tolerantes/resistentes à diferentes condições de estresse. LSD (Lesion Simulating Disease) is a family of zinc finger proteins described as important in the hypersensitive response (HR), limiting the area of injury and the programmed cell death (PCD), negatively regulating the Reactive oxygen species (ROS) generated under biotic and abiotic stress conditions. To date, most studies including LSD genes were performed in Arabidopsis thaliana, with few reports in other organisms. Moreover, the complete identification of LSD genes has not yet been described, which difficult the reconstruction of the evolutionary history of this family. The goals of this study were to identify LSD gene sequences in different genomes, perform a phylogenetic analysis of this family and evaluate the expression profile of GmLSD genes in different soybean organs and under stress conditions. Our results allowed the identification of 117 putative LSD genes exclusively in Viridiplantae. Volvox carteri and Chamydomonas reinhardtii basal organisms showed one copy of LSD gene. Furthermore, the expansion of the number of genes copies seems to be occurred in Embryophyte clad. The identified sequences were analyzed for the presence of the characteristic zinc finger domain, being found proteins with one, two and three copies of LSD domains. We observed a wide conservation of the three sequences of LSD domains, indicating their maintenance throughout the evolution of the family. Phylogenetic analysis showed that the architecture of proteins with three LSD domains is the most ancestral condition, being present since the basal organisms. Proteins with two LSD domains have been identified only in Embryophyte clad and proteins having one LSD domain were highly represented in the Grass clad. The monocots and dicots genes not formed separate groups, indicating that the expansion of the LSD family was prior to diversification between these clades. The expression analysis of GmLSD genes in different soybean organs showed that these having an organ dependent variable expression. We evaluated the expression of GmLSD genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the Asian Soybean Rust (ASR) causal agent. The RNA-seq approach (wherein only the lesion site was analyzed) allowed the identification of GmLSD1, and GmLSD3 GmLSD4 in both susceptible (EMBRAPA48) and resistant (PI561356) genotypes, while GmLSD6 and GmLSD8 were detected only in PI561356 resistant genotype. Moreover, the RT-qPCR experiment (in which soybean leaves infected by P. pachyrhizi were analyzed) showed that all GmLSD were responsive to fungus inoculation, although GmLSD1, GmLSD4 and GmLSD8 were differentially expressed only in PI561356 resistant genotype. The analysis of GmLSD genes expression profile in roots and leaves of soybean plants under water deficit conditions showed that the majority GmLSD genes were modulated in response to stress. However, GmLSD5 (leaves), and GmLSD1 GmLSD2 (roots) genes were differentially expressed only in EMBRAPA48 tolerant cultivar. These results suggest a putative involvement of GmLSD genes in the PCD caused by biotic and abiotic stresses, as observed in Arabidopsis thaliana. Further analyzes with GmLSD genes are particularly interesting to evaluate the biotechnological potential of these genes, especially for the development of soybean plants more tolerant / resistant to various stress conditions.

Em sementes, os lipídeos de reserva são compostos, principalmente, por triacilglicerídeos (TAG), os quais se acumulam durante a fase de maturação do embrião ou endosperma e, durante a germinação da semente são catabolizados, fornecendo energia para o estabelecimento e desenvolvimento da plântula. Na presente tese buscamos, primeiramente, contribuir para um melhor entendimento do processo de síntese de ácidos graxos e TAGs em plantas e algas, por meio de um estudo comparativo das diferentes rotas envolvidas na produção e acúmulo de lipídeos de reserva nestes grupos de organismos. As principais rotas de biossíntese de ácidos graxos e TAGs em algas são análogas às apresentadas em plantas e, ao contrário de plantas, as algas acumulam quantidades significativas de lipídeos na forma de TAGs apenas sob condições desfavoráveis de crescimento ou de estresse. Posteriormente, passamos às análises acerca do fator de transcrição eucariótico NF-Y (Nuclear Factor of Y box), o qual participa da regulação de processos como maturação, síntese e acúmulo de lipídeos em sementes. NF-Y é um complexo hetero-oligomérico formado por três subunidades (NF-YA, NF-YB e NF-YC). Análises filogenéticas mostraram que a diversificação em todas as subunidades do fator de transcrição NF-Y é resultado de diversos eventos de duplicação ao longo da evolução e diversificação das plantas, muitos dos quais ocorridos após a divergência entre mono e dicotiledôneas. O estudo detalhado dos genes que codificam a subunidade NF-YB, sugere um modelo no qual uma subclasse de genes denominados tipo LEC1 (LEAFY COTYLEDON1) teria se originado em plantas vasculares através de processos de neofuncionalização e/ou subfuncionalização. Análises de expressão e de interação proteína-proteína demonstraram a existência de diferentes parceiros NF-YC para LEC1 e L1L, indicando que os genes do tipo LEC1 em mamona não são redundantes e podem ter evoluído para desempenhar diferentes papéis durante o desenvolvimento da semente de mamona. Por fim, realizamos a identificação dos genes alvo diretos de LEC1 nos estágios cotiledonar e de início da maturação da semente de soja (Glycine max). Nossos resultados demonstraram que LEC1 apresenta uma grande quantidade de genes alvo comuns às duas fases de desenvolvimento da semente analisadas, mas também apresenta enriquecimento em diferentes processos metabólicos nos estágios cotiledonar e de início da maturação. Além disso, LEC1 se liga não somente a promotores alvo enriquecidos na sequência canônica CCAAT como também a outras sequências, com destaque para motivos de ligação de fatores de transcrição do tipo bZIP, o que pode indicar que tais fatores de transcrição podem estar relacionados com a regulação do desenvolvimento e maturação da semente exercida por LEC1. In seeds, lipids of storage are composed mainly of triacilglicerídeos (TAG), which accumulate during the maturation phase of embryo or endosperm, and during seed germination are catabolized, providing energy for the establishment and seedling development . In this thesis, first of all, we focused on the understanding of fatty acid and TAG biosynthesis in plants and algae, through a comparative study of the different pathways involved with lipid production and accumulation in these organisms. The main pathways for fatty acids and TAG biosynthesis in algae are analogous to those demonstrated in higher plants and, in contrast with plants, algae accumulate high levels of TAGs only under unfavorable growth or stress conditions. We also analyzed the NF-Y (Nuclear Factor of Y box) eukaryotic transcription factor, which is involved in the regulation of maturation, lipid biosynthesis and accumulation in seeds. NF-Y is an oligotrimer complex composed by three subunits (NF-YA, NF-YB and NF-YC). Phylogenetic analysis showed that the gene diversification observed for all NF-Y subunits likely resulted from several duplication events along evolution and diversification of plants, some of them occurred after the divergence of monocots and eudicots. The study of the NF-YB subunit encoding genes suggested a model in which LEC1 (LEAFY COTYLEDON1) type gene family originated in vascular plants through a process of neofunctionalization and/or subfunctionalization. Expression analysis and protein interaction experiments demonstrated that are different NF-YC partners for LEC1 and L1L, indicating that LEC1-type genes in castor bean are not redundant and could have evolved to play different roles during castor seed development. Finally, we identified the direct targets of LEC1 in the cotyledon and early maturation stages during soybean seed development (Glycine max). We observed that LEC1 has a high number of common direct targets to both stages of soybean seed development, but also presents enrichment in different metabolic process in cotyledon and early maturation stages. Besides that, LEC1 bind not only the promoter regions enriched in CCAAT binding sequences but also other sequences, especially bZIP binding sites, which can indicate that bZIP transcription factor could be related with the regulation of seed development and maturation performed by LEC1.

