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Nosocomial pathogens can cause life-threatening infections in neonates and immunocompromised patients. E. bugandensis (EB-247) is a recently described species of Enterobacter, associated with neonatal sepsis. Here we demonstrate that the extended spectrum betha-lactam (ESBL) producing isolate EB-247 is highly virulent in both Galleria mellonella and mouse models of infection. Infection studies in a streptomycin-treated mouse model showed that EB-247 is as efficient as Salmonella Typhimurium in inducing systemic infection and release of proinflammatory cytokines. Sequencing and analysis of the complete genome and plasmid revealed that virulence properties are associated with the chromosome, while antibiotic-resistance genes are exclusively present on a 299 kb IncHI plasmid. EB-247 grew in high concentrations of human serum indicating septicemic potential. Using whole genome-based transcriptome analysis we found 7% of the genome was mobilized for growth in serum. Upregulated genes include those involved in the iron uptake and storage as well as metabolism. The lasso peptide microcin J25 (MccJ25), an inhibitor of iron-uptake and RNA polymerase activity, inhibited EB-247 growth. Our studies indicate that Enterobacter bugandensis is a highly pathogenic species of the genus Enterobacter. Further studies on the colonization and virulence potential of E. bugandensis and its association with septicemic infection is now warranted.

Lasso peptides, such as microcin J25, BI-32169, lariatin and capistruin, are a structurally unique and pharmacologically relevant class of RiPPs (ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptides) natural products. Compared with other intensively modified RiPPs, such as lantibiotics, lasso peptides only have a unique knotted topology in which the tail of the peptide is threaded through an N-terminal macrolactam ring and trapped by steric hindrance of bulky side chains stabilizing the entropically disfavored lasso structure. Except for this unusual knot structure, further posttranslational modifications on lasso peptides are very rare. Besides, lasso peptides have so far only been isolated from Proteo- and Actinobacterial sources. In this thesis, the lasso gene cluster from the Firmicute P. dendritiformis was investigated. Paeninodin, a new lasso peptide with an unusual phosphorylation at the side chain of the last serine was discovered by expression of this cluster in a heterologous host. The Paeninodin lasso peptide was isolated from a culture pellet. Mass spectrometric, carboxypeptidase Y assays and IM-MS studies proved paeninodin to be a new representative of lasso peptides. Morever, the biosynthetic pathway of modified lasso peptide was delineated through in vivo and in vitro studies. The kinase turned out to be a novel lasso peptide precursor kinase with wide substrate specificity. These results provide a way for the generation of novel lasso peptide analogs and, thereby, would facilitate lasso peptide engineering in the future.

National audience

The nonheme iron oxygenase VioC from Streptomyces vinaceus catalyzes Fe(II)-dependent and alpha-ketoglutarate-dependent Cbeta-hydroxylation of L-arginine during the biosynthesis of the tuberactinomycin antibiotic viomycin. Crystal structures of VioC were determined in complexes with the cofactor Fe(II), the substrate L-arginine, the product (2S,3S)-hydroxyarginine and the coproduct succinate at 1.1-1.3 A resolution. The overall structure reveals a beta-helix core fold with two additional helical subdomains that are common to nonheme iron oxygenases of the clavaminic acid synthase-like superfamily. In contrast to other clavaminic acid synthase-like oxygenases, which catalyze the formation of threo diastereomers, VioC produces the erythro diastereomer of Cbeta-hydroxylated L-arginine. This unexpected stereospecificity is caused by conformational control of the bound substrate, which enforces a gauche(-) conformer for chi(1) instead of the trans conformers observed for the asparagine oxygenase AsnO and other members of the clavaminic acid synthase-like superfamily. Additionally, the substrate specificity of VioC was investigated. The side chain of the L-arginine substrate projects outwards from the active site by undergoing interactions mainly with the C-terminal helical subdomain. Accordingly, VioC exerts broadened substrate specificity by accepting the analogs L-homoarginine and L-canavanine for Cbeta-hydroxylation.

The present invention relates to a method for producing modified non-ribosomal peptide synthetases (NRPS). The invention also relates to the use thereof for producing native or artificial peptides or proteinogenes. In particular, a desired peptide can be obtained by means of a novel non-ribosomal code.

Lasso peptides are fascinating natural products with a unique structural fold that can exhibit tremendous thermal stability. Here, we investigate factors responsible for the thermal stability of caulosegnin II. By employing X-ray crystallography, mutational analysis and molecular dynamics simulations, the ring residue proline 8 was proven to be crucial for thermal stability.

Lasso peptides are a class of natural products that belong to the family of ribosomally‑assembled and posttranslationally‑modified peptides. They are defined by an unique structural motif referred to as the so‑called lariat knot, whose name is derived from the fact that this topology is reminiscent of the knot found in the noose of a lasso. This structure is achieved by the presence of an N‑terminal macrolactam ring that is threaded by the C‑terminal tail of the peptide. The fold in these molecules is then conserved by non‑covalent interactions in the form of bulky amino acids located above and below the macrolactam ring, in this way entrapping the tail inside of the ring. What makes these compounds of interest for research is that their structure, even though it is maintained merely by sterical interactions, often exhibits a tremendous stability against thermal, chemical and proteolytic degradation. Still, up to now little is known about the general function of these compounds for their producing organisms, although there are some interesting biological activities attributed to some of the previously reported lasso peptides. To obtain more information about their physico‑chemical properties, their biosynthesis and to get an idea what role they might play in nature, the primary subject of this thesis was the directed genome mining for and the subsequent isolation and characterization of novel lasso peptides. The results of these projects were published in several studies that will be shown and discussed in the course of this thesis. Amongst other findings, these studies not only include the discovery of a multitude of novel lasso peptides, but through the thorough analysis and characterization of these compounds, several former assumptions of this research area could be overhauled and updated. In addition to this, the bioinformatic data gathered during our genome mining studies furthermore uncovered interesting facts about the distribution of lasso peptides amongst bacteria and about the existence of different subgroups of biosynthetic gene cluster arrangements, which could facilitate future research directed towards identifiying the concrete functions of these compounds. Furthermore, it was also investigated if these compounds are suitable scaffolds for drug development via epitope grafting approaches. In this regard, a previously reported bioactive lasso graft was used as the basis to show that such compounds can indeed be further optimized and improved upon by rational approaches that utilize the information obtained from research done with simple linear or cyclic peptides that are, in contrast to lasso peptides, easily accessible by synthetic means., Lassopeptide sind eine Klasse von Naturstoffen, die der Familie der ribosomal‑synthetisierten und posttranslational‑modifizierten Peptide zugehörig sind. Sie sind gekennzeichnet durch das einzigartige Strukturmotiv des Lassoknotens, dessen Name sich von der Beobachtung ableitet, dass diese Topologie an den Knoten in einer Lassoschlinge erinnert. Diese Struktur wird durch einen N‑terminalen Makrolactamring verwirklicht, der von dem C‑terminalen Peptidschwanz durchfädelt ist. Die Faltung dieser Moleküle wird durch nicht‑kovalente Wechselwirkungen sterisch anspruchsvoller Aminosäuren, die über und unter dem Ring lokalisiert sind, aufrecht erhalten, wodurch der C‑terminale Bereich des Peptids im Inneren des Ringes fixiert wird. Was diese Verbindungen interessant für die Forschung macht ist, dass ihre Struktur trotz ihrer rein sterischen Stabilisierung oft eine außergewöhnliche Resistenz gegenüber thermischer, chemischer und proteolytischer Degradation aufweist. Dennoch ist bisher wenig über die allgemeine Funktion dieser Stoffe in der Natur bekannt, obwohl es einige zuvor beschriebene Lassopeptide gibt, für die interessante biologische Aktivitäten beobachten wurden. Um mehr Information über ihre physiko‑chemischen Eigenschaften, ihre Biosynthese und ihre mögliche Rolle in der Natur zu erhalten, war das primäre Ziel dieser Arbeit das gezielte Genome Mining und die darauffolgende Isolierung und Charakterisierung neuartiger Lassopeptide. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen wurden in mehreren Studien publiziert, die im Verlauf dieser Doktorarbeit präsentiert und diskutiert werden sollen. Neben der Isolierung einer Vielzahl neuer Lassopeptide, konnten durch die sorgfältige Untersuchung und Charakterisierung dieser neuen Verbindungen zusätzlich einige bisher vorherrschende Vorstellungen aus diesem Forschungsgebiet widerlegt und aktualisiert werden. Ferner hat die Auswertung der Daten aus unseren Genome‑Mining‑Studien interessante Beobachtungen über das Vorkommen von Lassopeptiden in Bakterien und über die Existenz verschiedener Subgruppen von Biosynthesegencluster-andordnungen zugelassen. Diese Informationen könnten zukünftige Untersuchungen erleichtern, die auf die Identifizierung der konkreten Funktionen dieser Verbindung ausgelegt sind. Des Weiteren wurde untersucht ob Lassopeptide geeignete Gerüste für die Wirkstoffentwicklung durch Epitope‑Grafting‑Ansätze sind. In dieser Hinsicht wurde eine vorher veröffentlichte, bioaktive Lassopeptidvariante als Basis genommen, um zu zeigen, dass solche Verbindungen in der Tat durch rationale Ansätze optimiert und verbessert werden können. Dieses Vorgehen basierte auf Forschungsergebnissen, die aus Studien mit linearen und zyklischen Peptiden erhalten wurden, welche, im Gegensatz zu Lassopeptiden, leicht durch chemische Synthese zugänglich sind.

Bakterien und Pilze produzieren eine große Vielfalt an Naturstoffen, die vom Menschen für viele verschiedene Zwecke genutzt werden können. Die meisten dieser Sekundärmetaboliten werden durch nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) oder Polyketid-Synthetasen (PKS) generiert und durch weitere modifizierende Enzyme (sogenannte Tailoring-Enzyme) strukturell verändert. Die Totalsynthese solcher Naturstoffe ist häufig kompliziert und sehr kostenintensiv, darüber hinaus ist für die industrielle Anwendung oft eine Derivatisierung der ursprünglichen Struktur sinnvoll und notwendig. Zur biotechnologischen, semisynthetischen oder chemoenzymatischen Darstellung dieser Naturstoffe oder deren Derivate ist das detaillierte Wissen über deren Biosynthese und die Mechanismen der beteiligten Enzyme unerlässlich. In dieser Arbeit wurde die Einführung der Hydroxylierungen in die Struktur des Skyllamycins, einem Naturstoff aus Streptomyces sp. Acta 2897 untersucht. Skyllamycin ist ein nichtribosomal synthetisiertes Cyclodepsipeptid bestehend aus 11 Aminosäuren mit mehreren ungewöhnlichen Strukturmerkmalen. Neben der α -ydroxylierung von Glycin an Position 9 (Gly9) und den drei β-Hydroxylierungen an L-Phe5, L-Tyr7 und D-Leu11 trägt L-Asp7 eine β-Methylierung und L-Tyr7 ist zusätzlich O-methyliert. Schließlich ist die erste Aminosäure Threonin mit einem ungewöhnlichen 2-[1‘-Z-Propenyl]-Zimtsäurerest am N-Terminus verknüpft. Die α-Hydroxylierung von Glycin wird von einer flavinabhängigen Monooxygenase (SkyMono) und der zugehörigen Flavin-Reduktase (SkyRed) eingeführt. Die beiden Enzyme wurden heterolog in Escherichia coli exprimiert und aufgereinigt und anschließend spektroskopisch und strukturell charakterisiert. Die Untersuchungen ergaben, dass SkyRed als Homodimer vorliegt und die Reduktion von FMN und FAD unter NADH-Verbrauch katalysiert. Dabei wird ein schwacher SkyRed Flavinred:::NAD+-charge transfer-Komplex ausgebildet. Die Bindung des Flavins erfolgt dabei lediglich über den Isoalloxazinring des Flavins. Die Monooxygenase liegt ebenfalls als Homodimer vor und bindet reduziertes FAD mit einem KD-Wert von 128 ± 28 nM. Die β-Hydroxylierungen von L-Phe5, L-Tyr7 und D-Leu11 werden von einer Cytochrom P450-Monooxygenase (P450sky) eingeführt. Durch in vitro-Studien konnte gezeigt werden, dass P450sky diese Hydroxylierung einführt, während die Aminosäuren an den entsprechenden PCP-Domänen der Skyllamycin-Synthetase gebunden sind. P450sky akzeptiert nur PCP-gebundene Substrate, arbeitet in Interaktion mit der NRPS und differenziert zudem zwischen den drei Substrat-PCP-Domänen und anderen Nicht-Substrat-PCP-Domänen der NRPS. Dies unterscheidet P450sky von den bekannten β-hydroxylierenden P450-Monooxygenasen und deren Wirkungsweise an externen AT-Modulen. Darüber hinaus konnte die Kristallstruktur von P450sky bis zu einer Auflösung von 1,9 Å gelöst werden. Diese Ergebnisse zeigen einen neuen Weg der Hydroxylierung von Naturstoffen auf und erweitern damit das Wissen über die Komplexizität von nichtribosomalen Peptidsynthetasen. Bacteria and fungi produce a great variety of natural compounds, which can be utilized for many different purposes. Most of these secondary metabolites are generated by nonribosomal peptide synthases (NRPS) or polyketide synthases (PKS) and are further structurally modified by tailoring enzymes. The total synthesis of such compounds is often complicated and cost-intensive. Moreover, in many cases a derivatization of the original structure is reasonable, if not necessary for the industrial application. For biotechnological, semisynthetic or chemoenzymatic production of these compounds or its derivatives, it is therefore essential to have a profound knowledge of the involved enzymes. In this work, the introduction of the hydroxylations in the structure of skyllamycin, a natural compound from Streptomyces sp. Acta 2897 is investigated. Skyllamycin is a nonribosomally synthesized cyclodepsipeptide consisting of 11 amino acids with several unusual structural features. In addition to the α-hydroxylation of glycine at position 9 (Gly9) and the three β-hydroxylations at L Phe5, L Tyr7 and D Leu11, there is a β-methylation at L Asp7 and a O methylation at L Tyr7. Furthermore, the first amino acid threonine is linked to an unusual 2-[1‘-Z-propenyl]-cinnamoyl moiety at the N-terminus. The α-hydroxylation of glycine is introduced by a flavin-dependent monooxygenase (SkyMono) and its corresponding flavin reductase (SkyRed). These two enzymes were heterologously expressed in Escherichia coli and purified and subsequently characterized spectroscopically and structurally. The studies revealed that SkyRed exists as a homodimer and catalyzes the reduction of FMN and FAD under consumption of NADH. During the reaction, a weak SkyRed Flavinred:::NAD+ charge transfer complex is formed. The binding of the flavin to the enzyme is accomplished solely through the isoalloxazine ring of the flavin. The monooxygenase also exists as a homodimer and binds reduced FAD with a KD value of 128 ± 28 nM. The β-hydroxylations of L Phe5, L Tyr7 und D Leu11 are introduced by a cytochrome P450 monooxygenase (P450sky). By means of in vitro studies it could be shown that P450sky catalyzes the hydroxylation while the amino acids are bound to the corresponding PCP domains of the skyllamycin synthetase. P450sky only accepts PCP-bound substrates, interacts with the NRPS and differentiates between the three substrate PCP domains and other non-substrate PCP domains. This distinguishes P450sky from other known β-hydroxylating P450 monooxygenases and their mode of action on external AT modules. Furthermore, the crystal structure of P450sky could be solved to a resolution of 1.9 Å. These results show a new mode of hydroxylation of natural compounds and expands the knowledge about the complexity of nonribosomal peptide synthetases.