NF-Y é um fator de transcrição heterotrimérico que reconhece e se liga ao motivo CCAAT, o qual está presente em diversos promotores eucarióticos, regulando genes relacionados, por exemplo, com o desenvolvimento, a proliferação celular e a síntese de ácidos graxos. Enquanto em animais cada subunidade é codificada por apenas um gene, em plantas, cada subunidade é codificada por uma família gênica. Em mamona, a subunidade “A” é codificada por seis genes, a subunidade “B” por doze genes e a subunidade “C” por sete genes. Com relação aos membros da subunidade B, duas classes de proteínas foram identificadas, as do tipo LEC1 (LEC1 e L1L) e as do tipo Não-LEC1. Os genes que codificam as proteínas do tipo LEC1 estão presentes no genoma de plantas vasculares, apresentam padrão de expressão semente-específico e codificam proteínas que formam dímeros com membros de NF-YC, possivelmente regulando genes relacionados à embriogênese, à maturação da semente e à síntese de ácidos graxos, por exemplo. Em plantas, poucos trabalhos investigaram o modo de associação entre as subunidades deste fator de transcrição, e o modelo animal é atualmente aceito. No entanto, especula-se que a subunidade A tenha uma função reguladora negativa, e que as subunidades B e C atuem em conjunto com outros fatores de transcrição e outras proteínas regulatórias. No presente trabalho, análises de PCR quantitativa mostraram que cinco dos seis genes que codificam a subunidade A são expressos durante o desenvolvimento de sementes de mamona, indicando que esses genes possuem expressão tempo-espacial compatível com a expressão dos genes do tipo LEC1, podendo teoricamente atuar como seus parceiros moleculares. A análise do interatoma entre os membros da subunidade A e os membros das subunidades B e C demonstra que esses fatores atuam de maneira complexa, tendo parceiros moleculares preferenciais e, diferentemente do modelo atualmente aceito, alguns membros das subunidades A e C parecem formar dímeros. Além disso, pode ser visto que LEC1 e L1L não apresentam os mesmos parceiros moleculares em sua totalidade, corroborando com a hipótese de que seus papeis não sejam totalmente redundantes. NF-Y is a heterotrimeric transcription factor that recognizes and binds to the CCAAT motif, which is present in many eukaryotic promoters regulating genes related to, for example,process such as development, cellular proliferation and synthesis of fatty acids. Whereas in animals each subunit is encoded by a single gene, in plants, each subunit is encoded by a gene family. In castor, subunit "A" is encoded by six genes , the subunit "B" by twelve genes and subunit "C" by seven genes. Regarding the members of the B subunit, two classes of proteins have been identified, the LEC1- type (LEC1 and L1L) and the non-LEC1 type. The genes LEC1-type genes are present in the genome of vascular plants and have seed-specific expression and encode proteins which form dimers with members of the NF- YC, possibly regulating genes involved in embryogenesis and seed maturation and fatty acids synthesis. In plants, only few studies have investigated the association mode of the subunits of this transcription factor, and the animal model is currently accepted. However, it is speculated that the “A” subunit has a negative regulatory function, and that the”B” and “C” subunits act in concert with other transcription factors and other regulatory proteins. In the present study, quantitative PCR analysis showed that five of the six genes encoding the subunit “A” are expressed during castor seed development, indicating that these genes have time and spatial expression compatible with the gene expression of LEC1-type, which may theoretically act as its molecular partners. The analysis of the interatome between members of subunit “A” and members of the subunits “B” and “C” shows that these factors act in a complex manner, with specific preferences of molecular partners. Unlike of currently accepted model, some members of the subunits A and C appear to form dimers. Moreover, it can be seen that LEC1 and L1L have not always coincident molecular partners, corroborating the hypothesis that their roles are not fully redundant.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) afetam significativamente a homeostase redox celular. No entanto, o peróxido de hidrogênio (H2O2), uma das ERO mais estudadas, é considerado regulador chave em uma série de processos fisiológicos, dependendo de sua concentração na célula: em baixas concentrações atua como molécula sinalizadora envolvida na aclimatação da planta a estresses, desencadeando tolerância a estresses bióticos e abióticos; por outro lado, em altas concentrações o H2O2 pode levar à morte celular. Gradientes de ERO e fitohormônios têm influência nas respostas de crescimento local e consecutivamente afetam o estado redox celular. Diversos fitohormônios afetam a sinalização redox celular controlando processos de crescimento e defesa. Os níveis de H2O2 intracelulares são controlados pela ação de diversas enzimas da classe das peroxidases e catalases. Dentre as peroxidases, a família de proteínas GPX pode ser encontrada em praticamente todos os reinos e vem sendo cada vez mais estudada em plantas. Em arroz, essa família é composta de cinco genes, enquanto em Arabidopsis foram identificados oito genes. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as GPX mitocondriais e cloroplastídica de arroz e sete dos oito genes de Arabidopsis thaliana. Mutantes knockout de Arabidopsis para os genes AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, AtGPX7 e AtGPX8 foram obtidos.Nesta espécie, pelo menos AtGPX2, AtGPX3 e AtGPX6 são necessárias para a correta formação da arquitetura da raiz dependente dos hormônios ABA, auxina e SL. O sileciamento por RNAi em arroz para os genes OsGPX1, OsGPX3 e OsGPX4 gerou plantas com crescimento deficiente de raiz, parte área e formação de panículas. A redução em 80% da expressão gênica da isoforma cloroplastídica (OsGPX4) foi letal para o desenvolvimento de plântulas regeneradas a partir de calos de arroz, enquanto que a redução da expressão de 40% e 95% de OsGPX1 (GPX1s) e OsGPX3 (GPX3s), respectivamente, não impediu a regeneração de plantas. No entanto, plantas GPX1s apresentaram menor tamanho, menor número de panículas e menor produção de sementes em comparação com as plantas NT (não transformadas). Adicionalmente, plantas GPX3s apresentaram redução do comprimento tanto da parte aérea quanto das raízes, além de acúmulo de H2O2 cerca de vinte vezes maior do que a planta NT. Neste trabalho, foi demonstrada a participação das enzimas GPX durante o desenvolvimento vegetativo e reprodutivo de plantas de arroz e o estabelecimento da arquitetura da raiz dependente de hormônios em Arabidopsis. O conjunto de dados obtidos contribuempara o entendimento do papel dessas enzimas na homeostase redox, como também na interação com fitohormônios nos processos de desenvolvimento e defesa vegetais. Reactive oxygen species (ROS) affect significantly cellular redox homeostasis. Hydrogen peroxide (H2O2), one of the most studied ROS, is considered a key regulator in a number of physiological processes dependent of its concentration in the cell: at low concentrations acts as a signaling molecule involved in plant acclimation to stress, triggering tolerance to biotic and abiotic stresses; on the other hand, at high concentrations can promote cell death. Gradients of ROS and phytohormones can influence the responses of local growth and consecutively can affect the cellular redox state. Several phytohormones affect redox signaling processes controlling cell growth and defense. The intracellular levels of H2O2 are controlled by the action of several enzymes like peroxidases and catalases. Among the peroxidases, the GPX family of proteins can be found in virtually all kingdoms and is being increasingly studied in plants. In rice, this family consists of five genes, while in Arabidopsis eight genes were identified. This study aimed to characterize functionally rice and Arabidopsis GPX genes. Arabidopsis thaliana nockout mutants for AtGPX1, AtGPX2, AtGPX3, AtGPX4, AtGPX6, and AtGPX7 AtGPX8 genes were obtained. In Arabidopsis, at least AtGPX2, AtGPX3 and AtGPX6 are necessary to hormone-dependent control of root achitecture formation. RNAi knockdown in rice of OsGPX1, and OsGPX3 OsGPX4 generated plants with shorter root and shoot lengths, and deficient panicle formation. An 80% gene expression reduction of the chloroplastic isoform (OsGPX4) was lethal, and impaired the regeneration of plants from rice calli, whereas the reduction of expression in 40% and 95% of OsGPX1 (GPX1s) and OsGPX3 (GPX3s), respectively, did not prevent plant regeneration. However, GPX1s plants were smaller and had fewer panicles and seed compared to NT (non-transformed) plants. Additionally, GPX3s plants showed reduced length of the shoot as roots and accumulation of H2O2 about twenty times greater than the plant NT. GPX participation during vegetative and reproductive development of rice plants and the hormone-dependent root arquitecture formation in Arabidopsis was demonstrated in this work. The data set obtained contributed to the understanding of the role of these enzymes in the redox homeostasis, as well as how the interaction with phytohormones in development processes and plant defense occurs.

Devido ao constante ataque à camada de ozônio, as plantas, nos próximos anos, terão que lidar cada vez mais com uma maior quantidade de luz UV atingindo a atmosfera terrestre. O arroz é considerado uma planta modelo para as monocotiledôneas por possuir um genoma relativamente pequeno (aproximadamente 390 Mb) e devido a sua grande sintenia com outros cereais. Recentemente, as proteínas E2F foram descritas, especialmente em vertebrados, como fatores transcricionais que podem estar envolvidos com a resposta ao dano de DNA. Tendo como objetivo principal estudar como a família de fatores transcricionais E2F responde ao dano genotóxico em arroz, experimentos com luz UV-B foram conduzidos para avaliar o envolvimento destes com as respostas ao dano de DNA. Além disso, foram realizadas análises filogenéticas dessa família gênica com representantes de plantas. Em arroz, estudos prévios de nosso grupo identificaram seis genes pertencentes à família E2F, sendo quatro E2F típicos e dois E2F atípicos. Em resposta à luz UV, dois dos quatro genes que codificam E2F típicos e os dois genes de E2F atípicos, tiveram a expressão relativa aumentada após o estresse em relação a plantas mantidas em condição controle. Nesse experimento, além dos genes E2F e dos genes de reparo, também foram avaliados os níveis de transcritos de genes sabidamente envolvidos com ciclo celular e apoptose, permitindo-se verificar se o aumento de expressão dos genes E2F em resposta ao estresse está efetivamente relacionado com a resposta a danos no DNA e não a estes dois outros processos celulares. As análises filogenéticas revelaram que um desses dois E2F típicos, que apresentou sua expressão diferencial nas condições testadas, provavelmente atue como um repressor de transcrição. Esta afirmação está baseada em estudos comparativos com sequências da planta modelo para as dicotiledôneas, Arabidopsis thaliana. O conjunto de resultados obtidos sugere que alguns membros da família E2F de arroz estão envolvidos especificamente com as repostas ao dano ao DNA, além de permitir a proposição de um possível mecanismo de ação. Due to the constant attack to the ozone layer, the plants, in the coming years, will have to deal with an increasing amount of UV light reaching the earth's atmosphere. Rice is considered a model plant for monocots due to its relatively small genome (approximately 390 Mb) and because its high synteny with other cereals. E2F proteins have recently been reported, especially in vertebrates, as transcriptional factors involved in the response to DNA damage. To study how the family of transcription factors E2F responds to genotoxic damage in rice, experiments with UV-B were conducted to evaluate their involvement with the responses to DNA damage. In addition, phylogenetic analyzes of this gene family in plants were performed. In rice, previous studies of our group identified six genes belonging to the E2F family, four typical and two atypical E2F. In response to UV light, two of four genes encoding typical E2F and the two atypical E2F genes increased their relative expression after stress compared to the plants grown in the control condition. In this experiment, in addition to the E2F gene and repair genes, we have also analyzed the transcriptional level of genes known to be involved with cell cycle and apoptosis, in order to verify if the increases in E2F gene expression, in response to stress, are actually related to the response to DNA damage, rather than to other two cellular processes. Phylogenetic analysis revealed that one of these two typical E2F, which showed differential expression under the conditions tested, probably acts as a transcriptional repressor. This analysis is based on comparisons with sequences from the model plant for dicots, Arabidopsis thaliana. These set of results suggest that some members of the E2F family of rice are involved specifically with responses to DNA damage and allowed the proposition of a possible mechanism of action.

O arroz é considerado o cereal mais tolerante ao alumínio (Al). Entretanto, a variabilidade entre os genótipos leva a uma considerável diferença quanto ao grau de tolerância para cultivares distintas. Diversos estudos mostram que plantas de arroz toleram o Al por intermédio de mecanismos internos e externos. Neste trabalho foi analisada a modulação da expressão da família gênica ASR (Aba, Stress and Ripening) em função do tratamento com Al. O gene ASR5 foi diferencialmente expresso em raízes de arroz tolerante ao Al (ssp Japonica cv Nipponbare). Entretanto, ASR5 não respondeu a exposição ao Al em raízes de arroz sensíveis ao Al (ssp Indica cv Taim). Plantas transgênicas silenciadas para os genes ASR apresentaram um aumento da sensibilidade ao Al. Calos embriogênicos de arroz transformados com a fusão ASR5-GFP revelaram que a proteína ASR5 localiza-se no núcelo e no citoplasma. Em protoplastos transformados, ASR5 localizou-se nos cloroplastos. Usando uma abordagem proteômica, comparando plantas não-transformadas e plantas ASR5_RNAi, um total de 41 proteínas com padrões contrastantes foi identificado. No intuito de identificar genes com expressão alterada pelo Al em arroz, e buscar genes afetados pelo silenciamento de ASR5, foi realizado o sequenciamento total dos transcritos utilizando plantas de arroz não transformadas e ASR5_RNAi em duas condições: controle e tratamento com Al. Essas análises transcriptômicas revelaram que 961 genes responderam ao Al em raízes de plantas de arroz não transgênicas submetidas ao Al. Nas plantas ASR5_RNAi, apenas 309 genes responderam ao tratamento com Al. Entretanto, apenas 52 desses genes se sobrepuseram quando comparados ao grupo de genes modulados em plantas não transformadas, sugerindo que a planta ASR5_RNAi perdeu a capacidade de regular um conjunto de genes. Além disso, análises de imunoprecipitação da cromatina seguida de sequenciamento em massa, revelaram que ASR5 liga-se ao promotor do gene STAR1, entre outros, regulando sua expressão em resposta ao Al. Os resultados mostram pela primeira vez que ASR5 atua como fator de transcrição em arroz e que está envolvido na regulação de genes responsivos ao Al conferindo tolerância frente à toxicidade do Al. Among cereal crops, rice is considered the most aluminium (Al) tolerant species. However, variability among rice genotypes leads to remarkable differences in the degree of Al tolerance for distinct cultivars. A number of studies have demonstrated that rice plants achieve Al tolerance through internal and external mechanisms. We have analyzed expression changes of the rice ASR (Aba, Stress and Ripening) gene family as a function of Al treatment. The gene ASR5 was differentially regulated in the Al-tolerant rice ssp Japonica cv Nipponbare. However, ASR5 expression did not respond to Al exposure in Indica cv Taim rice roots, which are highly Al-sensitive. Transgenic plants carrying RNAi constructs that targeted the ASR genes displayed increased Al susceptibility in T1 plants. Rice embryogenic calli expressing an ASR5-GFP fusion revealed that ASR5 was localized in both the nucleus and cytoplasm. In transformed protoplasts, ASR5-GFP appears in chloroplast cells. Using a proteomic approach to compare non-transformed and ASR5_RNAi plants, a total of 41 proteins with contrasting expression patterns were identified. In order to identify genes with differential modulation under Al stress in rice, and search for genes affected by ASR5 silencing, RNA-seq was made in non-transformed plants and ASR5_RNAi plants in control conditions and after Al treatment. These analyses revealed that 961 genes responded to Al in non-transformed rice roots under Al stress. A total of 309 genes responded to Al in ASR5_RNAi plants. Only 52 genes overlapped between non transformed and ASR5_RNAi plants when comparing genes modulated by Al, showing that ASR-silenced plants lost the ability to modulate a set of genes in response to Al treatment. Furthermore, ChIP-Seq analysis revealed that ASR5 can bind to the promoter of STAR1, among other genes, regulating its expression under Al stress. These results show for the first time that ASR5 act as a transcription factor in rice and that it regulates Al-responsive genes conferring tolerance in rice against Al toxicity.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular dessas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do peróxido de hidrogênio. Em arroz, a família APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplastidial. Este trabalho teve como objetivo caracterizar funcionalmente as ascorbato peroxidases citosólicas (APx1 e APx2) e peroxissomais (APx3 e APx4) de arroz, estudando o papel destas isoformas nos mecanismos de defesa das plantas. A estratégia utilizada foi a obtenção e caracterização de plantas silenciadas para diferentes genes por RNA de interferência (RNAi). O padrão de expressão global da planta silenciada para os genes de APx citosólicas, em comparação com a planta não-transformada, foi avaliado através de análises de microarranjo e proteômica. A análise das plantas silenciadas APx1/2s revelou a existência de um mecanismo de compensação, com alteração de parâmetros fotossintéticos, ativação de outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de peróxido de hidrogênio. As plantas silenciadas para os genes de APx peroxissomais apresentaram atraso no desenvolvimento da panícula e maior susceptibilidade à senescência. Os genes OsAPx3 e OsAPx4 são mais expressos em folhas. A isoforma APx4 apresentou expressão em folhas, raízes e panícula de arroz, principalmente nas regiões do sistema vascular. Estas análises mostram que as isoformas de APx de arroz possuem funções diferentes, relacionadas com o compartimento celular em que estão localizadas. As enzimas APx fazem parte do complexo sistema antioxidante vegetal e estes resultados visam contribuir para um melhor entendimento do papel de APx no metabolismo celular e na defesa da planta. The reactive oxygen species (ROS) are produced constantly by aerobic metabolism. In abiotic and biotic stress, the production is increased and ROS toxicity can cause several cellular damages. ROS also act as signaling molecules in the regulation of defense gene expression, senescence, programmed cell death, plant growth and development and other processes. Since ROS are toxic and also participate of signaling events, plant cells require mechanisms that tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is an antioxidant metabolism enzyme, which catalyzes the hydrogen peroxide scavenging. In rice, the APx family is formed by eight genes, which isoforms are characterized by their subcellular localization: cytosol, peroxisome, mitochondria and chloroplast. This work aimed to characterize at functional level the cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and the peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) ascorbate peroxidase encoding genes in rice, studying the role of their products in plant defense mechanisms. The general strategy used was to produce and to characterize plants silenced for different APx genes by RNA interference (RNAi). The global expression pattern of silenced plants for cytosolic APx, compared with the non-transformed plant, was analyzed by microarray and proteomics experiments. These revealed the existence of a compensatory mechanism, which include alterations in photosynthetic parameters, activation of other antioxidant enzymes and acclimation, possibly induced by higher levels of hydrogen peroxide. Plants silenced for peroxisomal APx genes showed a delay in panicle development and were more susceptible to senescence. The expression analyses revealed that OsAPx3 and OsAPx4 genes present higher expression in leaves. The APx4 isoform is expressed in leaves, roots and panicles of rice, mainly in the vascular system. These analyses showed that rice APx isoforms may play different functions related to the cellular compartment in which they are located. APx enzymes are part of the complex plant antioxidant system and these results may contribute to a better understanding of the APx role in the cellular metabolism and plant defense.

Fatores de transcrição WRKY de soja têm sido identificados e relacionados em resposta a estresses bióticos e abióticos. No entanto, em estudos anteriores, a família WRKY estava subestimada. Recentemente, o envolvimento dos genes WRKY em resposta a Phakopsora pachyrhizi, o agente causador de uma importante doença da soja, a Ferrugem Asiática, foi sugerido a partir de análise de dados de expressão gênica global. No presente estudo, a anotação completa da família WRKY de soja e a análise funcional de genes envolvidos na resposta à infecção por P. pachyrhizi foram realizada. A partir de buscas em bancos de dados do genoma da soja, genes WRKY foram anotados e aqueles envolvidos na resposta a P. pachyrhizi foram identificados usando quatro experimentos de expressão gênica global: superSAGE, RNA-Seq de lesões microdissecadas e dois microarranjos. O padrão de expressão gênica foi confirmado por RT-qPCR para oito genes. Embriões somáticos de soja foram transformados, visando a superexpressão ou silenciamento gênico, e plantas transgênicas foram desafiadas com P. pachyrhizi. Cento e setenta e oito genes WRKY foram anotados e 74 identificados como diferencialmente expressos durante a infecção pelo fungo. Em resposta a P. pachyrhizi, oito genes apresentaram expressão mais inicial e⁄ou mais forte no genótipo resistente quando comparado com o suscetível. Todos os oito genes analisados mostraram o pico de expressão nas primeiras 24 horas após a inoculação. Comparando a mineração de dados em resposta à infecção por P. pachyrhizi com o resultado do cladograma, um padrão de expressão similar pode ser observado em genes relacionados. Plantas superexpressando Glyma15g00570 não foram recuperadas. Provavelmente a expressão constitutiva deste gene afeta a regeneração das plantas. A participação de quatro genes homólogos em resposta ao patógeno foi demonstrada usando a técnica de RNAi. Quando infectada por P. pachyrhizi, folhas da linhagem silenciada mostraram maior número de lesões do que plantas não-transformadas. Em conclusão, neste trabalho a família WRKY de soja completa foi anotada e a participação de alguns membros em resposta a P. pachyrhizi foi demonstrada. Soybean WRKY transcription factors have been identified and related with the response to biotic and abiotic stresses. However the soybean WRKY family was underrepresented in previous studies. Recently, the involvement of WRKY genes in response to Phakopsora pachyrhizi, the causal agent of an important soybean disease - Asian Soybean Rust (ASR)- has been suggested by the analyses of global geneexpression data. In the present study a genome-wide annotation of soybean WRKY family and the functional analyzes of genes involved in response to P. pachyrhizi were performed. Following a search in the soybean genomic databases, WRKY-encoding genes were annotated and those involved in response to P. pachyrhizi were identified using global gene-expression experiments: superSAGE, RNA-Seq of microdissected lesions and two microarrays. Gene expression pattern was validated by RT-qPCR. Soybean somatic embryos were transformed aiming WRKY overexpression or silencing, and transgenic plants were challenged with P. pachyrhizi. One hundred-seventy-eight WRKY genes were annotated and 74 identified as differentially expressed during fungus infection. In response to P. pachyrhizi, eight genes were expressed earlier and⁄or stronger in a resistant genotype when compared to a susceptible one. All the eight analyzed genes showed the expression peak at the first 24 hours after inoculation. By comparing data mining in response to P. pachyrhizi infection with the clustering result, similar expression pattern could be observed in closely related genes. Plants overexpressing Glyma15g00570 were not recovered. Probably the constitutive overexpression of the gene may affect the regeneration of plants. The participation of four homologous genes in response to pathogen was demonstrated using RNAi approach. When infected by P. pachyrhizi, leaves of silenced transgenic line showed higher number of lesions than wild-type plants. In conclusion, the complete soybean WRKY family was annotated and the participation of some members in response to P. pachyrhizi was demonstrated.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de clima temperado que possui grande importância econômica mundialmente, sendo sua produtividade intimamente relacionada à saída do processo de dormência hibernal. Este processo pode ser definido como a incapacidade da planta iniciar o crescimento meristemático mesmo sob condições favoráveis e os mecanismos de controle molecular da dormência em macieiras ainda são pouco compreendidos. O objetivo do presente trabalho foi investigar o perfil gênico diferencial entre cultivares de macieiras contrastantes para requerimento de frio. As cultivares selecionadas foram Gala e sua mutante espontânea Castel Gala, as quais apresentam alto e baixo requerimento de frio, respectivamente. A técnica de hibridização supressiva subtrativa (SSH) permitiu a identificação de 28 genes candidatos à regulação da dormência. Análises de RT-qPCR foram realizadas visando a validação da expressão diferencial dos genes selecionados, assim como caracterizá-los transcricionalmente em três cultivares distintas durante um ciclo de crescimento e de dormência. Dos 28 genes candidatos, 17 apresentaram o mesmo perfil diferencial identificado por SSH. Um acúmulo sazonal de transcritos durante o inverno foi identificado para alguns genes e as cultivares de maior requerimento de frio apresentaram acúmulo de transcritos por mais tempo. Este perfil permitiu-nos sugerir que estes genes podem estar atuando na regulação dos processos de dormência e de aclimatação ao frio. Dos 17 genes validados, aqueles codificadores de proteínas DAM, desidrinas, GAST1, LTI65, NAC, histonas variantes H2A.Z e RAP2.12 apresentaram os maiores contrastes transcricionais entre as cultivares analisadas durante o inverno e constituem-se como fortes candidatos a participantes do processo de progressão da dormência em macieiras. Finalmente, a família de genes codificadores de desidrinas de macieira teve seus membros identificados e caracterizados transcricionalmente. Análises in silico permitiram a identificação de oito modelos gênicos preditos de desidrinas no genoma de macieira. As cadeias peptídicas deduzidas foram classificadas conforme a presença dos segmentos conservados YnSKn. Um perfil sazonal de regulação da expressão foi identificado, com a presença de um pico de acúmulo de transcritos durante o inverno, o que sugere a presença de um mecanismo similar de regulação entre genes de desidrinas de macieira. Apple tree (Malus x domestica Borkh.) is a temperate fruit crop of great economic importance worldwide and its productivity is related with the release from a bud dormancy process. This process is defined as the plant inability to initiate growth from meristems under favorable conditions and molecular information about dormancy control in apple trees is limited. The aim of the present work was to investigate the differential gene expression profiles between apple tree cultivars contrasting in chilling requirement for breaking dormancy. The selected apple cultivars were Gala and its derived bud sport Castel Gala, which displays high and low chilling requirement, respectively. A suppression subtractive hybridization (SSH) assay yielded 28 candidate genes putatively associated to dormancy cycling. RT-qPCR analyses were performed in order to validate the differential expression profiles and also to transcriptionally characterize the selected genes in three distinct apple tree cultivars during a growth to dormancy cycle. Among the 28 candidate genes, 17 confirmed the differential expression profile predicted by SSH. A seasonal transcript accumulation during the winter was identified to some genes, with high chilling requirement cultivars presenting higher levels of transcripts. This profile allowed us to suggest that these genes may be acting on dormancy regulation and cold acclimation. Out of the 17 candidate genes, those coding for DAM, dehydrins, GAST1, LTI65, NAC, histone variants H2A.Z and RAP2.12 displayed major differences in gene expression between cultivars through the winter and are strong candidates to play key roles on dormancy progression in apple trees. Finally, we identified and transcriptionally characterized the dehydrin gene family in apple trees. In silico analyses allowed us to identify eight predicted gene models for dehydrins in the apple genome. Deduced polypeptides were classified according to the presence of the conserved YnSKn segments. A seasonal regulation of gene expression was observed, with higher transcript accumulation during the winter. This data suggests that a similar mechanism of transcript regulation is acting through the apple dehydrin genes.