Sactipeptides are a new class of ribosomal assembled and posttranslational modified, mostly bioactive peptides, which are assembled of 26 to 35 proteinogenic amino acids. Their character-istic feature is a thioether bond linking the sulfur atom of a cysteine residue with the α-carbon of an acceptor amino acid. Until now the amino acids phenylalanine, threonine, methionine, aspar-agine, serine, alanine and tyrosine were identified as acceptors. All known sactipeptides pos-sess of an inflexible helical fold. Partial a cyclized peptide backbone is found. The sporulation killing factor (SKF) contains an additional disulfide bridge as posttranslational modification be-sides the sactipeptide like thioether linkage. In this thesis the biosynthesis of the thioether bond formation in the sactipeptides subtilosin A and SKF was investigated. It was shown that enzymes AlbA (subtilosin A) and SkfB (SKF) cata-lyze the generation of the thioether linkages. These proteins were identified as radical SAM en-zymes, as they were only able to catalyze the cleavage of S-adenosylmethionine into methio-nine and the 5’-deoxyadenosylradical under reductive condition and after the enzymes were fully loaded with iron- and sulfide-ions. Furthermore it was shown, that both enzymes contains two [4Fe-4S]-Clusters. Therefore the iron- and sulfur-content of the proteins and protein variants were measured. As well the proteins and protein variants were analyzed by several spectro-scopic techniques. The [4Fe-4S]-Cluster, which is coordinated by the characteristic radical SAM enzyme like CXXXCXXC motif is responsible for the cleavage of SAM, whereas the second [4Fe-4S]-Cluster plays a key role during thioether bond formation. By carrying out precursor peptide modification assays with and without the addition of iodoa-cetamide and subsequent HPLC-HRMS analysis, it was shown that AlbA and SkfB are able to catalyze the thioether linkage generation in the respective precursor peptide (SboA, SkfA). By assaying leaderpeptide less SboA and SkfA variants it was elucidated that the AlbA and SkfB catalyzed reactions are the first step during the biosynthesis of both sactipeptides. Precursor peptide modification assays with AlbA and SkfB variants, as well as interaction studies with Al-bA, AlbA variants and SboA showed an interaction between the second [4Fe-4S]-Cluster and the precursor peptide. Additional assays with SkfA variants, which should address issues con-cerning the substrate specificity of SkfB towards the donor and acceptor positions, were carried out. Within these assays it was e.g. shown that the enzyme class is not able to catalyze the formation of an ether linkage. Based on the obtained results a completely new radical based mechanism for thioether bond formation during sactipeptide biosynthesis is proposed and veri-fied., Sactipeptide sind eine neue Klasse ribosomal synthetisierter, meist bioaktiver Peptide, die aus 26 bis 35 proteinogenen Aminosäuren bestehen. Ihr charakteristisches Merkmal ist eine Thio-etherbindung, die das Schwefelatom einer Cysteingruppe mit dem α-Kohlenstoffatom einer Ak-zeptoraminosäure verknüpft. Als Akzeptoren wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt die Aminosäu-ren Phenylalanin, Threonin, Methionin, Asparagin, Serin, Alanin und Tyrosin identifiziert. Alle bekannten Sactipeptide verfügen über eine relativ starre helikale Struktur. Teilweise wird auch ein zyklisches Peptidrückgrat gefunden. Der Sporulation Killing Factor (SKF) verfügt neben der Thioetherbrücke über eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese der Thioetherbildung in den Sactipeptide Subti-losin A und SKF untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bildung der Thioetherbrücken von den Enzymen AlbA (Subtilosin A) und SkfB (SKF) katalysiert wird. Diese beiden Proteine wurden als Radical SAM Enzyme identifiziert, da sie nur in der mit Eisen und Schwefel beladenen Form und nur unter reduktiven Bedingungen in der Lage sind S-Adenosylmethionin (SAM) in Methio-nin und das 5’-Deoxyadenosylradikal zu spalten. Des Weiteren wurde durch die Bestimmung des Eisengehaltes von-Varianten der beiden Enzyme und auch durch spektroskopische Unter-suchungen dieser Proteinvarianten gezeigt, dass AlbA wie auch SkfB zwei [4Fe-4S]-Cluster binden. Der über ein für Radical SAM Enzyme charakteristisches CXXXCXXC-Motiv gebundene [4Fe-4S]-Cluster ist für die Spaltung von SAM verantwortlich wohin gegen der andere [4Fe-4S]-Cluster eine wichtige Rolle in der Synthese des Thioethers spielt. Durch Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit und ohne Zugabe von Iodacetamid, die anschlie-ßend per HPLC-HRMS analysiert wurden, wurde gezeigt, dass die Enzyme jeweils für die Syn-these der Thioetherbrücken in dem dazugehörigen Vorläuferpeptid (SboA, SkfA) verantwortlich sind. Durch Leaderpeptidlose SboA und SkfA-Varianten wurde gezeigt, dass die Reaktion den ersten Schritt in der jeweiligen Biosynthese bildet. Durch AlbA und SkfB-Varianten wie auch Interaktionsstudien mit AlbA, AlbA-Varianten und SboA wurde eine Wechselwirkung des zwei-ten gebundenen [4Fe-4S]-Clusters und dem Vorläuferpeptid nachgewiesen. Des Weiteren wur-den SkfA-Varianten hergestellt die Fragen zur Substratspezifität im Bezug auf Donor- und Ak-zeptorposition in der SkfB katalysierten Reaktion beantworten sollten. Dabei wurde u.a. gezeigt, dass die Enzymklasse nicht in der Lage ist die Synthese von Etherbindungen zu katalysieren. Aufbauend auf den dabei erhaltenen Ergebnissen wurde ein vollständig neuer, über radikale Zwischenstufen verlaufender Mechanismus für die Synthese der Thioetherbindungen vorge-schlagen und verifziert.

Integrins moderate diverse important functions in the human body and are promising targets in cancer therapy. Hence, the selective inhibition of specific integrins is of great medicinal interest. Here, we report the optimization of a grafted lasso peptide, yielding MccJ25(RGDF), which is a highly potent and selective αvβ3 integrin inhibitor. Furthermore, its NMR structure was elucidated and employed in a molecular dynamics approach, revealing information about the integrin binding mode and selectivity profile of MccJ25(RGDF).

Bioaktive Peptid-Naturstoffe spielen weiterhin eine wichtige Rolle in der modernen Medizin, wo sie oftmals als letzte Option bei schweren, lebensbedrohlichen Erkrankungen eingesetzt werden. Ein großer Teil dieser Peptide wird in der Natur, unabhängig vom Ribosom, durch Templat-abhängige und Templat-unabhängige sekundäre Stoffwechselwege synthetisiert. Oftmals sind diese strukturell komplexen Peptid-Naturstoffe nicht durch rein synthetische Ansätze zugänglich. Deshalb wurde damit begonnen neue Ansätze für in vivo Fermentationsprozesse, sowie chemoenzymatische Strategien zur Synthese und Diversifikation von Peptid-Naturstoffen zu entwickeln. Diese Ansätze fußen auf einem vertieften Verständnis der zugrundeliegenden biosynthetischen Stoffwechselwege. In dieser Arbeit wurden aus diesem Grund jeweils zwei Templat-abhängige und Templat-unabhängige Biosyntheserouten eingehend untersucht. Hierbei standen sowohl die Mechanismen, welche zur Synthese eines bestimmten Peptidgerüsts führen, sowie die zugehörigen Modifizierungsstrategien, die das assemblierte Peptid weiter dekorieren, im Fokus. Bei den beiden untersuchten Templat-abhängigen NRPS-Biosynthesewegen handelt es sich um die Assemblierungsrouten des Antitumor-Antibiotikums Sibiromycin und des neu identifizierten Siderophors Mirubactin. Es wurde durch detaillierte in vitro Studien gezeigt, dass die ungewöhnlich substituierte Anthranilsäure-Gruppe des Sibiromycins durch vier biosynthetische Schritte generiert wird. Ausgehend von 3-Hydroxykynurenin wird durch die SAM-abhängige Methyltransferase SibL eine Methylierung an der 4-Position eingeführt. Die PLP-abhängige Kynureninase SibQ erzeugt anschließend 3-Hydroxy-4-methylanthranilsäure (3H4MAA) durch Hydrolyse. Dieses Intermediat dient nun als Substrate für die NRPS SibE, welche es aktiviert und kovalent an seine Thiolierungsdomäne bindet. Abschließend wird die vollständig modifizierte Anthranilsäure-Gruppe durch online-Hydroxylierung, katalysiert durch die FAD/NADH-abhängige Hydroxylase SibG, gebildet. Das vormals unbekannte Siderophor Mirubactin konnte aus Actinosynnema mirum durch Kultivierung unter Eisen-limitierten Bedingungen, gefolgt von Aktivitäts-geleiteter Aufreinigung, isoliert werden. Durch eine Kombination an spektroskopischen, massenspektrometrischen und Derivatisierungs-Methoden, konnte die Struktur von Mirubactin aufgeklärt werden. Durch bioinformatische Analysen und in vitro Untersuchungen der biosynthetischen Maschinerie konnte der Mirubactin Gencluster identifiziert werden. Es konnte eine Biosyntheseroute postuliert werden, welche die iterative Verwendung eines an eine Thiolierungsdomäne gebundenen Substrats (MrbD), sowie die Bildung eines ungewöhnlichen O-Acylhydroxamsäureesters durch eine C-terminale Kondensationsdomäne (MrbJ), enthält. Zusätzlich wurden zwei Templat-unabhnägige CDPS-Biosynthesewege untersucht, die für die Synthese der Nocazine und die Generierung von modifizierten Ditryptophan-Diketopiperazinen (DKPs) zuständig sind. Mittels bioinformatischer Analysen konnte der erste Nocazine-Gencluster identifiziert werden. Durch in vivo und in vitro Studien konnte die gesamte Biosyntheseroute von Nocazine E und XR334 aufgeklärt werden. Die DKP-Bildung wird durch die CDPS Ndas_1148 katalysiert, welche ein neues Produktprofil aufweist bei dem cyclo(L-Phe-L-Tyr) und cyclo(L-Phe-L-Phe) die beiden Hauptprodukte darstellen. Weitere Modifikation des DKP-Gerüsts wird anschließend durch kombinatorischen Gebrauch einer Cyclodipeptidoxidase (Ndas_1146/1147) sowie zweier SAM-abhängiger O-/N-Methyltransferasen (Ndas_1145 und Ndas_1149) erreicht. Ein CDPS-Gencluster, zuständig für die Biosynthese von methylierten Ditryptophan-DKPs, konnte durch Genomanalyse von A. mirum identifiziert werden. Der Biosyntheseweg wurde durch in vivo und in vitro Untersuchungen aufgeklärt. Zu Beginn katalysiert die hoch spezifische CDPS Amir_4627 die Bildung des vormals unbekannten CDPS-Produkts cyclo(L-Trp-L-Trp). Nun methyliert die SAM-abhängige N-Methyltransferase Amir_4628 entweder einen oder beide Ring-Stickstoffe des DKP-Gerüsts und bildet somit die einfach- oder doppelt-methylierten Ditryptophan-DKP Produkte., Bioactive peptide natural products continue to play an important role in modern medicine since many of them represent last-resort treatments for a variety of life threatening diseases. A large fraction of those peptides are generated via ribosome-independent templated and non-templated biosynthetic pathways. Oftentimes the structural complexity of those peptides has prevented their synthesis and diversification through purely synthetic means. New approaches build on detailed knowledge about the respective biosynthetic pathways have been envisaged where fermentative in vivo or chemoenzymatic strategies are used to generate highly modified peptide natural products. To work towards this vision two templated and two non-templated biosynthetic pathways have been investigated. Both their abilities to generate particular peptide scaffolds and to subsequently decorate a given peptide backbone through the action of dedicated modification enzymes have been explored. The two templated NRPS-dependent pathways studied are the biosynthetic systems of the antitumor-antibiotic sibiromycin and the newly discovered siderophore mirubactin. The origin of the highly substituted anthranilate moiety found in sibiromycin was investigated. The pathway was shown to consist of four steps starting from the known metabolite 3-hydroxykynurenine using detailed in vitro analyses. Initially, the SAM-dependent methyltransferase SibL converts its substrate to the 4-methyl derivative, followed by hydrolysis through the PLP-dependent kynureninase SibQ leading to 3-hydroxy-4-methylanthranilic acid (3H4MAA) formation. Then the NRPS didomain SibE activates 3H4MAA and tethers it to its thiolation domain, where it then serves as the hydroxylation substrate for the FAD/NADH-dependent hydroxylase SibG, yielding the fully substituted anthranilate moiety found in sibiromycin. The siderophore mirubactin was discovered and purified from Actinosynnema mirum through cultivation under iron-limited conditions followed by activity-guided isolation. Structure elucidation was accomplished through a combination of spectroscopic, mass spectrometric and derivatization methods. Bioinformatic analyses coupled with in vitro characterization of its biosynthetic machinery, was used to identify the mirubactin gene cluster. A biosynthetic assembly route could be proposed comprising the iterative use of a stand-alone carrier-protein-bound substrate (MrbD) and the formation of an unusual O-acyl hydroxamic acid ester bond through a C-terminal condensation domain (MrbJ). In addition, two non-templated CDPS-dependent pathways responsible for nocazine biosynthesis and the generation of singly and doubly methylated ditryptophan diketopiperazines (DKPs) have been investigated. The first nocazine gene cluster could be identified through bioinformatic analyses and the biosynthetic pathway leading to the two nocazine family members nocazine E and XR334 could be elucidated through in vivo and in vitro studies. DKP-formation is carried out by a CDPS (Ndas_1148) that shows an unknown product profile forming cyclo(L-Phe-L-Tyr) and cyclo(L-Phe-L-Phe) as its main products. Tailoring of the DKP-scaffold is achieved through the combined and combinatorial action of a cyclic dipeptide oxidase (Ndas_1146/1147) and two distinct SAM-dependent O-/N-methyltransferases (Ndas_1145 and Ndas_1149). A CDPS gene cluster responsible for the formation of methylated ditryptophan DKPs was identified in A. mirum through bioinformatic genome analysis. The assembly pathway was investigated through in vivo and in vitro studies. Initially, the highly specific CDPS Amir_4627 catalyzes the formation of a formerly unknown CDPS product, namely cyclo(L-Trp-L-Trp) followed by the methylation of one or both DKP-ring nitrogens through the action of the SAM-dependent N-methyltransferase Amir_4628 generating singly and doubly methylated ditryptophan DKPs.