A ascorbato peroxidase (APX) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de espécies reativas de oxigênio (ERO) em plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APX. O presente estudo teve como objetivo avaliar o papel das enzimas de APXs em arroz, através da determinação das localizações subcelulares das diferentes isoformas, do estudo da expressão gênica e da caracterização detalhada do efeito do silenciamento das isoformas cloroplastídicas (chlAPXs) no metabolismo da planta, em condições normais e na resposta à estresses abióticos. A expressão diferencial das diferentes isoformas de APXs em condições de estresses abióticos varia entre as espécies e com a intensidade e duração do estresse. A localização subcelular de OsAPX1 e OsAPX2 no citosol, OsAPX3 e OsAPX4 nos peroxissomos, OsAPX5 no cloroplasto/mitocôndria, OsAPX6 na mitocôndria e OsAPX7 no cloroplasto foram confirmadas em protoplastos de arroz. Plantas duplamente silenciadas para os genes OsAPX7/OsAPX8 não apresentam alterações fenotípicas, no entanto possuem alterações no metabolismo antioxidante sob condições normais de crescimento. Análises proteômicas dessas plantas revelaram que várias rotas importantes foram afetadas, especialmente proteínas envolvidas com processos fotossintéticos. Plantas silenciadas submetidas a estresse de alta luz (HL) e metil viologênio (MV) mostraram que as chlAPXs são importantes na proteção antioxidante em arroz. Alterações como fotodanos, fotoinibição e bloqueio do transporte de elétrons foram observadas nas plantas silenciadas submetidas a estresses abióticos, gerando grandes distúrbios na atividade fotoquímica. No entanto, sob alta luz as chlAPXs parecem não serem essenciais para a proteção de fotodanos, fotoinibição e danos oxidativos dirigidos pela alta luz no fotossistema II. Plantas silenciadas e não-transformadas (NT) exibem diferenças na fotossíntese sob condições normais de crescimento, bem como quando submetidas a estresses abióticos. Ascorbate peroxidase (APX) is a major enzyme of the Reactive Oxygen Species (ROS) detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice eight genes encode APX. This study aimed to evaluate the role of APX enzymes in rice, through subcellular localization of the different isoforms, the study of gene expression and detailed characterization of chloroplastic APXs (chlAPXs) silencing in plant metabolism under normal conditions and in response to abiotic stresses. The differential expression of the different isoforms of APXs under abiotic stress conditions varies among species, and depends on the intensity and duration of stress. The subcellular localization of OsAPX1 and OsAPX2 in cytosol, OsAPX3 and OsAPX4 in peroxisomes, OsAPX5 in cloroplast/mitochondria, OsAPX6 in mitochondria and OsAPX7 in chloroplast were confirmed in rice protoplasts. Double silenced plants in OsAPX7/OsAPX8 genes did not show phenotypic changes; however presented alterations in the antioxidant metabolism under normal growth conditions. Proteomic analysis revealed that in theses plants several important pathways were affected, especially proteins involved with photosynthetic process. Silenced plants subjected to high light (HL) and methyl viologen (MV) stresses show that the chlAPXs are important in the antioxidant protection in rice. Alterations such photodamage, photoinhibition and obstruction of the electron transport were observed in silenced plants subjected to abiotic stresses, generating great disturbances in photochemical activity. However, under high light the chlAPXs appear not be essential to the protection of photodamage, photoinhibition and oxidative damage triggered by HL in photosystem II (PSII). Silenced and non-transformed (NT) plants exhibit differences in photosynthesis under normal growth conditions, as well as, when subjected to abiotic stress.

Peroxidases são enzimas amplamente distribuídas nos organismos, sendo de fundamental importância para o seu desenvolvimento. Atuam reduzindo o peróxido de hidrogênio à água, minimizando, assim, o dano celular em condições de estresse e modulando as respostas celulares que utilizam o peróxido de hidrogênio como molécula sinalizadora. Através de análises em bancos de depósito de genomas, uma provável nova heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related ou APx-R) foi identificada. APx-R é uma proteína exclusiva de plantas e está presente desde organismos basais, como algas, até angiospermas. Diferentemente de outras peroxidases, geralmente codificadas por pequenas famílias gênicas originadas a partir de eventos de duplicação, APx-R se apresenta como um gene cópia-única em todos os genomas de plantas já sequenciados e disponibilizados. Apesar de haver grande similaridade de estrutura proteica entre APx e APx-R, APx-R possui um grande número de substituições conservadas em domínios críticos, sugerindo que esta proteína provavelmente se originou de algum membro da família das ascorbato peroxidases, mas acumulou mutações suficientes de forma que não pode mais ser considerado um membro desta família. Para verificar a localização subcelular de APx-R, protoplastos de arroz foram transfectados com uma construção de fusão traducional APx-R::YFP, sob o controle do promotor 35S. A visualização da florescência foi feita através de microscopia confocal e revelou que APx-R é uma proteína de dupla-localização, a qual pode localizar-se tanto nas mitocôndrias quanto nos cloroplastos. Análises de BiFC mostraram que APx-R pode interagir com as APx presentes nos mesmos compartimentos subcelulares, indicando que estas proteínas podem estar atuando de forma sinérgica no metabolismo de detoxificação do peróxido de hidrogênio. Para caracterizar APx-R funcionalmente, mutantes de arroz superexpressando RNA de interferência objetivando silenciar o gene OsAPx-R foram obtidos através de transformação via Agrobacterium tumefaciens. As plantas RNAi-OsAPx-R apresentaram alterações no metabolismo do peróxido de hidrogênio quando comparadas às plantas não-transformadas, mostrando diferenças nas atividades de SoD. Cat e APx, suportando a provável participação de APx-R na defesa contra o estresse. Assim, estes resultados mostraram que OsAPx-R codifica uma proteína funcional, a qual está relacionada com o sistema antioxidante e é requerida na resposta a estresses, provavelmente atuando na proteção dos cloroplastos e mitocôndrias, ambas organelas com intensa formação de espécies reativas de oxigênio. Peroxidases are widely distributed in all organisms, being of fundamental importance for their development. These enzymes act reducing hydrogen peroxide into water, minimizing cellular damage in stressful conditions and modulating cell responses through hydrogen peroxide signaling. From analysis in public genomic databases, a putative new heme-peroxidase (ascorbate peroxidase-related or APx-R) was identified. APx-R is exclusive of plants and present from basal to vascular organisms. Unlike other peroxidases, usually encoded by large genic families originated from duplication events, APx-R is present as a single-copy gene in all available plant genomes. Despite the high structure similarity between APx and APx-R proteins, APx-R presents a great number of conserved substitutions in critical domains, suggesting that this protein probably emerged from the family of ascorbate peroxidases, but accumulated enough mutations so it cannot be grouped in this family anymore. To access subcellular localization, rice protoplasts were transfected with a translational fusion of yellow fluorescent protein (YFP) to APx-R protein under the control of the 35S promoter. Fluorescence visualization was performed by confocal microscopy and revealed that APx-R is a dual-target protein targeted to chloroplasts and mitochondrias. BiFc analysis showed that APx-R can interact with APx proteins which are present in the same subcellular compartments, indicating that these proteins may be acting synergistically in hydrogen peroxide scavenging metabolism. To further characterize APx-R in antioxidant metabolism, rice mutants expressing interference RNA for APx-R gene were obtained through Agrobacterium tumefaciens transformation. RNAi-silenced plants presented a disturbed hydrogen peroxide metabolism in comparison to non-transformed plants, with differences in SoD, Cat and APx activity, supporting the participation of APx-R in stress defense. Altogether, these results showed that OsAPx-R encodes a functional protein, which is related to the antioxidant system and required in stress response, probably acting in chloroplast and mitochondria protection, both organelles with intense reactive oxygen species formation.

A soja constitui uma das culturas mais importantes mundialmente, tanto social quanto economicamente. Consequentemente, informações moleculares sobre processos de desenvolvimento, bem como conhecimento detalhado das interações entre condições estressoras e a resposta da planta a fatores ambientais são necessários. A identificação e caracterização de genes que respondem a condições ambientais específicas constituem um passo inicial no entendimento dos processos adaptativos. Proteínas ricas em glicina (GRPs) são polipeptídeos contendo um grande número do aminoácido glicina em sua estrutura primária. Os genes codificantes de GRPs são regulados ao longo do desenvolvimento e regulados por auxina, ABA, frio, ferimentos, luz, ritmo circadiano, salinidade, seca, patógenos e encharcamento. Entretanto, há pouca informação sobre GRPs de plantas e seus papéis no desenvolvimento e resposta a estresses. As GRPs podem ser divididas em quatro classes (I, II, III, IV) de acordo com sua estrutura primária e presença de domínios característicos. A classe IV é composta por proteínas ligantes de RNA. Domínios adicionais permitem dividir a classe IV de GRPs em quatro subclasses (IVa, IVb, IVc, IVd). A subclasse IVc é representada por proteínas contendo um cold-schock domain (CSD) e dedos de zinco CCHC tipo retrovirais. O objetivo do presente estudo foi: (i) identificar e caracterizar os genes codificantes de classe IV de GRPs, (ii) verificar a padrão de expressão dos genes codificantes da subclasse IVc de GRPs e (iii) produzir plantas de soja transgênicas expressando o gene AtGRP2, o qual foi mostrado estar envolvido na floração e desenvolvimento da semente em Arabidopsis, e também poderia desempenhar um papel na aclimatação ao frio. Um total de 47 genes codificantes da classe IV de GRPs foi identificado no genoma da soja: 19 da subclasse IVa, sete da IVb, seis da IVc e 15 da IVd. Análises in silico indicaram uma expressão preferencial de todos os genes codificantes da subclasse IVc em tecidos em desenvolvimento. Análises de RT-qPCR revelaram que plantas jovens e maduras exibem uma expressão mais alta em folhas do que em outros órgãos, com exceção dos genes GRP2L_4/5 que tiveram expressão mais alta em sementes. GRP2L_4/5 e GRP2L_2 foram induzidos em resposta a baixas temperaturas. Sob estresse com ABA a expressão de todos os genes foi reprimida em folhas e/ou raízes, com exceção do gene GRP2L_2 que foi induzido em raízes. Em resposta a infecção com Phakopsora pachyrhizi, a expressão de GRP2L_2 e GRP2L_3 foi mais alta e precoce no genótipo suscetível quando comparada com o resistente, enquanto que a resposta de GRP2L_4/5 e GRP2L_6 foi mais tardia no genótipo resistente. Ainda, embriões somáticos secundários das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora de soja foram usados para introduzir o gene AtGRP2 no genoma da soja por bombardeamento e sistema bombardeamento/Agrobacterium. Seis eventos de transformação independentes foram confirmados por PCR. No presente momento as plantas estão em desenvolvimento em frascos de vidro. No presente estudo a classe IV de GRPs em soja foi identificada e caracterizada. Este é o primeiro passo para elucidar o papel destas proteínas em plantas. Molecular information on plant developmental process, as well as detailed knowledge of the interaction between stress conditions and plant response to environmental factors are essential for understanding the adaptive response. Glycine-Rich Proteins (GRP) have the amino acid glycine well represented in their primary structure. The genes encoding GRPs are developmentally regulated and induced by auxin, ABA, cold, wound, light, circadian rhythm, salinity, drought, pathogens, and flooding. However, there is scarce information about plant GRPs and its role on development and stress response. The GRPs can be divided into four classes (I, II, II and IV) according to their primary structure and the presence of characteristic domains. Class IV is composed by RNA-binding proteins. Additional domains permit to split class IV GRPs into four subclasses (IVa, IVb, IVc and IVd). Subclass IVc is represented by proteins containing a Cold-Shock Domain (CSD) and retroviral-like CCHC zinc fingers. The goal of the present study was: (i) to identify and characterize the genes encoding class IV GRPs, (ii) to verify the relative expression of genes encoding subclass IVc GRPs and (iii) to produce transgenic soybean plants expressing the AtGRP2 gene, which was shown to be involved in Arabidopsis flower and seed development, and can also play a role in cold acclimation. A total of 47 genes encoding class IV GRPs were found in the soybean genome: 19 from IVa, seven from IVb, six from IVc and 15 from IVd subclasses. In silico analyses indicated a preferential expression of all genes encoding subclass IVc GRPs in tissues under development. RT-qPCR analyses revealed that both young and mature plants exhibit relative higher expression of subclass IVc GRPs in leaves than in other organs, with exception of GRP2L_4/5 genes that have higher expression in seeds. The GRP2L_4/5 and GRP2L_2 were up-regulated in response to low temperatures. Under ABA stress the expression of all genes was down-regulated in leaves and roots, with exception of GRP2L_2 gene that was up-regulated in roots. In response to Phakopsora pachyrhizi infection, GRP2L_2 and GRP2L_3 expression was higher and earlier in the susceptible genotype when compared with that of the resistant one, while GRP2L_4/5 and GRP2_6 respond later in the resistant genotype. Furthermore, secondary somatic embryos of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora soybean cultivars were used to introduce the AtGRP2 gene into the soybean genome by particle bombardment and bombardment/Agrobacterium system. Six independent Bragg transformation events were confirmed by PCR. In the present moment the plants are under development in glass flasks. In the present study the soybean class IV GRPs were identified and characterized. This is the first step to elucidate the role of these proteins in plants.

A soja [Glycine max (L.) Merrill] é uma espécie da família Fabaceae que possui grande importância econômica mundial. A ferrugem asiática (ASR), causada pelo fungo Phakopsora pachyrhizi Sydow, tornou-se nos últimos anos uma das maiores ameaças às lavouras de soja ao redor do mundo. Cinco genes dominantes relacionados à resistência à ASR foram identificados. Entretanto, até o momento, nenhuma cultivar com resistência efetiva ao ataque pelo patógeno foi obtida, uma vez que todos os loci avaliados tiveram sua resistência quebrada por ao menos um isolado do fungo. A identificação de diversas fontes de resistência que possibilitem a construção de um “arsenal” contra a ASR no germoplasma comercial de soja, além do entendimento ao nível molecular dos mecanismos de defesa desta espécie contra P. pachyrhizi, podem contribuir significativamente no combate ao patógeno. Os fatores de transcrição WRKY são membros de uma superfamília com ampla distribuição no Reino Vegetal; embora suas funções regulatórias ainda não estejam bem definidas, inúmeros estudos realizados ao longo dos últimos anos têm reunido evidências de seu envolvimento nas respostas a ataques por patógenos. Estas requerem uma ampla reprogramação transcricional na célula vegetal, na qual fatores de transcrição WRKY parecem desempenhar um papel crucial no “ajuste-fino” da expressão de genes de defesa. O objetivo deste trabalho é caracterizar a função de dois genes da família WRKY em soja, envolvidos nas respostas ao ataque pelo fungo P. pachyrhizi, através de estratégias de genética reversa e estudos de expressão gênica. As seqüências genômicas e codificantes completas desses genes foram isoladas e identificadas respectivamente como GmWRKY20 e GmWRKY46. Vetores para sua superexpressão e silenciamento em soja foram construídos e os processos de transformação genética desta espécie foram realizados por bombardeamento ou via sistema integrado “bombardeamento/Agrobacterium”, nos quais embriões somáticos foram utilizados como tecido alvo. Além disso, a análise do perfil de expressão desses genes foi realizada em diversos tecidos, fases do desenvolvimento, condições de estresse salino e em resposta à infecção por P. pachyrhizi. Soybean [Glycine max (L.) Merrill] is one of the most important legume crop worldwide. In the past few years, Asian Soybean Rust (ASR), caused by Phakopsora pachyrhizi Sydow, has become one of the major threats affecting the main soybean producers. Even though five dominant genes related to ASR resistance have been identified, there has been no report of a soybean variety presenting effectiveness towards the pathogen’s attack, since the resistance ruled by every single one of these genes has already been overcome by at least one isolate around the world. The identification of resistance sources allowing the construction of an arsenal against ASR in commercial soybean germplasm, as well as the understanding of soybean’s defense mechanisms against P. pachyrhizi at the molecular level, may therefore be extremely helpful regarding the pathogen’s eradication. WRKY proteins belong to a superfamily of transcription factors with wide distribution amongst plants. Although their regulatory function is not yet clear, there have been several studies in the past few years raising evidences towards their involvement in pathogen’s attack responses. These responses usually require a wide transcriptional reprogramming in the plant cell, at which WRKY proteins seem to play a central role fine-tuning the expression of defense related genes. The purpose of this study is to functionally characterize two soybean WRKY proteinencoding genes involved in soybean defense against P. pachyrhizi, by combining reverse genetics strategies with gene expression tools. Their genomic and complete coding sequences (cds) were isolated and the genes were identified as GmWRKY20 and GmWRKY46, respectively. Besides, vectors for their silencing and overexpression in soybean were constructed and this plant species was genetically transformed by particle bombardment or by an integrated bombardment/Agrobacterium transformation system. Soybean somatic embryos were used as target tissue at both processes. In addition, an expression profile analysis of both GmWRKY20 and GmWRKY46 in several plant tissues and developmental stages as well as under salt stress and in response to P. pachyrhizi infection was accomplished.

Sementes de mamona (Ricinus communis) contêm grande quantidade de triacilglicerídios (TAGs) ricos em ácido ricinoléico (18:1OH), o qual é produzido pela conversão do ácido oléico (18:1) em ácido ricinoléico em uma reação catalizada pela enzima oleato hidroxilase (FAH12). Como resultado de suas propriedades físico-químicas, o óleo de mamona e seus derivados apresentam inúmeras aplicações industriais. A expressão heteróloga de FAH12 na oleaginosa modelo Arabidopsis thaliana resultou na produção de apenas 17% de ácidos graxos hidroxilados no óleo da semente. Este nível é muito inferior ao encontrado no óleo da mamona (90%), sugerindo que genes adicionais e maior conhecimento em relação à biossíntese de óleos em sementes são necessários antes de plantas serem manipuladas geneticamente visando a produção de óleos industrialmente importantes. Neste estudo, realizamos pesquisas no banco de dados genômico da mamona (http://castorbean.jcvi.org) com o objetivo de identificar genes da biossíntese de TAGs. No total, vinte e seis genes codificando seis distintas classes de enzimas envolvidas na biossíntese de TAGs foram identificados. A caracterização in silico e análises filogenéticas permitiram a identificação de isoformas plastidiais das famílias de enzimas glicerol-3-fosfato aciltransferase e ácido lisofosfatídico aciltransferase, envolvidas na rota procariótica da síntese de lipídios, que formam um cluster à parte das isoformas citoplasmáticas, envolvidas na rota eucariótica. Além disso, dois distintos polipeptídios da enzima diacilglicerol aciltransferase foram identificados. Adicionalmente genes codificantes das enzimas ácido fosfatídico fosfatase, fosfolipídio: diacilglicerol aciltransferase e colina fosfotransferase também foram identificados. A análise do padrão de expressão quantitativa demonstrou variação no perfil de expressão ao longo do desenvolvimento da semente de mamona tanto entre genes de diferentes classes de enzimas quanto entre genes de uma mesma classe de enzima. No geral, entretanto, existe uma tendência para um máximo nível de expressão nas fases intermediárias do desenvolvimento da semente, embora isso não tenha sido observado para todos os genes analisados. Os nossos resultados representam uma visão global da regulação da expressão de genes pertencentes a seis famílias enzimáticas envolvidas na biossíntese de TAGs em mamona ao longo do desenvolvimento da semente. Estes resultados podem vir a contribuir na escolha de possíveis genes-alvo para estratégias biotecnológicas que objetivem a produção de óleos desejáveis do ponto de vista nutricional e industrial. Castor bean (Ricinus communis) seed oil contains high amounts of ricinoleic acid (18:1OH) rich triacylglycerols (TAGs), which is produced by the conversion of oleic acid (18:1) to ricinoleic acid in a reaction catalyzed by the enzyme oleato hidroxilase (FAH12). As result of its physical and chemical properties, castor oil and its derivatives are used for numerous bio-based products. Heterologous expression of FAH12 in the model oilseed plant Arabidopsis thaliana produced only up to 17% of hydroxy fatty acids in seed oils. This level is much lower than that found in castor oil (90%), suggesting that additional genes and significantly more knowledge of seed oil biosynthesis are needed before plants could be engineered to produce industrially important oils. In this study, we survey the Castor Bean Genome Database (http://castorbean.jcvi.org) to report the identification of TAG biosynthesis genes. A set of twenty-six genes encoding six distinct classes of enzymes involved in TAGs biosynthesis were identified. Interestingly, in silico characterization and phylogenetic analysis allowed us to identify plastidic isoforms of glycerol-3-phosphate acyltransferase and lysophophatidate acyltransferase enzyme families, involved in prokaryotic lipid biosynthesis pathway, that form a cluster apart from the cytoplasmic isoforms, involved in eukaryotic pathway. Besides, two distinct membrane bound polypeptides of diacylglycerol acyltransferase enzyme were identified. Additionally genes encompasses phosphatidate phophatase, phospholipid:diacylglycerol acyltransferase and choline-phosphotrasferase were also identified. Quantitative expression pattern analyses demonstrated variations on gene expressions along the castor seed development as much among enzyme classes as into the genes of same enzyme class. In general, however, there is a tendency of maximum expression level at the middle of seed development, although this is not observed for all the genes analyzed. These results represent snapshots of global expression regulation of genes encompassing six enzyme families involved in castor bean TAG biosynthesis along seed development. These results can contributed for the choice of genes that will be target to biotechnological approaches for the production of nutritionally and industrially desirable oils.