Nonribosomally synthesized lipopeptides of microbial origin contain a fatty acyl moiety and exhibit diverse biological activities including antibiotic, anticancer or biosurfactant properties. Thus, these natural products are subject of intense research and present a potent class of new agents for pharmaceutical and biotechnological applications. The biosynthesis of lipopeptides usually starts by N-acylation of the peptide backbone and is referred to as lipoinitiation. This study adresses the exploration and characterization of different mechanisms of lipoinitiation consisting of activation and transfer of the lipid moiety. These reactions were elucidated during the biosynthesis of the lipoheptapeptide surfactin from Bacillus subtilis and of the acidic lipodepsipeptide CDA (calcium-dependent antibiotic) from Streptomyces coelicolor A3(2) displaying two novel strategies for the incorporation of a fatty acid into a peptidic natural product. The involved domains were dissected from their nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) by genetic techniques and were heterologously produced as singular proteins. Commercially not available substrates were chemically synthesized. Biochemical studies revealed in both systems that the starter C domains from the initiation modules of the corresponding NRPSs are essential for the transfer of the fatty acid acting as acyltransferases. The catalytic motif HHxxxDG identified in other C domains was shown to be indispensable in this reaction which was investigated by mutational studies pointing towards a common mechanism of C domain catalyzed reactions. The investigated lipoinitiation reactions during surfactin and CDA biosynthesis differred in the mode of fatty acid activation. For surfactin production, enzymes from the primary metabolic pathways activate the fatty acid by coupling it to coenzyme A resulting in a reactive thioester that directly serves as a substrate for the N-acylation of the peptidyl-carrier protein(PCP)-bound amino acid. However, the starter C domain from the CDA synthetase needs an acyl-carrier protein(ACP)-bound fatty acid for the transfer reaction. Both starter C domains exhibit high selectivities for their substrates except for the PCP domain, which could be arbitrarily substituted with other PCP domains. The second part of the thesis aimed at the characterization of a cyclization domain of the bacitracin synthetase BacA-Cy2 which is closely related to C domains. It catalyzes the formation of a thiazoline in the antibiotic bacitracin from Bacillus licheniformis and was dissected from the native synthetase resulting in a singular protein to allow detailed characterization and the determination of substrate specificity., Nichtribosomal synthetisierte Lipopeptide aus mikrobiellen Organismen weisen ein breites Spektrum an biologischen Aktivitäten auf, zu denen beispielsweise antibiotische, antitumorale aber auch biotensidische Eigenschaften zählen. Daher sind diese Naturstoffe von pharmazeutischem sowie biotechnologischem Interesse und stellen einen Gegenstand intensiver gegenwärtiger Forschung dar. Die Biosynthese dieser Lipopeptide beginnt in der Regel mit der Inkorporation des Fettsäurerestes, die durch eine N-Acylierung des Peptidrückgrats stattfindet und als Lipoinitiation bezeichnet wird. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Aufklärung verschiedener Lipoinitiationsmechanismen, zu denen die Aktivierung und die Übertragung des Fettsäurerests gehört. In den Biosynthesewegen des Lipoheptapeptids Surfactin aus Bacillus subtilis und des sauren Lipodepsipeptids CDA (engl.: calcium-dependent antibiotic) aus Streptomyces coelicolor A3(2) konnten diese Reaktionen biochemisch charakterisiert werden. Diese stellen zwei neue Strategien der Lipoinitiation dar. Dazu wurden die beteiligten Domänen der nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) heterolog als singuläre Proteine produziert und die Substrate, sofern nötig, chemisch synthetisiert. In den biochemischen Untersuchungen zeigte sich, dass in beiden Reaktionen die Kondensations(C)-Domäne des Initiationsmoduls der jeweiligen Peptidsynthetase als Acyltransferase wirkt und für den Transfer der Fettsäure essentiell ist. Die Notwendigkeit des aus anderen C-Domänen bekannten katalytisch aktiven Motivs HHxxxDG konnte durch Mutationsstudien in den hier untersuchten Initiations-C‑Domänen bestätigt werden und deutet auf einen universellen Katalysemechanismus der Familie der C‑Domänen hin. Die beiden untersuchten Systeme der Lipoinitiation der Surfactin- und CDA-Biosynthese zeigten jedoch auch Unterschiede. Während in der Surfactinsynthese eine durch Enzyme aus dem Primärmetabolismus CoA-aktivierte Fettsäure mit der Peptidyl-Carrier-Protein(PCP)-gebundenen Aminosäure kondensiert wird, wird die Fettsäure in der CDA-Biosynthese von einem Acyl-Carrier-Protein ausgehend übertragen. In beiden Reaktionen zeigten sich ausgeprägte Spezifitäten mit Ausnahme der Selektivität für die PCP‑Domäne, die in beiden Systemen durch fremde PCP-Domänen substituiert werden konnte. Der zweite Teil der Arbeit bestand aus der Charakterisierung der eng mit C-Domänen verwandten Zyklisierungs-Domäne aus der Bacitracin-Synthetase BacA-Cy2. Diese katalysiert die Bildung des Thiazolinrings in dem Antibiotikum Bacitracin aus Bacillus licheniformis und wurde in dieser Arbeit ebenfalls als freistehendes Protein heterolog produziert, wodurch eine genaue Charakterisierung und Bestimmung der ausgeprägten Substratspezifität ermöglicht wurde.

The increasing occurrence of multi-resistant bacteria makes it more necessary than ever to search for new antibacterial compounds. For this, natural products are a rich source, since they feature structural and chemical diversity, which is only hardly or not at all accessible by synthetic chemistry. An interesting method for the identification of new natural products is genome mining, which gains more and more importance as the number of sequenced genomes has risen enormously in the past few years due to the strong reduction in sequencing costs. The lasso peptides are a special family of ribosomally assembled and post-translationally modified peptides (RiPPs), which owe their name to their unique three-dimensional fold. This fold is responsible for their chemical, thermal and proteolytic stability and in some instances for their bioactivities despite the relatively low degree of chemical modification. In this work nearly 100 potential lasso peptide biosynthetic gene clusters could be identified through genome mining. To validate the suitability of this approach, one cluster was selected and different truncated variants of the heat labile lasso peptide astexin-1 were isolated. They were analyzed for thermal and proteolytic stability and the 3D-structure of astexin-1(19) was elucidated via NMR spectroscopy. An extensive mutagenesis study was performed to investigate the specificity of the biosynthetic machinery and to identify important residues for the lasso fold. Through the rational incorporation of specific mutations, it was possible to transform the native heat labile natural product into a heat-stable lasso peptide. In the second part of this work two biosynthetic gene clusters from Caulobacter sp. K31, which were identified by genome mining, were selected and it was possible to isolate four new lasso peptides, caulonodins IV - VII. These four caulonodins feature serine or alanine at position 1 of the lasso peptide sequence and therefore redefine class II of the lasso peptides, since all formerly identified peptides of this class feature glycine at this position. The caulonodins were investigated for thermal and proteolytic stability revealing them to be heat labile lasso peptides. The subsequent mutagenesis study showed the altered specificity of the biosynthetic machinery for position 1 and made it possible to predict the plug amino acids for all four caulonodins. This prediction was confirmed through elucidation of the 3D-structure of caulonodin V through NMR techniques. A mutagenesis study of the leader peptide could confirm that there are more residues involved in the maturation by the biosynthetic machinery than just Thr-2., Das zunehmende Auftreten multiresistenter Bakterien macht die Suche nach neuen antibakteriellen Wirkstoffen notwendiger denn je. Naturstoffe stellen dabei eine sehr reichhaltige Quelle dar, da sie über strukturelle und chemische Diversität verfügen, die teilweise nicht oder nur unter großem Aufwand synthetisch zugänglich ist. Für die Identifikation neuer Naturstoffe kann dabei besonders die Methode des Genome Minings genutzt werden, da durch die stark gesunkenen Kosten von Sequenzierungen immer mehr Komplettgenome in den Datenbanken zur Verfügung stehen. Eine spezielle Familie der ribosomal synthetisierten und post-translational modifizierten Peptide (RiPPs) sind die Lassopeptide, die ihren Namen ihrer besonderen dreidimensionalen Faltung verdanken. Diese zeigen trotz geringer chemischer Modifikation thermische und proteolytische Stabilität und teilweise interessante Bioaktivitäten. In dieser Arbeit konnten mit dem Genome Mining Ansatz fast 100 potentielle Lassopeptidbiosynthesegencluster identifiziert werden. Als Beweis der Funktionalität des Genome Minings wurde ein Cluster ausgewählt und das hitzelabile Lassopeptid Astexin-1 in verschiedenen Verkürzungsvarianten isoliert, auf thermische und proteolytische Stabilität hin untersucht und seine 3D-Struktur mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Eine extensive Mutagenesestudie wurde zur Untersuchung der Spezifität der Biosynthesemaschinerie, sowie zur Identifikation wichtiger Reste für die Stabilität der Lassofaltung durchgeführt. Dabei konnte durch rationale Inkorporation einer Mutation der nativ hitzelabile Naturstoff in ein hitzestabiles Lassopeptid transformiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zwei Biosynthesegencluster aus Caulobacter sp. K31, die durch Genome Mining identifiziert worden sind, ausgewählt und es konnten vier neue Lassopeptide, die Caulonodine IV – VII, isoliert werden. Diese vier Caulonodine tragen Serin bzw. Alanin an Position 1 der Lassopeptidsequenz und definieren damit die Klasse II der Lassopeptide neu, da vorher nur Peptide mit Glycin an dieser Position bekannt waren. Die Caulonodine wurden auf ihre thermische und proteolytische Stabilität hin untersucht und offenbarten sich als hitzelabile Lassopeptide. Die anschließende Mutagenesestudie zeigte die veränderte Spezifität der Biosynthesemaschinerie für Position 1 und ermöglichte die Postulierung der Stöpselaminosäuren für alle vier Caulonodine. Diese Vorhersage wurde für Caulonodin V durch Aufklärung der 3D Struktur mittels NMR-Spektroskopie bestätigt. Eine Mutagenesestudie des Leaderpeptids konnte bestätigen, dass im Leaderpeptid weitere Reste neben Thr-2 für die Prozessierung durch die Biosynthesemaschinerie wichtig sind.