A Floresta Atlântica e a Floresta Amazônica estão entre as maiores e mais diversas florestas tropicais do mundo, com muitas de suas espécies apresentando distribuição disjunta. O estudo genético molecular dessas espécies é interessante, pois podem fornecer informações sobre o relacionamento histórico entre essas diferentes regiões geográficas. Entretanto, ainda poucos são os estudos sobre a distribuição da estrutura genética nestas áreas, principalmente para espécies vegetais. O estudo da diversidade genética em espécies arbóreas é de grande importância para a manutenção das fontes de germoplasma a serem usados em práticas de reflorestamento e para espécies com uma ampla distribuição geográfica que ocupam diferentes habitats que são componentes chaves na composição de diversos ecossistemas. O gênero Schizolobium (Caesapinioideae) apresenta ampla distribuição nos Neotrópicos e devido ao seu rápido crescimento é amplamente utilizado em programas de reflorestamento, além de apresentar importância econômica pela utilização da madeira. O presente estudo apresenta a primeira análise genética molecular do gênero Schizolobium, incluindo uma ampla amostragem de populações ao longo de sua distribuição geográfica. Um conjunto de 11 marcadores moleculares (cpDNA e ITS) foram usados para investigar a evolução, posição sistemática, estimar o tempo de divergência entre as duas variedades, verificar um possível evento de especiação, estudar os padrões biogeográficos entre as florestas Atlântica e Amazônica, além de investigar a estrutura filogeográfica em Schizolobium. Marcadores não-neutros também foram estudados na tentativa de serem usados para investigar a variação adaptativa relacionada ao estresse hídrico. Sequências parciais dos genes P5CS de quatro espécies arbóreas (Schizolobium parahyba, Ceiba pentandra, Bombacopsis quinata e Cedrela Odorata) foram clonadas, seqüenciadas e comparadas com sequências de outras espécies. A análise filogenética indicou que eventos de duplicação ocorreram várias vezes e em diferentes frequências ao longo da evolução das monocotiledôneas e dicotiledôneas. Apesar de ter sido detectada seleção positiva em diferentes regiões do genes P5CS, uma pequena quantidade de polimorfismo foi encontrado entre indivíduos de Schizolobium e não foram correlacionados com estresse hídrico. A monofilia do gênero Schizolobium foi bem suportada pelas análises de maxima parsimônia e Baysiana das regiões de cpDNA e de DNA nuclear. A idade do clado Schizolobium foi estimado em aproximadamente 15,6 milhões de anos (Mya) e as duas variedades divergiram a aproximadamente 3,1 Mya. Um elevado nível de divergência genética foi observado entre as populações de Schizolobium e os resultados indicam uma forte estruturação filogeográfica e um reduzido fluxo gênico entre elas. Além disso, nenhum haplótipo nuclear e de cpDNA foi compartilhado entre as duas variedades, evidenciando um isolamento entre elas. Foi observada similaridade nas sequências de cpDNA entre indivíduos de algumas populações da var. parahyba na Mata Atlântica (RJ3, ES, BA1, BA2 e BA3) com indivíduos das populações da var. amzonicum, indicando a possibilidade da existência de retenção de polimorfismo ancestral com pouco tempo para o acúmulo de divergência nestas regiões. Todos os dados moleculares produzidos sugerem a separação das duas variedades dentro do gênero Schizolobium, e que a sua atual divisão taxonômica necessita de revisão. Esses dados também fornecem importantes informações genéticas que podem ser aplicadas no campo da conservação e florestamento exploratório. The Atlantic and the Amazon rain forests encompass the most diverse tropical forests in the world, with many species showing disjunct distribution. The molecular studies of widespread and disjunct species present particular interest, as they can provide information on the historical relationship between different geographical regions. However, there are few records about genetic structure in these areas mainly in plants species. Studies of genetic diversity of the tree species are very important to provide best practice policies for sourcing germplasm for reforestation within a range of degraded landscapes and for trees with a range of lifestyles that are key components of a diverse ecosystem composition. Schizolobium (Caesalpinioideae) is a widespread genus found in Neotropical forest, with a fast growing rate that make it extensively used in economically important reforestation programs that employ native trees. This study presents the first extensive molecular analysis within the genus Schizolobium, including a widespread sampling of populations from throughout their geographic distribution. A set of 11 molecular markers (cpDNA and nuclear) were used to address the evolution, systematic position, estimate the age of divergence between the two varieties, to study the biogeographic patterns between Atlantic and Amazonian rain forests and to investigate the phylogeographic structure of Schizolobium. Furthermore, non neutral markers were studied to attempt of access the adaptive variation in neotropical tree species. Partial sequences of P5CS genes from four Neotropical trees (Schizolobium parahyba, Ceiba pentandra, Bombacopsis quinata e Cedrela Odorata) were cloned and compared to those of other plant taxa. The molecular phylogenetic analysis indicated that P5CS duplication events have occurred several times following the emergence of flowering plants and at different frequencies throughout the evolution of monocots and dicots. Besides, positive selection was observed at different regions of P5CS paralogous genes, but a low polymorphism was found among individual of different areas and did not associate with water stress. The monophyletic nature of Schizolobium was well supported by both the Maximum Parsimony and Bayesian analyses of the cpDNA and nuclear regions. The Schizolobium crown node was estimated to have arisen 15.6 million years ago (Mya) and the two varieties has been diverged approximately 3.1 Mya. High levels of genetic divergence were found among the populations of Schizolobium and the results indicate a strong phylogeographic structure and a reduced gene flow between them. Besides, the cpDNA and nuclear haplotypes is not sharing between the two varieties, indicated a genetic isolation between them. The cpDNA sequence similarity of some populations from Atlantic forest (RJ3, ES, BA1, BA2 e BA3) with the var. amazonicum was observed and this may be due retention of ancestral polymorphisms with insufficient time for the accumulation of differences in these regions. The molecular data suggest the separation of the two varieties of genus Schizolobium, and current taxonomic status needs revision. These data also provides important genetic information for conservation.

A cultivar de videira Isabel Precoce é resultante de uma mutação somática espontânea de Isabel (Vitis labrusca L.) e se caracteriza pela antecipação em cerca de trinta e três dias na colheita. A cultivar Isabel Precoce possui maior uniformidade na maturação de seus frutos e, devido ao seu menor tempo de permanência no campo, está sujeita a menores riscos de ataque por patógenos ou intempéries que venham a assolar a produção. A utilização do modelo de estudo Isabel vs. Isabel Precoce na caracterização de genes associados ao processo de maturação poderá contribuir para a melhor compreensão do processo de amadurecimento do fruto, podendo gerar tecnologias para a obtenção de novas cultivares e/ou plantas transgênicas com características agronômicas melhores. O presente trabalho objetiva avaliar a expressão de genes relacionados com a maturação do fruto da videira, relacionando seus níveis de expressão com a característica de maturação precoce da cultivar mutante, utilizando a técnica da reação em cadeia da DNA-polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). A partir de extensa revisão bibliográfica, foram projetados vinte e três pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers) que permitem amplificar genes envolvidos no desenvolvimento do fruto. Esses genes potencialmente codificam fatores de transcrição, proteínas estruturais e proteínas do metabolismo secundário. Os genes que mostraram expressão diferencial, pelo menos em um dos tempos amostrados entre as cultivares, foram VvMYBPA1, VvFT, VvCTG1027667 (expansina) e VvBURP. Os dois primeiros codificam fatores de transcrição, enquanto os dois últimos são genes estruturais que participam da expansão celular e, possivelmente, do estabelecimento da morfologia do fruto, respectivamente. Esses genes são induzidos significativamente na cultivar mutante durante o desenvolvimento do fruto em pelo menos um dos estádios avaliados. Os genes VvMYBPA1, VvFT e VvBURP1 mostraram maior expressão durante a chamada “fase verde” de desenvolvimento do fruto, a qual é caracterizada pelo acúmulo de substâncias para as fases seguintes do desenvolvimento. Por outro lado, a expressão do gene VvCTG1027667 em Isabel Precoce é preferencialmente induzida durante a fase de maturação do fruto. Os demais genes não tiveram padrão de expressão conservado entre as safras analisadas, indicando que a modulação da sua expressão é fortemente afetada pelas condições ambientais e, portanto, parecem não participar da determinação do fenótipo de maturidade precoce da cultivar mutante. Este trabalho é o primeiro a descrever uma variante somática de videira com desenvolvimento precoce de frutos. Os resultados obtidos podem orientar estudos funcionais, oferecendo oportunidades para a investigação de diversos aspectos do desenvolvimento do fruto da videira. Grapevine cultivar Isabel Precoce is the result of a spontaneous somatic mutation of cultivar Isabel (Vitis labrusca L.) and is characterized by the thirty-three day antecipation in harvest. Isabel Precoce exhibits a more uniform berry ripening pattern and due to shorter life cycle the risks of pathogen attack and unfavorable weather conditions are reduced. The use Isabel vs. Isabel Precoce as a model system to characterize genes associated to the maturation process may contribute to a better understanding of fruit ripening process, as well as, to generate technologies to obtain new cultivars and/or transgenic plants with improved agronomic traits. This study aims to investigate the expression profile of genes associated to grapevine berry ripening, by comparing the precocious berry ripening mutant and its wild-type counterpart using quantitative real-time DNA polymerase chain reaction (qRT-PCR). After literature review, twenty-three pairs of primers were selected to amplify genes involved in fruit development. These genes putatively encode transcription factors, structural proteins and proteins of secondary metabolism. The genes that showed differential expression in at least one of the sampling dates between cultivars were VvMYBPA1, VvFT, VvCTG1027667 (expansin) and VvBURP. The first two encode transcription factors, while the latter two are structural genes involved in cell expansion and possibly, in establishing fruit morphology, respectively. These genes are significantly induced in the mutant, at least in one of the stages evaluated. Genes VvMYBPA1, VvFT and VvBURP1 showed higher expression during “green fruit” phase, which is characterized by the accumulation of substances for the following phases of development. Moreover, VvCTG1027667 expression is induced during fruit ripening. The expression pattern of the other genes were not maintained throughout seasons, indicating that it strongly affected by environmental conditions and, thus, do not appear to participate in determining the phenotype. This report is the first description of a grapevine somatic variant showing precocious berry development. The data obtained here will provide initial clues to guide further functional studies on fruit development and it will provide opportunities to investigate various aspects of fruit development in grapevine.

O número de genes atualmente identificados no genoma do arroz (Oryza sativa ssp japonica) é de cerca de 32.000. Graças aos esforços de diferentes grupos ao redor do globo, o papel de muitos desses genes é melhor compreendido no momento. A função de um gene pode ser inferida principalmente pela análise de seu padrão de expressão, da estrutura da proteína codificada e pela análise de mutantes nos quais o gene se encontre interrompido, silenciado ou super-expresso. Para esse propósito, nosso grupo de pesquisa vem desenvolvendo linhagens transgênicas pela inserção de uma construção de T-DNA baseada no sistema de transposons de dois componentes iAc/Ds. Uma dessas linhagens (Ds72) apresenta estatura reduzida e sua inserção de T-DNA interrompe um locus, cuja função gênica ainda é desconhecida. O objetivo desse trabalho é a identificação e caracterização desse gene, que denominamos de OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). Para tal, analisamos a linhagem mutante, a estrutura da proteína prevista, as possíveis relações filogenéticas com outros genes e o padrão de expressão desse gene. Em paralelo, induzimos a mobilização do elemento Ds da sua inserção original no T-DNA da linhagem original para gerar novas linhagens mutantes. A proteína codificada por esse gene contém um motivo de associação a metais pesados e um sítio de prenilação. Identificamos esse gene como um membro de um ramo até agora desconhecido da família das Proteinas Farnesiladas (FP), proteínas preniladas que se ligam a íons metálicos. Nossas análises mostram que a expressão de OsPMBP1 é semelhante em raízes e na porção aérea de plântulas, porém, em condições de excesso de alumínio, a expressão nesses órgãos se altera, sendo induzida em folhas e caules enquanto que em raízes é reprimida. Outros genes da família FP também respondem à estresses por excesso de íons metálicos, e foram caracterizados como diretamente envolvidos no transporte e/ou detoxicação de metais pesados. Em condições normais, esse gene parece ser regulado pelo relógio circadiano, sendo um gene de expressão tardia, com pico de expressão próximo ao entardecer. A análise detalhada da linhagem Ds72 indicou que não há ligação entre o fenótipo observado e a inserção de T-DNA. Os dados obtidos demonstram que OsPMBP1 pode estar envolvido na resposta a estresse por metal pesado ou no transporte desses íons, porém ainda são necessários mais estudos para melhor entender a função desse gene na planta. The current number of identified genes in the rice genome (Oryza sativa ssp japonica) is about 32,000. Thanks to the efforts of different researchers around the world, the role of many of these genes is currently better understood. The gene function can be inferred mainly by the analysis of its expression pattern, the structure of the encoded protein and by the analysis of mutants where the gene is interrupted, silenced or over-expressed. For that purpose, our research group has developed transgenic lines by the insertion of a T-DNA construction that is based on the two-component iAc/Ds system of transposons. One of these lines shows reduced height and has the T-DNA tag interrupting a locus, whose gene function is yet unknown. The aim of the present study is the identification and characterization of this gene, which we named as OsPMBP1 (Prenylated Metal Binding Protein 1). For that, we analyzed the mutant line, the predicted protein structure, the filogenetic relationship with others proteins, and its expression pattern. In parallel, we induced the mobilization of the Ds element from the original T-DNA insertion to generate new mutant lines. OsPMBP1coded protein has a heavy metal associated domain (HMA) and a prenylation site. We identified this gene as a member of an unknown branch of the Farnesylated Proteins family (FP), composed mostly of prenylated metal binding proteins. Ours analyses showed that the OsPMBP1 expression is equivalent in seedling roots and shoots, but, under aluminum excess, its expression change in these organs, it was inducted in the shoots and repressed in the roots. Others genes of the FP family also respond to metallic ion stresses and have been characterized as directly involved in heavy metal transport and detoxification. In normal conditions, this gene is apparently regulated by the circadian clock, with expression apices close to the evening/dusk interface. The detailed analysis of the Ds72 line indicated that there isn’t a relationship between the observed phenotype and the T-DNA insertion. The data showed that OsPMBP1 may be involved in the response to heavy metal stress or in its transport, but more analyses are required to a better understanding of the role of this gene in the plant.

ERO são produzidas continuamente por organismos aeróbicos. Em situações de estresse, a produção de ERO é aumentada, podendo causar a morte celular. Para manter uma concentração ideal de ERO dentro da célula, as plantas desenvolveram um complexo sistema antioxidante para proteção das membranas celulares e organelas contra os efeitos danosos causados pela ação dessas ERO sobre os tecidos vegetais. A ascorbato peroxidase (APx) é uma das principais enzimas do sistema de detoxificação de ERO nas plantas, catalisando a conversão do peróxido de hidrogênio em água, usando o ascorbato como doador de elétrons. No arroz, oito genes codificam APx. As diferentes isoformas são classificadas de acordo com a localização subcelular em citosólicas (APx1 e APx2), peroxissomais (APx3 e APx4), mitocondriais (APx5 e APx6) e cloroplastídicas (APx7 e APx8). O desenvolvimento do presente trabalho teve como objetivo geral caracterizar funcionalmente os genes de APx em arroz (Oryza sativa) com o intuito de identificar a função dos diferentes membros dessa família no controle dos níveis de ERO na planta. Foi analisado o padrão de expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de APx em arroz cultivado sob condições de estresses abióticos tais como o tratamento com concentrações tóxicas de alumínio, frio, seca e exposição ao peróxido de hidrogênio exógeno. Utilizando a estratégia de silenciamento por RNA de interferência (RNAi), foram produzidas construções para o silenciamento simultâneo dos genes OsAPx5 e OsAPx6 e, também, para os genes OsAPx7 e OsAPx8. Adicionalmente, foram ainda geradas construções gênicas para o silenciamento individual dos genes OsAPx7 e OsAPx8. Linhagens de arroz contendo construções RNAi para o silenciamento individual de OsAPx7 e OsAPx8 apresentaram redução de cerca de 90% na expressão relativa destes genes quando comparadas com plantas nãotransformadas. Os oito membros da família gênica APx em arroz mostraram padrão de expressão diferencial frente às condições de estresse testadas, indicando um complexo modo de regulação desses genes. Aerobic organisms continuously produce Reactive Oxygen Species (ROS). Under stress conditions ROS production is increased and can lead to cellular death. To keep the ideal concentration of ROS inside the cells, plants developed a complex antioxidant system to protect cellular membranes and organelles against harmful effects produced by the action of these ROS. Ascorbate peroxidase (APx) is a major enzyme of the ROS detoxification system in plants, catalyzing the conversion of hydrogen peroxide into water using ascorbate as electron donor. In rice (Oryza sativa), eight genes encode APx. The different isoforms are classified according to their subcellular localization in cytosolic (APx1 and APx2), peroxisomal (APx3 and APx4), mitochondrial (APx5 and APx6) or chloroplastidic (APx7 and APx8). The general aim when developing the present work was to functionally characterize the APx genes in rice in order to identify the function of different members of this family in the control of ROS levels in the plant cell. The expression pattern of genes encoding different isoforms of APx in rice was analyzed when plants were grown under abiotic stress conditions such as under the treatment with toxic concentrations of aluminum, cold, drought and exposition to exogenous hydrogen peroxide. Using the strategy of gene silencing by interference RNA (RNAi), were produced RNAi constructs to simultaneously silence the OsAPx5 and OsAPx6 genes, and also the OsAPx7 and OsAPx8 genes. In addition, it was produced constructs to individually silence the OsAPx7 and OsAPx8 genes. Rice lines carrying RNAi to silence OsAPx7 and OsAPx8 individually presented reduction of gene expression of about 90% when compared to the expression assayed in non-transformed plants. The eight genes coding APx presented different expression patterns in response to the stress conditions tested, indicating that these genes are under a complex mode of regulation.

Um dos graves obstáculos para a manutenção e estabilidade da produção nacional de arroz (Oryza sativa) reside na susceptibilidade dos genótipos existentes a estresses abióticos. Tendo em vista a importância social e econômica do arroz e os efeitos extremamente danosos desses estresses sobre a agricultura, o conhecimento detalhado das interações entre os estresses abióticos e as respostas dos vegetais frente a esses estímulos ambientais faz-se necessário. O alumínio (Al) é considerado um dos principais fatores limitantes na produção agrícola, inibindo o crescimento das raízes e a absorção de minerais. A toxicidade do Al em plantas ocorre pela sua solubilização em solos com pH baixo ou solos ácidos. Os genes ASR (ABA, Stress and Ripening) são induzidos por estresse e ácido abscísico (ABA) em plantas, e seus níveis de expressão são rapidamente aumentados em resposta à salinidade e seca. Recentemente, foi demonstrado que o gene que codifica a proteína ASR5 é responsivo ao Al em raízes de arroz. Apesar do arroz ser considerado um dos cereais mais resistentes a Al, os mecanismos básicos de tolerância a este metal são pouco conhecidos no arroz em comparação a outros cereais. Por meio do presente trabalho objetivamos: i) a caracterização funcional dos membros da família gênica ASR de arroz em reposta ao Al; e ii) a construção de vetores binários de transformação de plantas visando o estudo da localização subcelular da proteína codificada pelo gene OsASR5, e o silenciamento gênico da família ASR de arroz. As análises dos transcritos por qRT-PCR mostraram que todos os genes da família ASR de arroz ssp Japonica respondem ao Al. Por outro lado, OsASR5 não sofre modulação de sua expressão em resposta ao Al em raízes de arroz ssp Indica. Essas diferenças de respostas dos genes OsASR5 em distintas variedades pode refletir diferenças no grau de tolerância ao Al de cada um desses genótipos. One of the major obstacles to maintain the stability of the national production of rice (Oryza sativa) lies on the susceptibility of the different genotypes to abiotic stress. In view of the social and economic importance of rice and due to the extremely harmful effects of stress in agriculture, detailed knowledge of the interactions between these stresses and plant responses to environmental stimuli is necessary. Aluminum (Al) is considered one of the main limitation factors for agricultural productivity, inhibiting root growth and mineral absorption. Al toxicity occurs by its solubilization in soils with low pH or acid soils. The ASR (ABA, Stress and Ripening) genes are induced by stress and abscisic acid (ABA) in plants, and their expression levels are quickly increased in response to salinity and drought. Recently, it was demonstrated that the ASR5 gene is responsive to Al in rice roots. Despite the fact that rice is considered one of the most resistant crops to Al, the basic mechanisms of tolerance to this metal are poorly known when compared to other crops. This study aimed the functional characterization of the gene expression of rice ASR family members in response to Al, and the construction of binary vectors for the subcellular localization of the protein codified by the OsASR5 gene, and the construction of a gene silencing binary vector for the ASR family. Analyses of transcripts by qRT-PCR showed that in the ssp Japonica, all ASR genes responded to Al. In contrast, OsASR5 do not suffer expression modulation in response to Al in rice roots of ssp Indica. These differences in response of the OsASR5 gene in distinct varieties may reflect differences in the degree of Al tolerance in each genotype.