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) zeigen, trotz der hohen Anzahl ihrer Bausteine und der somit großen Vielfalt ihrer Produkte, eine konstante strukturelle Verwandtschaft. Die NRPS‐Systeme sind modular aufgebaut, wobei definierte Domänen die einzelnen Reaktionen katalysieren. Neben den katalytischen Domänen ist die Rolle des dynamischen Peptidyl‐Carrier‐Proteins (PCP) für das Verständnis der NRPS‐Wirkungsweise entscheidend. Studien vergleichbarer Systeme zeigen, dass die das Carrier‐ Protein umgebenden Linkerregionen aus Prolin‐ und Alanin‐reichen Sequenzen bestehen, wodurch die Bildung von Sekundärstrukturen erschwert und die Dynamik dieser Domänen unterstützt wird. Erst die in dieser Arbeit durchgeführte Arretierung der dynamischen PCP‐Domäne durch rationale Mutagenese ermöglichte die Beobachtung des Kristallwachstums und somit die erste Strukturaufklärung eines vollständigen NRPS‐Moduls. Die Struktur des Terminationsmoduls der Surfactin Synhtetase (SrfACS1003A) zeigt die Interaktion der dynamischen PCP‐Domäne mit der katalytischen Kondensationsdomäne (C‐Domäne). Das SrfAC‐Strukturmodell beschreibt die erste Struktur einer DC L‐Domäne. Desweiteren konnte die Bildung einer engen Interaktion zwischen der Kondensations‐ und den zwei Subdomänen der Adenylierungsdomäne (Acore‐ und Asub‐Domäne), die als Workbench bezeichnet wird, festgestellt werden. Dabei nimmt die Asub‐Domäne eine bisher nicht beobachtete Konformation ein. Die C‐ und Acore‐Domäne repräsentieren 83% der Masse eines Elongationsmodules (C‐, A‐ und PCP‐Domäne), auf deren starrem Gerüst die dynamische Asub‐ und PCP‐Domäne interagieren. Anschließende Untersuchungen mittels der Kleinwinkel‐Streuung (SAXS) zeigten, dass diese enge Interaktion auch im solvatisierten Zustand bestehen bleibt. Somit konnte die wichtige Rolle der Workbench, auch als Modell‐System für das generelle Verständniss der NRPS‐Systeme, bestätigt werden. Die Strukturaufklärung des vollständigen NRPS‐Moduls ermöglicht die eindeutige Definition der flankierenden PCP‐Linkerbereiche. Ihre sequenzielle Analyse zeigt, dass diese Bereiche aus Prolin‐ und Alanin‐reichen Sequenzen bestehen und somit nicht zur Bildung von Sekundärstrukturen neigen. Dagegen teilt der α‐helikale Linkerbereich zwischen der C‐ und A‐Domäne nicht die Affinität zu Prolin‐ und Alaninreichen Sequenzen und ist zur Bildung von Sekundärstrukturen fähig. Zusätzlich konnte in dem SrfAC‐S1003A‐Strukturmodell die spezifische Interaktion zweier Synthetasen über ein Helix‐Hand‐Motiv gezeigt werden. Dabei interagiert die C‐terminale α‐Helix (COM‐Helix) der ersten Synthetase mit dem in die C‐Domäne integrierten Hand‐Motiv der nachfolgenden Synthetase. Dadurch ist die spezifische Erkennung der Synthetasen untereinander gewährleistet, wodurch die Synthesereihenfolge erhalten bleibt (assembly line). Durch die Kombination mit der Bidomänen‐Struktur aus TycC konnte desweiteren ein multimodulares NRPS‐Modell erstellt werden. Dieses Modell zeigt eine linksläufige Schraubachse, bei der jedes Modul entlang der Assembly‐Line um 120° gedreht ist. Weitere Untersuchungen mittels CyoEM an trimodularen NRPS‐Systemen sollen diese Modul‐Anordnung bestätigen. Neben der globalen Architektur der NRPS, zeigt das Akzeptor‐Modell auch die ersten strukturell aufgeklärten Linkerbereiche einer swinging domain. Die in dieser Arbeit erstmals aufgeklärte Struktur eines NRPS‐Moduls ermöglicht neue synthetische und chemoenzymatische Ansätze für rationales Design und protein engineering an den nichtribosomalen Peptidsynthetasen und so den Zugang zu neuen biologisch wirksamen Peptidverbindungen.

Um die Versorgung mit dem essentiellen Spurenelement Eisen sicherzustellen, haben Mikroorganismen eine Vielzahl von Strategien entwickelt. Die Sekretion von niedermolekularen, chelatisierenden Molekülen, den sogenannten Siderophoren, nimmt unter den bakteriellen Eisenakquirierungsstrategien eine besonders prominente Rolle ein. Die Wiederaufnahme der eisenbeladenen Siderophore durch Mikroorganismen stellt dabei einen Schlüsselprozess dar und ist daher ein attraktives Ziel für potentielle Antibiotika. Hochaffine Bindung der Siderophore erfolgt durch Substratbindungsproteine, die Teil von ATP-Bindungskassetten-Transportern sind. Die potentielle Ausnutzung der Transportwege durch Wirkstoffe verlangt eine umfassende funktionelle und strukturelle Charakterisierung der beteiligten Proteine. In dieser Arbeit wurde ein Affinitätschromatographie-basiertes Verfahren zur Isolierung und Identifizierung eines Substratbindungsproteins aus Zelllysaten durch direkte Wechselwirkung mit seinem natürlichen Liganden entwickelt. Synthetische Derivate des Siderophors Petrobactin wurden auf einer Agarose‒Streptavidin-Matrix immobilisiert und mit dem Zelllysat einer Bacillus subtilis-Kultur behandelt, was die erfolgreiche Identifizierung des Petrobactin- Bindungsproteins FpiA ermöglichte. Die anschließende biochemische und physiologische Charakterisierung des Proteins bestätigte seine Signifikanz für die Petrobactin-Aufnahme und belegt damit das Potential dieser neuen Methode. Weiterhin wurde das Triscatecholat-Bindungsprotein FeuA aus B. subtilis strukturell und funktionell charakterisiert. Cokristallstrukturen mit den Siderophoren Bacillibactin und Enterobactin sowie dem Siderophor-Mimetikum mecam zeigten einen nahezu identischen Bindungsmodus für die drei verwandten, aber dennoch verschiedenen Eisenkomplexanionen. Eine basische Triade in der Bindungstasche wurde als Hauptbindungsmotiv für die Substrate identifiziert und durch ortsgerichtete Mutagenese und nachfolgende Charakterisierung der Varianten durch Fluoreszenzspektroskopie und ligandenabhängige Schmelzpunktanalyse untersucht. Kristallographische und CD-spektroskopische Experimente zeigten, dass die Bindungstasche nur Lambda-stereokonfigurierte Siderophore zulässt, daher wird beispielsweise die Delta-Stereokonfiguration des Eisenkomplexes von Enterobactin bei Bindung durch FeuA invertiert. Auffällig war der nahezu identische Bindungsmodus des Proteins für die verschiedenen Substrate, welcher mit einer Kippbewegung der zwei Domänen von FeuA um etwa 20° einhergeht, der größten bisher experimentell beobachteten Domänenbewegung eines Substratbindungsproteins der Klasse III. Diese Ähnlichkeit des Bindungsmodus impliziert seine Bedeutung für die nachfolgende Erkennung von FeuA durch die kognaten Transmembrandomänen FeuBC des Transporters, die durch Positionierung konservierter Glutamatreste auf der Oberfläche von FeuA ermöglicht wird. Diese Arbeit zeigt einen neuartigen Ansatz zur Identifizierung bakterieller Substratbindungsproteine und bietet einen detaillierten strukturellen und funktionellen Einblick in die Bindung von Triscatecholatsiderophoren durch solche Proteine.

Sepsis, defined as the systemic host response to infection, is not a single disease but a complex and heterogenous process. Effective therapies and their evaluation have been hampered by insufficient characterization of the underlying pathogenesis and in consequence limited ability to stratify patients into more homogenous subgroups. As no single or any combination of biomarkers at present can reliable be used for prediction there is an immense and vast growing interest in protein profiling. The proteomic analysis of plasma samples represents a challenge due to the presence of a few highly abundant proteins such as albumin and immunoglobulins in addition to the desired biomarkers of interest that are typically low in abundance. The detection of possible biomarkers therefore requires a specific depletion of these high abundance proteins and/or optimized multidimensional protein fractionation methods based on charge, size, hydrophobicity or any combination therefore. The IgY-PF2D-nanoLC-MS/MS strategy applied in this study combines immunoaffinity subtraction chromatography (IgY-12) for the removal of high abundance plasma proteins with two-dimensional protein fractionation (PF2D) for separation and nano LC-MS/MS for identification of proteins. In this study, plasma samples from patients with sepsis and healthy controls were examined. More than 120 adult patients with manifest sepsis, severe sepsis and septic shock were included. Citrated plasma samples from five male patients with a clinically similar cause of sepsis and underlying disease were used for this part of the study. The plasma samples were taken from three survivors and two non-survivors at the first (diagnosis of sepsis) and last day (relocation or death) of their stay in the intensive care unit (ICU) respectively. Citrated plasma samples from three age matched healthy male individuals were used as reference. A total of 1,800 fractions were analyzed and 233 distinct proteins were identified with. 132 proteins from healthy male individuals, identified by double and/or triple determination with high reliability, were regarded as the reference protein pool. Only significantly up-regulated peaks present in all of the sepsis samples were selected for MS analysis, resulting in the identification of 17 distinct proteins present only in septic patients. Whereas most of these proteins are known to be involved in inflammatory response, some are considerably novel and exploring their roles in association with the pathophysiology of sepsis may lead to the identification of new biomarkers for sepsis.

Die zyklischen Lipopeptid-Antibiotika stellen eine Klasse strukturell verwandter und bioaktiver Oligopeptide dar, welche durch multimodular aufgebaute Enzymkomplexe, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) assembliert werden. Essenziell für die antibiotische Aktivität ist die mit dem Peptidrückgrat verbundene Lipid-Einheit, welche einen einzigartigen Wirkmechanismus dieser Verbindungen ermöglicht. Die Modifikation dieser Fettsäure-Komponente ermöglicht somit die Optimierung der pharmakologischen Eigenschaften der Lipopeptid-Antibiotika bezüglich der Bioaktivität, Stabilität sowie der Pharmakokinetik. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die mechanistische Aufklärung der Lipoinitiation des aziden Lipopeptids Daptomycin (Cubicin®) und des Biotensids Surfactin. Dazu sollten mittels bioinformatischer Methoden die für die Acylierung verantwortlichen Proteine identifiziert und in vivo und in vitro charakterisiert werden. Die bioinformatische Genomanalyse des Daptomycin Produzentenstammes Streptomyces roseosporus ermöglichte die Identifizierung der im Daptomycin Biosynthesegencluster codierten Acyl-CoA-Synthetase DptE und des Acyl-Carrier-Proteins (ACP) DptF als putative Lipidierungsmaschinerie. Zur in vitro Charakterisierung wurden diese Enzyme heterolog produziert, isoliert und auf ihre Aktivität und Substratspezifität hin untersucht. Hierbei zeigte sich, dass DptE eine hohe Substrattoleranz aufweist und diverse Fettsäuren als Adenylat aktiviert und auf das kognate ACP DptF transferiert. Kinetische Spezifitätsuntersuchungen bestätigten, dass DptE eine hohe Präferenz für Fettsäuren zeigt, welche auch im natürlichen Daptomycin-Komplex (A21978C-Faktoren) vorkommen. Die Analyse der Transferreaktion mit verschiedenen ACPs zeigte, dass DptE eine hohe Affinität gegenüber DptF aufweist. Im Gegensatz zu Daptomycin konnten im Biosynthesegencluster von Surfactin (Bacillus subtilis MR168) keine Acyl-CoA-Synthetasen identifiziert werden, welche β-Hydroxy-myristinsäure aktivieren und auf das Beladungsmodul (SrfA-M1) übertragen können. Die Analyse des annotierten B. subtilis Genoms zeigte vier putative Proteine (LcfA, YhfL, YhfT, YngI) mit Sequenzhomologien zu Acyl-CoA-Synthetasen, welche nicht im Surfactin-Operon codiert vorlagen. Zur biochemischen Charakterisierung wurden diese heterolog produziert, isoliert und biochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, dass LcfA und YhfL die native β-Hydroxy-myristinsäure als CoA-Thioester aktivieren, wohingegen YhfT das Substrat ausschließlich als Adenylat aktiviert. Die Generierung von lcfA-, yhfT- und yngI-Deletionsmutanten in B. subtilis bestätigten die Beteiligung der identifizierten Enzyme an der Acylierung von Surfactin. So führte die gleichzeitige Deletion der drei putativen Acyl-CoA-Synthetasen zu einer Reduktion der Surfactin-Produktion um 98%. Zukünftige Komplementierungsstudien werden eine detailliertere Analyse der Lipidierungs- und Initiierungsreaktion während der Surfactin-Assemblierung ermöglichen. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Lipidierung der klinisch relevanten zyklischen Lipopeptide Daptomycin und Surfactin resultieren in der Postulierung zweier unterschiedlicher Acylierungsstrategien während der nichtribosomalen Synthese von Oligopeptiden. Die Umsetzung der hierdurch gewonnenen Erkenntnisse sollte in Zukunft die Generierung von Daptomycin- und Surfactin-Derivaten mit optimierter Bioaktivität durch metabolic engineering ermöglichen., 1. M. Wittmann, U. Linne, V. Pohlmann, M.A. Marahiel, FEBS Journal 2008, Vol. 275, No. 21, pp. 5343-5354 „Role of DptE and DptF in the lipidation reaction of Daptomycin" 2. F. Kraas, V. Helmetag, M. Wittmann, M. Strieker, ChemBiol 2010, accepted, "Functional Dissection of Surfactin Synthetase Initiation Module Reveals Insights into the Mechanism of Lipoinitiation”

Recent advances in the development of sequencing technologies have enabled the identification of a multitude of bacterial gene clusters, putatively involved in the biosynthesis of nonribosomal peptides (NRPs). Peptides of nonribosomal origin constitute a class of structurally and functionally diverse natural products, which are assembled by multimodular nonribosomal peptide synthetases (NRPSs). These compounds exhibit a broad pharmacological spectrum, ranging from antibacterial- to immunosuppressive properties. Understanding the assembly mechanisms in combination with rational genome mining approaches will provide opportunities for the discovery of new bioactive natural products. Within this study one approach was utilized to generate thiocoraline analogs via chemoenzymatic synthesis and the second strategy focused on the de novo natural product discovery via genome mining. Thiocoraline represents a pseudosymmetrical chromophore-capped octathiodepsipeptide, in which the symmetrical halves are linked via thioester bonds. In this study, the cyclodimerization potential of the thioesterase domain of the thiocoraline biosynthetic machinery (TioS PCP-TE) was investigated to obtain further insights into the iterative assembly of chromodepsipeptides. To address this objective, the recombinant enzyme was incubated with synthetically derived tetrapeptidyl substrates, resembling thiocoraline precursors. It was shown that the enzyme catalyzes the cyclodimerization of linear precursor molecules and an unprecedented macrothiolactonization. Evaluation of the biocombinatorial potential established the thioesterase as a robust and versatile catalyst for the generation of chromodepsipeptide analogs, harbouring thioester- or ester-linkages. As thiocoraline attains its antitumor activity from DNA-bisintercalation, the chemoenzymatically generated macrocycles were isolated and investigated towards DNA-bisintercalation activity in vitro. In the second part of this study, bioinformatic analysis of the 8.2 Mb Saccharopolyspora erythraea genome revealed two cryptic NRPS gene clusters related to hydroxamate-type siderophore biosynthesis. Detailed analysis of adenylation domain substrate-specificity and module organization enabled the establishment of a highly selective and sensitive radio-LCMS-guided genome mining approach. Application of this approach resulted in the discovery of the siderophore erythrochelin. Structure elucidation of erythrochelin was accomplished via NMR- and MSn-analysis and revealed the sequence of the tetrapeptide siderophore to be: α-N-acetyl-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-D-ornithine-D-serine-cyclo(δ-N-hydroxy-L-ornithine-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-L-ornithine). Erythrochelin assembly requires the proliferation of δ-N-hydroxy-L-ornithine (L-hOrn) and δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-L-ornithine (L-haOrn). The corresponding modifying enzymes, the FAD-dependent monooxygenases EtcB and Sace_1309 together with the bifunctional malonyl-CoA decarboxylase/N-acetyltransferase were identified and biochemically characterized. In vitro studies revealed EtcB and Sace_1309 to exclusively catalyze the δ-N-hydroxylation of free L-ornithine. The second tailoring enzyme, Mcd, was shown to catalyze malonyl-CoA decarboxylation and subsequent acetyltransfer onto the δ-hydroxamino group of L-hOrn, affording L-haOrn. Based on the elucidation of precursor biosynthesis (L-haOrn), a model for the entire erythrochelin assembly is presented., Die Entwicklung neuartiger Sequenzierungstechnologien ermöglicht die Identifizierung einer Vielzahl von kryptischen bakteriellen Genclustern, welche an der Biosynthese nichtribosomaler Peptide (NRPs) beteiligt sind. Peptide nichtribosomalen Ursprungs konstituieren eine Klasse strukturell diverser Naturstoffe, welche durch multimodulare Peptidsynthetasen (NRPSs) assembliert werden. Nichtribosomale Peptide weisen ein breites pharmakologisches Spektrum als Antitumor-Wirkstoffe, Antibiotika oder Immunosuppressiva auf. Das eingehende Verständnis der nichtribosomalen Assemblierungsmechanismen, in Kombination mit rationalem genomischen Mining ermöglicht die Identifizierung neuartiger, bioaktiver Verbindungen. Die vorliegende Arbeit umfasst neben der chemoenzymatischen Synthese von Thiocoralin-Analoga die de novo Identifizierung neuer Naturstoffe durch genomisches Mining. Thiocoralin stellt ein makrozyklisches Oktathiodepsipeptid dar, in welchem die mit exozyklischen Chromophoren funktionalisierten Oligopeptide über zwei Thioesterbindungen verbunden sind. In dieser Arbeit wurde das Zyklodimerisierungspotential der Thiocoralin Thioesterase-Domäne (TioS PCP-TE) untersucht, um ein genaueres Verständnis der iterativen Assemblierung der Chinolin- und Chinoxalinchromodepsipeptide zu erhalten. Hierzu wurde das Enzym rekombinant produziert und mit synthetischen, linearen Peptidylsubstratanaloga inkubiert. TioS PCP-TE katalysierte die Zyklodimerisierung der linearen Tetrapeptidylsubstrate unter Ausbildung verschiedener Makrothiolaktone. Die Evaluierung des biokombinatorischen Potentials ergab eine relaxierte Substratspezifität des Enzyms und ermöglichte die Generierung von Chromodepsipeptid-Analoga. Die chemoenzymatisch generierten makrozyklischen Laktone oder Thiolaktone wurden isoliert und auf ihre DNA-Bisinterkalationsaktivität hin untersucht. Im zweiten Teil dieser Arbeit resultierte die bioinformatische Analyse des 8.2 Mb umfassenden Genoms von Saccharopolyspora erythraea in der Identifizierung von zwei kryptischen Hydroxamat-Siderophor NRPS Genclustern. Die Analyse der Adenylierungs-Domänen Substratspezifität und der modularen Organisation ermöglichte die Etablierung eines hochselektiven und hochsensitiven Radio-LCMS-geleiteten genomischen Mining Ansatzes. Die Anwendung dieses Ansatzes resultierte in der Entdeckung des Siderophors Erythrochelin. Die strukturelle Charakterisierung von Erythrochelin wurde mittels NMR-spektroskopischen sowie massenspektrometrischen Studien realisiert und ergab für die Sequenz des Tetrapeptid-Siderophors: α-N-Acetyl-δ-N-acetyl-δ-N-hydroxy-D-Ornithin-D-Serin-zyklo(δ-N-Hydroxy-L-Ornithin-δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin). Die Assemblierung von Erythrochelin erfordert die Synthese von δ-N-Hydroxy-L-Ornithin (L-hOrn) und δ-N-Acetyl-δ-N-hydroxy-L-Ornithin (L-haOrn). Zur Untersuchung der korrespondierenden Biosynthesen wurden die FAD-abhängigen Monooxygenasen EtcB und Sace_1309, sowie die bifunktionelle Malonyl-CoA Decarboxylase/N-Acetyltransferase Mcd, identifiziert und biochemisch charakterisiert. Mittels in vitro-Studien wurde gezeigt, dass EtcB und Sace_1309 ausschließlich die δ-N-Hydroxylierung von freiem L-Ornithin katalysieren. Mcd katalysierte die Decarboxylierung von Malonyl-CoA und einen anschließenden Acetyltransfer auf die δ-Hydroxamino Funktionalität von L-hOrn unter Bildung von L-haOrn. Die Aufklärung der Biosynthese des Vorläufermoleküls L-haOrn resultierte in der Postulierung eines umfassenden Modells für die Assemblierung von Erythrochelin.

Nicht-ribosomal synthetisierte Peptide weisen eine hohe strukturelle Vielfalt auf, die durch die Anwesenheit vieler nicht-proteinogener Bausteine hervorgerufen wird. Es wurde gezeigt, dass diese Bausteine oft essentiell für die Bioaktivität des jeweiligen Naturstoffs sind, jedoch ist die Biosynthese vieler dieser Bausteine weitestgehend nicht verstanden. Die hier vorgestellte Arbeit beschäftigt sich mit drei chemisch anspruchsvollen Modifikations-reaktionen an freien Aminosäuren, die effektiv durch so genannte Modifikationsenzyme durchgeführt werden. Die ungewöhnlichen, modifizierten Aminosäuren dienen dann als Synthesebausteine für die nicht-ribosomale Peptidsynthese. Im ersten Teil der Arbeit wird der Biosyntheseweg von Nδ-hydroxylierten und Nδ formylierten Ornithin-Resten in vitro untersucht. Diese Bausteine werden für die Biosynthese des Tris-Hydroxamat-Siderophors Coelichelin benötigt, in dem sie für die Komplexierung von Eisen(III)-Ionen verantwortlich sind. Für die Untersuchungen wurden die Flavin-abhängige Monooxygenase CchB und die Formyltransferase CchA aus Streptomyces coelicolor rekombinant hergestellt und biochemisch charakterisiert. Für CchB konnte, im Gegensatz zu CchA, Aktivität in vitro nachgewiesen werden. Da das Enzym ausschließlich freies L-Ornithin hydroxylierte, konnte gezeigt werden, dass diese Hydroxylierungsreaktion den ersten Schritt in der Biosynthese von Coelichelin darstellt und somit essentiell für dessen Produktion ist. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der stereospezifischen Cβ-Hydroxylierung von L Arginin, die von einem organisch-synthetischen Standpunkt aus betrachtet sehr aufwendig ist. Diese Reaktion wird von der nicht-Häm Eisen(II)- und α-Ketoglutarat-abhängigen Mono-oxygenase VioC aus Streptomyces vinaceus katalysiert und resultiert in dem Baustein erythro-β-Hydroxy-Arginin. Dieser wird nach einer weiteren Modifikationsreaktion in das Peptidgerüst des Antibiotikums Viomycin eingebaut. Interessanterweise katalysiert der Großteil von nicht-Häm Eisen(II)-/α-Ketoglutarat-abhängigen Monooxygenasen die Bildung von threo Diastereomeren. Neben der biochemischen Charakterisierung von VioC wurde in dieser Arbeit auch die Lösung der Kristallstruktur der Monooxygenase durchgeführt. Anhand der erhaltenen Daten konnten die unerwartete Substrattoleranz von VioC und die für diese Enzymklasse ungewöhnliche erythro Stereochemie erklärt werden. Eine weitere Cβ-Funktionalisierung einer freien Aminosäure wird im dritten Teil dieser Arbeit untersucht. Der nicht-proteinogene Vorläuferbaustein (2S,3S)-β-Methyl-Phenylalanin, dessen chemische Synthese sehr anspruchsvoll ist, wird in das Glykopeptid-Antibiotikum Mannopeptimycin in Streptomyces hygroscopicus eingebaut. Um den Biosyntheseweg zu untersuchen, wurde die S-Adenosylmethionin-abhängige Methyltransferase MppJ in vitro auf Aktivität getestet. Es konnte gezeigt werden, dass nicht wie erwartet Phenylalanin direkt methyliert wird, sondern dass die α-Ketosäure Phenylpyruvat von MppJ zu β-Methyl-Phenylpyruvat konvertiert wird. Eine anschließende Transaminierungsreaktion mit der Pyridoxal-5’-Phosphat-abhängigen Aminotransferase IlvE aus dem Primärmetabolismus von Streptomyces coelicolor resultierte in der Bildung der beiden Diastereomere (2S,3S)- und (2S,3R)-β-Methyl-Phenylalanin. Es konnte nicht endgültig gezeigt werden, ob die MppJ-katalysierte Methylierungsreaktion stereospezifisch verläuft oder nicht. Allerdings wurden in dieser Arbeit neue Erkenntnisse bezüglich der Cβ-Funktionalisierung von Phenylalanin bzw. Phenylpyruvat erhalten., Structural diversity of non-ribosomally synthesized peptides is achieved by non-proteinogenic building blocks. These are often essential for the bioactivity of the natural product, but the biosynthesis of numerous building blocks is not understood so far. The presented work deals with three chemically demanding modification reactions of free amino acids that are catalyzed by so called tailoring enzymes. The unusual, modified amino acids are used as building blocks for non-ribosomal peptide biosynthesis. The first part of the work presents the in vitro investigation of the biosynthesis pathway of Nδ hydroxylated and Nδ-formylated ornithine residues. These building blocks are needed for the biosynthesis of the tris-hydroxamate siderophore coelichelin since they are responsible for Fe(III) coordination. The flavin-dependent monooxygenase CchB and the formyltransferase CchA were recombinantly produced and biochemically characterized whereas CchA showed no activity in vitro. Contrary, CchB hydroxylates exclusively free L ornithine and therefore catalyzes the first step in the biosynthesis of coelichelin. The second part of the work deals with a stereospecific Cβ-hydroxylation reaction of L arginine that is catalyzed by the non-heme Fe(II)- and α-ketoglutarate-dependent monooxygenase VioC from Streptomyces vinaceus. The resulting building block erythro-β-hydroxy-arginine is modified again and then incorporated into the peptide scaffold of viomycin. Interestingly, a large number of non-heme Fe(II)-/α-ketoglutarate-dependent monooxygenases catalyze the formation of threo diastereomers. The biochemical and structural characterization of the monooxygenase VioC was conducted in this work and the unexpected substrate tolerance and unusual erythro stereospecificity could be explained. In the third part of the work another Cβ-functionalization of a free substrate is examined. The non-proteinogenic precursor (2S,3S)-β-methyl-phenylalanine is incorporated into the glycopeptide-antibiotic mannopeptimycin. The activity of the S-adenosylmethionine-dependent methyltransferase MppJ was tested in vitro to investigate the biosynthetic pathway of β-methyl-phenylalanine in Streptomyces hygroscopicus. Unexpectedly, the α-keto acid phenylpyruvate is methylated by MppJ instead of phenylalanine. A following transamination reaction catalyzed by the pyridoxal-5’-phosphate-dependent aminotransferase IlvE from the primary metabolism of Streptomyces coelicolor yielded the two diastereomers (2S,3S)- and (2S,3R)-β-methyl-phenylalanine. It could not be shown whether the methylation reaction is stereospecific or not but new findings concerning the Cβ-functionalization of phenylalanine respectively phenylpyruvate were gained during this work.