Visando o aumento da resistência a fungos patogênicos, o presente trabalho foi realizado com o objetivo de introduzir o gene SnOLP, que codifica uma osmotina de Solanum nigrum var. americanum, em cultivares de soja. A estratégia escolhida foi a transformação por biobalística, utilizando o plasmídeo pCL1390-UBQ3-SnOLP, que contém o gene SnOLP e o gene hpt II, que confere resistência ao antibiótico higromicina. Conjuntos de embriões somáticos globulares das cultivares IAS-5, Bragg e BRSMG 68 Vencedora foram utilizados como alvo. Os conjuntos bombardeados foram transferidos para meio seletivo visando obter material estavelmente transformado. Os conjuntos higromicinaresistentes correspondendo a cinco, 12 e 13 eventos de transformação independentes nas cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram sequencialmente transferidos para meio de proliferação D20 (sem higromicina), maturação (MSM6) e regeneração (MSO). Um total de 114, 70 e 211 embriões histodiferenciados das cultivares Bragg, IAS-5 e BRSMG 68 Vencedora, respectivamente, foram obtidos. A partir destes, foram regeneradas oito plantas da cultivar IAS-5, correspondentes a três eventos de transformação independentes e 30 plantas da cultivar Bragg, de um evento de transformação. Nenhuma planta da cultivar BRSMG 68 Vencedora foi regenerada. Em conseqüência de um acidente, foram recuperadas apenas duas plantas adultas de IAS-5, cada uma proveniente de um evento de transformação independente e 12 plantas de Bragg, todas do mesmo evento de transformação. A presença do transgene nas plantas foi detectada por PCR e a expressão da proteína recombinante através de Western blot. A herança do transgene seguiu o padrão Mendeliano, para um gene dominante, na linhagem I4 de IAS-5. As progênies das plantas transgênicas de Bragg apresentaram uma segregação excepcional, com deficiência de plantas transformadas. Resultados preliminares dos bioensaios utilizando extratos protéicos totais não mostraram atividade antifúngica dessas plantas transgênicas. Aiming to enhance resistance to fungal pathogens, the present work was carried out with the objective of introducing a gene (SnOLP) coding an osmotinlike protein from Solanum nigrum var. americanum in soybean cultivars [Glycine max (L.) Merrill]. Biolistic transformation was the strategy elected, using the plasmid pCL1390-UBQ3-SnOLP, which contain the SnOLP gene and the selectable marker hpt II gene. Somatic globular embryo clusters of IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars were used as target tissues. Bombarded embryo clusters were transferred to selective medium containg hygromycin, aiming to obtain stable transformed material. Hygromycin-resistant embryogenic clusters corresponding to five, 12 and 13 independent transformation events of Bragg, IAS-5 and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively, were sequentially transferred to proliferation D20 (without hygromycin), maturation and regeneration media. A total of 70, 114 and 211 histodifferentiated embryos were obtained from IAS-5, Bragg and BRSMG 68 Vencedora cultivars, respectively. Eight plants corresponding to three independent transformation events were recovered for cultivar IAS-5 and 30 plants from one transformation event for Bragg cultivar. No one plant for BRSMG 68 Vencedora cultivar was regenerated. As a consequence of an accident, only two adult plants for IAS-5 cultivar, each one proceeding from an independent transformation event and 12 plants for Bragg, all them from the same transformation event, were obtained. The integration and expression of the SnOLP transgene into the genomes of transformed plants were confirmed by PCR and Western blot. The I4 progeny from IAS-5 cultivar segregated as a single dominant locus as predicted by Mendelian principles. The transgenic Bragg progenies segregated in an exceptional manner, with fewer SnOLP-positive plants. Preliminary bioassays using total protein extracts of transgenic plants did not show antifungal activity.

O ferro é um micronutiente essencial em plantas, como também para praticamente todos os demais organismos. Porém, as formas livres de ferro intracelular podem ser extremamente danosas. A proteína ferritina tem papel crucial neste contexto, com a função de acumular ferro de uma forma segura e biodisponível. Cada proteína pode acumular aproximadamente 4500 átomos de ferro em sua cavidade interna. Em plantas, existe um número variado de cópias gênicas para ferritina e estas cópias têm expressão modulada por fatores bióticos e abióticos. No genoma do arroz foram caracterizadas duas cópias para o gene da ferritina. Como existem poucos estudos funcionais para ferritina em arroz, este trabalho teve como objetivos: (a) silenciar as duas cópias da ferritina da subespécie japonica variedade Nipponbare; (b) caracterizar, por PCR, mutantes para ferritina por inserção do retroelemento TOS17; (c) caracterizar a expressão da ferritina da subespécie de arroz japonica, variedade Nipponbare, em plantas cultivadas em meio hidropônico sob excesso de ferro. Utilizando o sistema Gateway (Invitrogen) nós desenvolvemos uma construção que expressa um RNA em grampo projetado para silenciar ambas as cópias dos genes da ferritina de arroz. Baseando-se em um protocolo bem estabelecido de regeneração de plantas transgênicas de arroz, nós regeneramos plantas transgênicas silenciadas para os genes da ferritina. Foi obtido 75% de sucesso na geração das plantas silenciadas, o que está de acordo com a literatura. Os transformates primários (T0) não apresentaram anormalidades morfológicas evidentes. É possível que uma rota compensatória para armazenar ferro de forma segura seja ativada quando os níveis de ferritina são diminuídos. Além disso, as plantas produzidas neste trabalho são uma ferramenta potencial para estudar a relação ferro-planta. Baseando-se em análises in silico e por PCR, nós caracterizamos três linhagens mutantes contendo inserção do retroelemento TOS17 no gene OsFer2, entretanto, ainda não identificamos mutantes homozigotos. Em plantas de arroz crescidas em meio hidropônico, o aumento da concentração de ferro resultou em maiores níveis de expressão de ferritina, avaliados por RT-PCR semi-quantitativo, após 6 h e 12 h de exposição aos tratamentos de 50 e 500 ppm de FeSO4 do que na condição controle (5,6 ppm). Iron is an essential micronutrient for plants, as for virtually all organisms. However, free intracelular iron forms can be extremely dangerous. The ferritin protein has a crucial role in this context, storing iron in a safe and bioavailable form. Each protein molecule can accumulate about 4500 iron atoms in its internal cavity. In plants, there is a variable number of ferritin gene copies and their expression is modulated by biotic and abiotic factors. There are two copies of the ferritin gene in the rice genome. As there are few functional studies for the ferritin genes in rice, this work had the objetives of: (a) to silence both copies of the ferritin genes in the japonica Nipponbare variety; (b) to identify and characterize TOS17 insertional mutants for the ferritin genes using in silico and PCR essays; (c) to characterize the expression of ferritin in the japonica Nipponbare variety under iron stress conditions. Using the Gateway system we generated a construct that expresses a hairpin RNA designed to silence both rice ferritin gene copies. Based on a well-established protocol to regenerate transgenic plants, we developed transgenic ferritin silenced lines. We obtained 75% success in generating rice silenced lines against ferritin. The primary transformants (T0) had no clear morphological abnormalities. It is possible that a compensatory pathway to store iron in a safe form can be induced when levels of ferritin are downregulated. Furthermore, the plants generated in this work are a potential tool to study iron-plant relations. Based on in silico and PCR essays we characterized three TOS17 insertional mutant lines for the OsFer2 gene, but until now we could not identify TOS17 homozygous mutants. In rice plants grown in hydroponic culture, increasing iron concentrations resulted in higher expression levels of ferritin, evaluated by semi-quantitative RT-PCR, after 6h and 12h exposure to 50 and 500 ppm of FeSO4, than in the control treatment (5,6 ppm).

As espécies reativas de oxigênio (ERO) são produzidas constantemente pelo metabolismo aeróbico. Em situações de estresse biótico ou abiótico, a produção é aumentada e a toxicidade das ERO pode conduzir a diversos danos celulares. As ERO atuam também como moléculas sinalizadoras regulando a expressão de genes de defesa a estresses, senescência, morte programada da célula, crescimento e desenvolvimento da planta, entre outros processos metabólicos. Uma vez que as ERO são tóxicas e também participam de eventos de sinalização, as células vegetais requerem mecanismos que regulem finamente a concentração intracelular destas moléculas. A ascorbato peroxidase (APx) é uma enzima fundamental do metabolismo antioxidante, catalisando a decomposição do H2O2. Em arroz, a APx é codificada por oito genes, cujas isoformas são caracterizadas por sua localização subcelular: citosólica, peroxissomal, mitocondrial ou cloroplástica. O objetivo deste trabalho foi caracterizar funcionalmente as APx citosólicas (OsAPx1 e OsAPx2) e peroxissomais (OsAPx3 e OsAPx4). A estratégia utilizada foi o silenciamento pós-transcricional por RNA de interferência (RNAi) dos genes individualmente e de ambos os genes codificantes de isoformas do mesmo compartimento subcelular. A redução da expressão de cada gene, assim como de ambos os genes de um compartimento, resultou na produção de diferentes sinais. As plantas RNAi mostraram diferentes fenótipos e padrões de expressão transcricional dos genes da família OsAPx. Analisando as plantas silenciadas para os genes OsAPx1 e OsAPx2 sob estresse com radiação UV e altas doses de alumínio, foi observada compensação por outras enzimas antioxidantes e aclimatação, possivelmente sinalizados pelos níveis mais elevados de H2O2. Estes resultados indicam que cada isoforma de OsAPx pode apresentar funções específicas na célula. Reactive Oxygen Species (ROS) are continually produced by aerobic metabolism. Under biotic and abiotic stresses, the production is enhanced and the ROS toxicity can lead to cell damage. ROS act also as signalling molecules and are able to regulate the expression of resistance genes, senescence, programmed cell death, plant growth and development, among other metabolic processes. By the fact that ROS are cytotoxic and make part of signalling events, plant cells need mechanisms to tightly regulate the intracellular concentration of these molecules. Ascorbate peroxidase (APx) is a fundamental enzyme of the antioxidant metabolism, it catalyses the H2O2 decomposition. In rice, APx are encoded by a small multigene family, and the different isoforms are classified according to their subcellular localization: cytosolic, peroxisomal, mithocondrial or chloroplastic. The present work aimed to characterize the function of cytosolic (OsAPx1 and OsAPx2) and peroxisomal (OsAPx3 and OsAPx4) APx isoforms. The strategy was the post-transcription silencing by interference RNA (RNAi) of single genes and both genes of the same subcellular localization. The reduced expression of each gene or both genes from the same compartment resulted in the development of different signals. RNAi plants showed changes in the phenotype and in the transcriptional expression of the OsAPx gene family. The analyses of OsAPx1 and OsAPx2 silenced plants under stresses with UV radiation and aluminum revealed that the lack of APx was compensated by other antioxidant enzymes and the acclimation could be signaled by the increased level of H2O2. These results indicate that each isoform of APx should have specific functions in the cell.