The diverse class of non-ribosomal peptides consists of manifold pharmacologically important natural products. They are clinically used in antibiotic, antiviral and antitumor therapy, furthermore some are known immunosuppresants. The biological activity is based on their structural diversity, as they contain various non-proteinogenic building blocks and amino acids of which many are beta-modified. It was shown that the latter are important for biological activity, but little is known about their biosynthetic origin. In particular, these building blocks are key determinants of the class of acidic lipopeptide antibiotics and kutznerides, which are in the focus of this thesis. To determine the mechanism underlying the biosynthetic origin of the synthetically challenging beta-hydroxylated asparagine (hAsn) moieties, found in the acidic lipopeptides CDA and A54145, the corresponding recombinant non-heme iron (II)/alpha-ketoglutarate dependent hydroxylases AsnO and LptL have been examined in vitro. Direct hydroxylation of the free amino acid was observed in both cases, clearly indicating a precursor synthesis pathway. The crystal structure of one of the two hydroxylases (AsnO) was determined at high resolution and revealed a substrate induced fit mechanism of the enzyme. Upon addition of asparagine, a lid-like region seals the active site and shields it from sterically demanding substrates, which explains the observed specificity for free asparagine. Furthermore, the AsnO structure could be seen as an archetype enzyme for non-heme iron hydroxylases acting on free amino acids. It was possible to predict amino acid binding residues for homologous enzymes by 3D modeling. In order to fully understand the mechanisms of beta-hydroxylated building blocks synthesis, the hydroxylases KtzO and KtzP, predicted to be responsible for the generation of the two 3-hydroxyglutamic acid isomers found in the mixture of antifungal and antimicrobial kutznerides, were produced recombinantly and analyzed in vitro. Notably, they were found to work in trans to the assembly line on PCP-tethered glutamic acid rather than on the free amino acid. Unexpectedly, as the two isomers are found in approximately equal amounts in mature kutznerides, KtzO was shown to stereospecifically generate threo-hydroxyglutamate, while KtzP catalyzed the formation of the erythro isomer by co-elution HPLC experiments with synthetic dabsylated standards. A powerful method that employs non-hydrolyzable coenzyme A analogs was developed, which allowed the determination of the kinetic parameters of enzymes working on PCP-bound substrates for the first time. Furthermore, a hitherto unknown mechanism of NRPS assembly line restoration was observed. The corresponding adenylation (A) domain for glutamic acid activation in the kutzneride NRPS was found to be corrupted. Herein, it is shown that this lack of a functional A domain is compensated in trans by a stand-alone A domain. These findings elucidated the mechanism for the in trans compensation and the stereospecific hydroxyglutamate generation in detail and may guide the usage of in trans hydroxylation/compensation enzymes in biocombinatorial engineering approaches. In the third part of this work, the acquired knowledge about the mechanisms underlying enzymatic beta-hydroxylation of amino acids was exploited for the synthesis of the pharmaceutically relevant beta-hydroxyaspartate. Primarily, this was facilitated by the structure elucidation of AsnO in which the substrate binding residues were identified. By site directed mutagenesis, an AsnO variant was generated, which notably did not hydroxylate the original substrate asparagine, instead it was found to stereospecifically catalyze the formation of L-threo-hydroxyaspartic acid, even in commercially interesting amounts. Therefore, the AsnO variant is an excellent example for the application of basic research in order to generate pharmacologically relevant non-proteinogenic amino acids., Die mannigfaltige Klasse der nicht-ribosomalen Peptide beinhaltet viele pharmakolisch relevante Wirkstoffe, die in der Klinik in der Antibiotika-, Krebs- und Immunsuppressions-therapie Anwendung finden. Die biologische Aktivität dieser Naturstoffe geht zurück auf deren strukturelle Vielfalt, da sie neben den proteinogenen Aminosäuren noch viele nicht-proteinoge aufweisen, von denen eine Vielzahl an der -Position modifiziert sind. Es wurde gezeigt, dass diese Modifikationen zu der beobachteten Bioaktivität beitragen, aber die biosynthetischen Ursprünge sind noch weitestgehend unerforscht. Diese Bausteine sind Schlüsselmerkmale in den Naturstoffklassen der aziden Lipopeptidantibiotka und der Kutzneride, auf die sich diese Arbeit fokussiert. Um den Mechanismus des biosynthetischen Ursprungs des synthetisch anspruchsvollen beta-Hydroxyasparagin-(hAsn)-Restes, der Teil der aziden Lipopeptide CDA und A54145 ist, aufzuklären, wurden die entsprechenden nicht-Häm Eisen(II)/alpha-Ketoglutarat-abhängigen Hydroxylasen, AsnO und LptL, rekombinant hergestellt und in vitro untersucht. Für beide Enzyme konnte gezeigt werden, dass sie die freie Aminosäure regio- und stereospezifisch hydroxylieren, was eindeutig auf einen Vorläufermolekülsynthesemechanismus hinweist. Die Kristallstruktur von AsnO konnte gelöst werden und offenbarte einen unerwarteten substratinduzierten Mechanismus. In diesem schließt sich nach Substratzugabe ein Deckel über der aktiven Tasche und schirmt sterisch anspruchsvolle Substrate ab, was weiter die beobachtete Substratspezifität für freies Asparagin erklärt. Außerdem kann die AsnO- Struktur als Prototyp für Aminosäure-modifizierende nicht-Häm Eisen Hydroxylasen dienen. Durch Vergleich der AsnO-Strukur mit 3D Modellen von homologen Enzymen war es möglich, die substratbindenden Reste in den letzteren erfolgreich vorherzusagen. Um einen umfangreichen Einblick in die Mechanismen der beta-Hydroxybausteinsynthese zu erhalten, wurden die Hydroxylasen KtzO und KtzP, welche voraussichtlich die Synthese der 3-Hydroxyglutamat-(hGlu)-Isomere, die in den Antimykotika der Kutzneride gefunden wurden, katalysieren, rekombinant produziert und in vitro untersucht. Es wurde beobachtet, dass beide Hydroxylasen in trans zum NRPS Fließband an PCP-gebundenem Glutamat arbeiten. In den Kutzneriden sind die beiden hGlu Isomere in gleichen Mengen vorhanden, daher war die Beobachtung, dass KtzO stereospezifisch threo-hGlu herstellt, wohingegen KtzP die Synthese des erythro-Isomers katalysierte, unerwartet. Desweiteren wurde eine wirkungsvolle Methode entwickelt, in der nicht-hydrolisierbare Coenzym A Derivate zum ersten Mal eine direkte Bestimmung der kinetischen Eigenschaften von Enzymen, die an PCP-gebundenen Substraten arbeiten, möglich machten. Außerdem wurde ein bisher unbekannter in trans Mechanismus einer NRPS-Fließband Wiederherstellung beobachtet. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass die einzelne Adenylierungs-(A)-domäne KtzN die verkürzte und daher nicht-funktionierende A-Domäne des Kutzneridfließbandes in trans kompensiert. Zusammengefasst erläutern diese Ergebnisse den Mechanismus, auf dem die in trans Wie-derherstellung des Fließbandes und stereospezifische Hydroxyglutamatsynthese basieren. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde das gesammelte Wissen über die enzymatische beta-Hydroxylierung von Aminosäuren angewendet, um eine Methode zur Herstellung des pharmakologisch relevanten beta-Hydroxyaspartats zu entwickeln. In erster Sicht wurde dies möglich durch die Strukturaufklärung von AsnO, in der die Substrat-bindenden Reste des Enzyms identifiziert wurden. Durch gerichtete Mutagenese wurde eine AsnO Variante hergestellt, die anstelle des ursprünglichen Substrats Asparagin stereospezifisch Aspartat zu L-threo-Hydroxyaspartat umwandelt, sogar in kommerziell interessanten Mengen. Daher ist die geschaffene AsnO-Variante ein exzellentes Beispiel für die Anwendung von Grundlagenforschung für die Synthese von nicht-proteinogen Naturstoffbausteinen.

Multi modular enzymes generate a variety of secondary metabolites with interesting pharmacological properties. For fermentative, semi-synthetic or chemo-enzymatic synthesis of these natural substances and their optimized derivatives, a detailed knowledge of their biosynthesis or of the enzymes involved is needed. In this work important aspects of the biosynthesis of the iterative non ribosomal products gramicidin S, a potent antibiotic, and thiocoraline, an anti-tumor agent, were clarified. Iterative non ribosomal products are characterized by repetitive units connected to cyclic structures and the incorporation of non-proteinogenic building blocks. Both the resulting rigid structure and the properties of the non-proteinogenic components are often crucial for the biological activity of these compounds. In the first part of the work, the key step of an iterative non ribosomal peptide synthetase, the thioesterase catalyzed ligation of repetitive units and the subsequent cyclization, was investigated. On this, the recombinant gramicidin S thioesterase from Bacillus brevis was heterologously expressed in E. coli and characterized with a chemo-enzymatic approach. Using the native pentapeptidyl-thioester substrate, the thioesterase catalyzed the dimerization and subsequent cyclization of the decapeptide leading to gramicidin S. Interestingly, the detection of a linear decapeptidyl-N-acetylcysteamine-thioester as an enzyme dependent intermediate supports the iterative mechanism in vivo, in which the decapeptide is firstly bound to the peptidyl-carrier-protein and afterwards transferred to the adjacent thioesterase to be cyclized (backward mechanism). Furthermore, it was shown that the thioesterase can handle different substrates length, leading not only to dimerization, but also to trimerization and the formation of different ring sizes. The biocombinatorial potential of the thioesterase was tested by the implementation of substrate mixtures, which led to cycles composed of different substrates. Additionally, the ligation potential was investigated, which yield a heptadecapeptide as longest product. In the second part of the work a key step of 3-hydroxy quinaldic acid biosynthesis was investigated. This aromatic acid is crucial for the DNA bisintercalative properties of the anti-tumor drug thiocoraline. By heterologous expression of the proteins TioI, TioG, TioF, TioK and the peptidyl-carrier-protein of TioK together with the in vitro conversion with possible substrates, key steps in the biosynthesis were clarified. The results showed that, contrary to the postulated biosynthesis, TioI catalyzes the β-hydroxylation of peptidyl-carrier-protein bound tryptophan and that after the release of the β-hydroxytryptophan from the synthetase TioK further biosynthetic steps were performed., Bakterielle, fungale und pflanzliche multimodulare Enzyme generieren eine Vielzahl von Sekundärmetaboliten mit pharmakologisch interessanten Eigenschaften. Zur fermentativen, semisynthetischen oder chemoenzymatischen Darstellung dieser Naturstoffe und deren optimierten Derivaten ist ein detailliertes Wissen ihrer Biosynthese oder der beteiligten Enzyme Vorraussetzung. Im Rahmen dieser Arbeit sollten wichtige Aspekte der Biosynthese der iterativen nicht ribosomalen Produkte Gramicidin S, ein potentes Antibiotikum, und Thiocoralin, ein Anti-Tumor-Mittel, geklärt werden. Iterative nicht ribosomale Produkte zeichnen sich durch eine aus repetitiven Einheiten aufgebaute zyklische Struktur und den Einbau von nicht-proteinogenen Bausteinen aus. Sowohl die hieraus resultierende rigide Struktur als auch die Eigenschaften der nicht-proteinogenen Bausteine sind für die biologische Aktivität oft entscheidend. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Schlüsselreaktion einer iterativen nicht ribosomalen Peptidsynthetase, die Thioesterasen-katalysierte Verknüpfung der repetitiven Einheiten und die anschließende Zyklisierung, untersucht. Hierzu wurde die rekombinante Gramicidin S Thioesterase aus Bacillus brevis in E. coli heterolog exprimiert und mit einen chemoenzymatischen Ansatz charakterisiert. Die Umsetzung verschiedener Peptidylthioestersubstrate zeigte hierbei, dass die Thioesterase in vitro sowohl eine Ligation als auch eine Zyklisierung katalysiert. Das Auftreten eines linearen N Acetylcysteamin aktivierten Ligationsintermediates lässt einen in vivo-Mechanismus vermuten, indem das Ligationsprodukt zunächst an die nebenstehende Peptidyl Carrier Protein Domäne gebunden vorliegt und erst anschließend wieder auf die Thioesterase zur Zyklisierung übertragen wird (Backward Mechanismus). Durch Inkubation mit Peptidylthioestersubstraten verschiedener Länge konnten neben Dimerisierungen auch Trimerisierungen beobachtet werden, die durch anschließende Zyklisierung zu verschiedenen Zyklusgrößen führten. Das biokombinatorische Potential der Thioesterase wird durch die Umsetzung von Substratmischungen, die zu Zyklen aus unterschiedlichen Substraten aufgebaut werden, deutlich. Weiterhin wurde das Ligationspotential der Thioesterase untersucht und als längstes Produkt ein Heptadekapeptid erhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein Schlüsselschritt der 3-Hydroxychinaldinsäure Biosynthese untersucht. Dieses Pharmakophor ist für die DNA-bisinterkalativen Eigenschaften des Anti-Tumor-Wirkstoffes Thiocoralin entscheidend. Durch heterologe Expression der Proteine TioI, TioG, TioF, TioK und der Peptidyl Carrier Protein Domäne (PCP Domäne) von TioK sowie die in vitro-Umsetzung mit möglichen Substraten konnten Schlüsselschritte der Biosynthese geklärt werden. So zeigen die Ergebnisse, dass, entgegen der postulierten Biosynthese, TioI die β-Hydroxylierung von PCP Domänen-gebundenem Tryptophan katalysiert und dass nach erfolgter Abspaltung des β-Hydroxytryptophans von der Synthetase TioK die weiteren Biosyntheseschritte katalysiert werden.

Nonribosomal peptides are of outstanding pharmacological interest, since many representatives of this highly diverse class of natural products exhibit therapeutically important activities, such as antibacterial, antitumor and immunosuppressive properties. Understanding their biosynthesis performed by multimodular mega-enzymes, the nonribosomal peptide synthetases (NRPSs), is one of the key determinants in order to be able to reprogram these machineries for the production of novel therapeutics. The central structural motif of all peptides is the peptide (or amide) bond. In this work, two different amide bond forming catalytic entities from NRPSs were studied: The condensation (C) and formylation (F) domains. Firstly, the N-terminal F domain of LgrA1, belonging to the biosynthetic machinery required for the production of linear gramicidin was biochemically characterized. Using F-A-PCPLgrA1 in in vitro experiments, its acceptor substrate specificity towards the template-bound branched aliphatic amino acids valine, isoleucine and leucine was identified. From sequence alignments with other formyltransferases, N10-formyl-tetrahydrofolate (N10-fTHF) was expected to serve as formyl donor in these reactions. This molecule was chemoenzymatically produced and successfully used in the assays. Interestingly, its isomer N5-fTHF was also accepted even though the apparent product formation speed was 18-fold slower. The necessity of a formylated starter unit for the inititation of the nonribosomal biosynthesis was then tested with the dimodular F-A-PCP-C-A-PCPLgrA1-2 enzyme. It was shown that no dipeptide was produced, unless a formyl donor substrate was provided – in which case the formylated dipeptide could be detected. Obviously, the N-terminal formylation of linear gramicidin is critical for its bioactivity, where it functions as an ion channel in a head-to-head dimeric complex that is able to penetrate bacterial cell membranes. Secondly, the bidomain enzyme PCP-CTycC5-6 was used as a model system for C domain studies. Its previously discovered ability to cyclize the PCPTycC5-bound hexapeptide DPhe-Pro-Phe-DPhe-Asn-Gln was further investigated. The head-to-tail connectivity of the cyclic product was proven by MSn-spectrometry, and the substrate specificity for this reaction was probed in the context of six other oligopeptide substrates, three of which were accepted. Mutational studies were furthermore carried out to scrutinize previously suggested models for the C domain catalyzed reaction. According to one model, a conserved histidine residue of the C domain is involved as a base in the catalytic process. Even though the according alanine and valine mutations produced here led to well-folded soluble proteins, their cyclization activity was found abolished. Crystallization screens with the wild-type apo-PCP-CTycC5-6 enzyme afforded one promising condition which was further optimized in collaboration with the crystallographic group of Prof. Dr. Essen (Marburg). Thus, for the first time, the structure of a bidomain enzyme from nonribosomal peptide synthetases was solved – shedding light on so far unknown aspects of inter-domain communication. The relative arrangement of both domains was interpreted as a state in which the apo-PCP domain seeks interaction with either a different nonribosomal domain or a phosphopantetheine transferase. As expected, the highly variant so-called linker region that connects both entities was found unstructured, yet weakly interacting with both domains’ surfaces. Interestingly, a buffer-derived sulfate ion was seen in direct proximity to the proposed active site of the C domain. It is hypothesized in this work that this tetrahedral anion resembles the transition state of the amide bond forming reaction. Consequently, the transition state would be stabilized by the electrostatic environment of the C domain rather than by chemical base catalysis., Nichtribosomale Peptide gelten als pharmakologisch hochinteressante Stoffklasse, da zahlreiche ihrer vielfältigen Vertreter wichtige Bioaktivitäten, wie beispielsweise antibiotische, antitumorale oder immunosuppressive Eigenschaften aufweisen. Das Verständnis ihrer Biosynthesen, welche von multimodularen Mega-Enzymen, den nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS), bewirkt werden, stellt eine Schlüsselvoraussetzung dafür dar, diese Synthesemaschinerien zur Produktion neuer Therapeutika nutzen zu können. Das zentrale Strukturmotiv aller Peptide ist die Peptid- (oder Amid-) Bindung. In der vorliegenden Arbeit wurden daher zwei verschiedene katalytische Einheiten aus NRPS untersucht, welche die Ausbildung von Amidbindungen katalysieren: Die Kondensations- (C-) und die Formylierungs- (F-) Domäne. Zum einen wurde die N-terminale F-Domäne aus LgrA1 biochemisch charakterisiert. Sie ist Bestandteil des NRPS-Systems, das für die Biosynthese des linearen Gramicidins notwendig ist. Durch in-vitro-Experimente mit dem rekombinanten Enzym F-A-PCPLgrA1, konnte dessen Akzeptor-Substratspezifität für die PCP-gebundenen verzweigt-aliphatischen Aminosäuren Valin, Isoleucin und Leucin aufgedeckt werden. Aufgrund von Sequenzvergleichen mit anderen Formyltransferasen wurde erwartet, dass auch in diesem Falle N10-Formyltetrahydrofolat (N10-fTHF) als Formylgruppendonor dient. Dieses wurde auf chemoenzymatischem Wege hergestellt und erfolgreich in den Formylierungsassays eingesetzt. Interessanterweise, konnte auch dessen Isomer, das N5-fTHF, eingesetzt werden – obgleich hierbei eine um den Faktor 18 langsamere Produktbildung beobachtet wurde. Anschließend wurde die Notwendigkeit eines formylierten Startbausteins für die Initiation der nichtribosomalen Biosynthese mit Hilfe des dimodularen Konstrukts F-A-PCP-C-A-PCPLgrA1-2 in vitro untersucht. Es stellte sich heraus, dass in Abwesenheit des Formyldonors kein Dipeptid erzeugt wird, wohingegen in dessen Gegenwart N -formyliertes Dipeptid nachgewiesen werden konnte. Diese Beobachtung legt es nahe, dass die Formylierung am N-Terminus des linearen Gramicidins für dessen Bioaktivität als dimerer Ionenkanal, der sich in die bakterielle Zellmembran einlagert, von großer Bedeutung ist. Zum anderen wurde das bidomänale Enzym PCP-CTycC5-6 als Modellsystem für Untersuchungen der C-Domäne herangezogen. Dessen zuvor festgestellte unerwartete Fähigkeit, das an PCPTycC5 gebundene Hexapeptid DPhe-Pro-Phe-DPhe-Asn-Gln zu zyklisieren, wurde eingehender studiert. Mit Hilfe der MSn-Spektrometrie konnte die Kopf-zu-Schwanz-artige Konnektivität des zyklischen Produkts nachgewiesen werden. Die Substratspezifität dieser Reaktion wurde darüber hinaus anhand sechs weiterer Oligopeptide untersucht, von denen drei vom Enzym umgesetzt wurden. Desweiteren wurden Mutationsstudien durchgeführt, um die Gültigkeit bestehender Katalysemodelle für die C-Domäne zu prüfen. Nach einem dieser Modelle spielt ein konservierter Histidinrest eine entscheidende Rolle als Base bei der C-Domänenkatalyse. Obgleich die produzierten Alanin- und Valinmutanten dieses Aminosäurerestes zu korrekt gefalteten Proteinen führten, war doch deren Fähigkeit, Oligopeptide zu zyklisieren, verloren gegangen. Durch Kristallisationsexperimente mit dem Wildtyp-Enzym apo-PCP-CTycC5-6 konnte eine viel versprechende Bedingung gefunden werden, welche in Kollaboration mit der auf Kristallographie spezialisierten Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Essen (Marburg) optimiert wurde. Es gelang, die erste Kristallstrukur eines bidomänalen nichtribosomalen Enzyms aufzuklären, wodurch bislang unbekannte Aspekte der Kommunikation zwischen einzelnen Domänen beleuchtet werden konnten. Die relative Anordnung der Domänen zueinander wurde als ein Zustand interpretiert, in dem apo-PCP eine Interaktion mit entweder anderen NRPS-Domänen oder einer Phosphopantethein-Transferase eingeht. Die hochvariable linker-Region, die beide Einheiten miteinander kovalent verknüpft, wurde erwartungsgemäß ohne Sekundärstruktur vorgefunden, obgleich schwache Wechselwirkungen mit den Oberflächen der beiden Domänen existieren. Kurioserweise findet sich ein vom verwendeten Puffer stammendes Sulfat-Ion in direkter Nähe zum vermuteten aktiven Zentrum der C-Domäne. In dieser Arbeit wird die Hypothese aufgestellt, dass dieses tetraedrische Anion im Kristall deswegen fixiert ist, weil es dem Übergangszustand während der Kondensationsreaktion ähnelt. Als Konsequenz hieraus ergibt sich, dass die C-Domäne den Übergangszustand durch ihre elektrostatische Umgebung stabilisiert, anstatt die Reaktion durch chemische Basenkatalyse voranzutreiben.

Nichtribosomale Peptide zeichnen sich durch eine hohe strukturelle Diversität aus, die durch die Anwesenheit vieler nichtproteinogener Aminosäuren im Peptidrückgrat zustande kommt. Oft sind diese Bausteine wichtig oder sogar essentiell für die Bioaktivität der jeweiligen Naturstoffe. Die Bioaktivität wird weiterhin durch die konformationelle Rigidität des Peptidrückgrats gewährleistet, die häufig durch ihre makrozyklische Struktur gesichert wird. Die Makrozyklisierung wird während des letzten Schritts der nichtribosomalen Peptidsynthese durch sogenannte Thioesterase (TE)-Domänen katalysiert. Die hier vorgestellte Arbeit beschäftigt sich sowohl mit der Entwicklung von chemoenzymatischen Strategien zur Synthese bzw. Modifizierung der Streptogramin B (SB) –Antibiotika, als auch mit der Biosynthese des nichtproteinogenen 3-Methyl-Glutamat- Bausteins (3-MeGlu) der aziden Lipopeptide. Der erste Teil dieser Arbeit beschreibt einen TE-basierenden chemoenzymatischen Ansatz zur schnellen und unkomplizierten SB-Synthese, bei dem die strukturelle Diversität durch Standard-Peptidfestphasensynthese von linearen SB-Analoga und die Stereoselektivität durch nachfolgende enzymatische Zyklisierung erreicht wird. Zu diesem Zweck wurde die rekombinante TE-Domäne SnbDE-TE der Pristinamycin I-Synthetase aus Streptomyces pristinaespiralis biochemisch charakterisiert. Diese Zyklase katalysiert die Makro-laktonisierung linearer Peptidylthioesteranaloga von Pristinamycin I mit hoher Regio- und Stereoselektivität. Eine stereoselektive Zyklisierung ausgehend von komplexen in situ razemisierenden Substratmischungen ermöglicht eine elegante SB-Synthese über eine dynamische kinetische Resolution. Für die enzymatische Zyklisierung wurde eine beachtliche Substrattoleranz der SnbDE-Zyklase festgestellt, welche alle sieben Positionen des Peptidrückgrats einschließt. Eine N-Methylierung der Peptidbindung zwischen den Positionen 4 und 5 erhöht die Produktbildungsrate erheblich. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der biochemischen in vitro-Charakterisierung des Biosynthesewegs von 3-Methyl-Glutamat (3-MeGlu), einem für die biologische Aktivität der aziden Lipopeptide CDA, Daptomycin und A54145 wichtigen Baustein. Die Untersuchungen zeigen, dass GlmT aus Streptomyces coelicolor, DptI aus Streptomyces roseosporus und LptI aus Streptomyces fradiae S-Adenosyl-Methionin (SAM)-abhängige α-Ketoglutarat (αKG)-Methyltransferasen sind, welche die stereospezifische Methylierung von αKG zu (3R)-3-Me-2-Oxoglutarat katalysieren. Weiterhin wurde die verzweigtkettige Aminosäure-Transaminase IlvE (SCO5523) aus S. coelicolor als ein effizientes Enzym für die nachfolgende Transaminierung zu (2S,3R)-3-MeGlu identifiziert. Die beobachtete stereospezifische Zwei-Schritt-Umsetzung von αKG zu (2S,3R)-3-MeGlu vervollständigt das Verständnis der Biosynthese und des Einbaus von Cβ-methylierten Aminosäuren in nichtribosomale Peptide und erweitert unsere Kenntnis von Mechanismen zur Generierung von strukureller Diversität in Naturstoffen., Nonribosomal peptides are characterized by a high structural diversity that results from the presence of various nonproteinogenic amino acids in their peptide backbones. In many cases, these building blocks are important or even essential for the bioactivity of the natural products. Furthermore, the bioactivity is ensured by the conformational rigidity of the peptide backbone that is guaranteed by its macrocyclic structure. The macrocyclization of the peptide is catalyzed during the last step of nonribosomal peptide synthesis by so called thioesterase (TE)-domains. The here presented work addresses the development of a chemoenzymatic strategy for the synthesis and the modification of Streptogramin (SB)-antibiotics as well as the elucidation and characterization of the biosynthesis of the nonproteinogenic 3-methyl-glutamate (3-MeGlu) building block of the acidic lipopeptides. The first part of this work describes a TE-based chemoenzymatic approach for the rapid and convenient SB-synthesis in which diversity is generated by standard solid phase protocols and stereoselective enzymatic cyclization. For this approach, the recombinant thioesterase domain SnbDE TE of the pristinamycin I nonribosomal peptide synthetase from Streptomyces pristinaespiralis was cloned, overproduced, and biochemically characterized. This cyclase catalyses the macrolactonization of linear peptide thioester analogues of pristinamycin I with high regio- and stereoselectivity. The stereoselective cyclization out of complex in situ racemizing substrate mixtures enables an elegant SB-synthesis via a dynamic kinetic resolution assay. A remarkable substrate tolerance was detected for the enzymatic cyclization including all seven positions of the peptide backbone. An N-methylated peptide bond between positions 4 and 5 is mandatory for a high substrate turnover. The second part of this work is dedicated to in vitro reconstitution of the biosynthetic strategy of 3-methyl-glutamate (3-MeGlu), which is a building block important for the bioactivity of the acidic lipopeptides CDA, daptomycin and A54145. The investigations show that GlmT from Streptomyces coelicolor, DptI from S. roseosporus, and LptI from S. fradiae are S-adenosyl-methionine (SAM)-dependent α-ketoglutarate (αKG) methyltransferases catalyzing the stereospecific methylation of αKG resulting in the formation of (3R)-3-methyl-2-oxoglutarate. Furthermore, the branched chain amino acid transaminase IlvE (SCO5523) from S. coelicolor was characterized as an efficient catalyst for the following transamination leading to (2S,3R)-3-MeGlu. This stereospecific two-step conversion of αKG to (2S,3R)-3-MeGlu completes our understanding of the biosynthesis and incorporation of β-methylated amino acids into nonribosomal peptides and expanses our knowledge of the mechanisms generating structural diversity in natural products.

Sinkende Umgebungstemperaturen lösen bei Mikroorganismen eine Kälteschockantwort aus. Zur Untersuchung dieser Kälteschockantwort in grampositiven Mikroorganismen wird das mesophile Bodenbakterium Bacillus subtilis als Modellorganismus verwendet. Als Kälteschock wird dabei ein Temperaturabfall von 37 °C auf 15 °C definiert. Nach einem solchen Kälteschock verändert B. subtilis die Genexpression, um seine Zellphysiologie an die neuen Umweltbedingungen anzupassen. Diese Anpassung ermöglicht das Überleben bei niedrigen Temperaturen, indem kälteempfindliche Systeme durch die Induktion kälteprotektiver Proteine geschützt werden. Zu den bekannten kälterelevanten Systemen zählen neben der Fluidität der Membran die veränderte DNA Topologie und die gehinderte Initiation der Translation. Nach einem Kälteschock erhöht sich in B. subtilis der Grad der negativen Superspiralisierung der DNA. Diese gesteigerte negative Superspiralisierung hat eine veränderte Genexpression zur Folge. In der vorliegenden Arbeit sollte mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese untersucht werden, welche Genprodukte in der Kälte von der veränderten Superspiralisierung abhängig sind. Um diese Proteine identifizieren zu können, wurde die für die Einführung der negativen Superspiralisierung verantwortliche Gyrase durch Zugabe des Cumarin Derivats Novobiocin gehemmt. Anschließend wurde das Proteom des B. subtilis JH642 bei 37 °C und bei 15 °C mit und ohne Novobiocin verglichen. Durch diesen Vergleich konnten acht kälteinduzierte, von der negativen Superspiralisierung abhängigen Gene identifiziert werden. Einige dieser Gene wurden dann durch Gendeletionsstudien auf ihre Beteiligung an der Kälteschockanpassung hin untersucht. Ein kältespezifischer Phänotyp konnte für eine fabI-Mutante beobachtet werden. FabI ist eine Enoyl-[Acyl-Carrier-Protein] Reduktase, die am Elongationszyklus der Fettsäurebiosynthese beteiligt ist. Dort werden neben den linearen Fettsäuren auch verzweigtkettige Fettsäuren verlängert, die zur Anpassung der Membran an niedrige Temperaturen verwendet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die kälteinduzierten Proteine CshA und CshB aus B. subtilis untersucht, die in Sequenzvergleichen eine hohe Homologie zu DEAD Box RNA Helikasen aufweisen. In dieser Arbeit wurden sie durch einen ATPase Test und die Entwindung artifizieller dsRNA als ATP abhängige DEAD Box RNA Helikasen charakterisiert. Des Weiteren konnten durchgeführte fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von GFP-Fusionen die transkriptionsabhängige Lokalisation der Helikasen CshA und CshB an den Zellpolen zeigen, was auch schon für die CSPs bekannt war. Untersuchungen einer cshB/ cspD Doppelmutante zeigten ein vermindertes Wachstum bei niedrigen Temperaturen im Vergleich zum Wildtyp JH642. Weiterhin konnte die postulierte Zusammenarbeit von Helikasen und CSPs durch FRET Messungen der CFP- bzw. YFP Fusionen der Proteine in vivo nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse unterstützen das Modell, in dem die RNA-Helikasen kältestabilisierte Sekundärstrukturen der mRNA entwinden. Danach kann die mRNA von den CSPs gebunden werden, wodurch die Translationsinitiation bei niedrigen Temperaturen erleichtert wird., Decreasing environmental temperatures induce a cold shock response in microorganisms. To investigate this cold shock response in gram positive bacteria the mesophilic soil bacteria Bacillus subtilis is used as a model organism. A cold shock is defined as a temperature shift from 37 °C to 15 °C. After such a cold shock B. subtilis changes the gene expression to adapt its physiology to the new conditions. This adaptation facilitates the survival at low temperatures by protecting cold sensitive systems through the production of cold induced proteins. Among these cold sensitive systems are the fluidity of the membrane, the changed DNA topology and the hindered initiation of translation. After a cold shock the negative supercoil of the DNA is increased in B. subtilis. The increased negative supercoil results in a changed gene expression. In the current work the supercoil- dependent genes were identified by 2D-PAGE. To find these proteins the DNA gyrase was inhibited by the addition of Novobiocin and then the proteome of JH642 at 37 °C and 15 °C with and without Novobiocin was compared. By this approach eight genes were identified. The relevance of these genes was tested by gene deletions and growth experiments. A cold sensitive phenotype was observed for the fabI mutant. FabI is an enoyl-[acyl-carrier-protein] reductase, which is involved in the elongation cycle of the fatty acid biosynthesis. Here not only linear fatty acids are elongated, but also the branched fatty acids, which are involved in the adaptation of the membrane to low temperatures. In the second part of this work the cold induced proteins CshA and CshB were investigated, which show high sequence homology to DEAD box RNA helicases. Using an ATPase test and a RNA unwinding test the two proteins were characterized as ATP dependent DEAD box RNA helicases. Flourescence-microscopic measurements show the transcription dependent localization of the helicases CshA and CshB at the poles of the cell, what is also known for the CSPs. A cshB/ cspD double deletion mutant shows an impaired growth at low temperatures compared to the wild type JH642. Furthermore the postulated interaction of the helicases and the CSPs could be shown by FRET measurements of the CspB-CFP and CshB YFP fusions in vivo. These results support the model, in which the RNA helicases unwind cold stabilized secondary structures of the mRNA. The CSPs can than bind the single stranded mRNA, which in turn facilitates the initiation of translation at low temperatures.

For the investigation of the cold shock response the model organism B. subtilis is used. It is a gram positive mesophilic soil bacterium and its genome is completely known. A cold shock is defined as a temperature down shift from 37 °C to 15 °C. B. subtilis reacts to a cold shock with a change in gene expression, which leads to an adaptation of the complete cell physiology. This adaptation enables the survival at low temperatures due to the induction of cold protective proteins, which protect cold sensitive systems. These systems are the hindered initiation of translation and the decreased fluidity of the membrane. In the current work new cold induced genes and proteins were identified by DNA micro arrays and two dimensional gel electrophoresis. These candidates were tested for their cold sensitivity. In this and former investigations the gene yplP was found cold induced. It was shown, that a gene deletion results in a cold sensitive phenotype, which indicates a cold relevant role in the cold shock response. YplP shows significant homologies to σL-dependent transcriptional activators AcoR, BkdR, LevR and RocR. Via gene deletions and growth experiments the cold relevance of YplP, BkdR and the sigma factor SigL was observed. By electrophoretic mobility shift assays the interaction between SigL and BkdR was shown. They interact each alone and together with the known target-DNA. The identified target genes of YplP showed no interactions with SigL and YplP. Therefore, the regulated genes of YplP are still unknown. Furthermore, the reason for the cold sensitive phenotype of the strain JH642 was identified and characterized in the biosynthesis of the branched chain fatty acids. The strain JH642 shows a slower growth after cold shock in comparison to the strain MR168. In the current work the defect was identified by DNA sequencing in the gene ilvB. Via genetic complementation experiments and a biochemical approach the mutation in ilvB was found to be responsible for the growth defect of strain JH642. IlvB is involved in the degradation of threonine to isoleucine. Isoleucine serves as substrate for the synthesis of branched chain fatty acids that are essential for the membrane adaptation after cold shock., Die Untersuchung der Kälteschockanpassung von Mikroorganismen wird in Modellorganismen wie dem Gram-positiven mesophilen Bodenbakterium B. subtilis durchgeführt. Dabei ist das komplett entschlüsselte Genom von großem Vorteil. Für die Untersuchungen wird ein Temperaturschock von 37 °C auf 15 °C als Kälteschock definiert. B. subtilis reagiert auf einen Kälteschock mit einer veränderten Genexpression, die zu einer Anpassung seiner gesamten Zellphysiologie führt. Diese Anpassung ermöglicht das Überleben bei niedrigen Temperaturen, indem die kälteempfindlichen Systeme durch die Induktion kälteprotektiver Proteine geschützt werden. Zu den betroffenen Systemen zählen die gehinderte Initiation der Translation, die durch kältestabilisierte Sekundärstrukturen der mRNA zu Stande kommt, und die abnehmende Fluidität der Zellmembran und der damit gekoppelten Prozesse wie z. B. dem Stofftransport. In dieser Arbeit wurden durch genomweite Transkriptions- und Proteomanalysen neue kälteinduzierte Gene und Proteine identifiziert. Sie wurden auf ihre Relevanz für die Kälteanpassung des B. subtilis hin untersucht. Aus früheren und auch aus diesen Studien ging die Kälteinduktion des Gens yplP hervor. Es wurde gezeigt, dass die Deletion dieses Gens einen kältesensitiven Phänotyp bewirkt und so für die Adaptation nach einem Kälteschock relevant sein könnte. YplP zeigt signifikante Homologien zu den vier bekannten σL-abhängigen Transkriptionsaktivatoren AcoR, BkdR, LevR und RocR. In dieser Arbeit konnte aus Untersuchungen zu allen fünf Aktivatoren und dem σL-Faktor durch Deletionsstudien gekoppelt mit Wachstumsanalysen die Kälterelevanz der zwei Transkriptionsaktivatoren YplP und BkdR, sowie des σL-Faktors für die Kälteanpassung des B. subtilis eindeutig bestätigt bzw. nachgewiesen werden. In biochemischen Untersuchungen mittels EMSA (electrophoretic mobility shift assay) konnte die Zusammenarbeit von SigL mit BkdR gezeigt werden. Sie interagierten jeweils alleine und zusammen mit der zu aktivierenden Target-DNA. Die aus Sequenzanalysen und DNA-Arrays erhaltenen Promotorregionen der putativen Target-Gene von YplP konnten jedoch nicht in einem EMSA mit SigL und YplP interagieren. Somit sind die von σL und YplP zusammen regulierten Gene weiterhin unbekannt. Des Weiteren konnte die Ursache des kältespezifischen Defekts des Stammes JH642 in der Biosynthese der verzweigtkettigen Fettsäuren identifiziert und charakterisiert werden. Er zeigte sich durch ein verlangsamtes Wachstum des Stammes JH642 im Vergleich zum MR168 nach einem Kälteschock. In dieser Arbeit wurde der Defekt über Sequenzanalysen im Gen ilvB lokalisiert. Mittels Komplementationsstudien und biochemischer Charakterisierung durch einen photometrischen Assay wurde IlvB als Quelle für diesen Defekt bestätigt. IlvB ist an der Umwandlung von Threonin zu Isoleucin beteiligt. Isoleucin dient als Vorläufer für die Synthese von verzweigtkettigen Fettsäuren, die für die Kälteanpassung der Membran essentiell sind.

A broad variety of structurally diverse and pharmacologically relevant natural compounds is synthesized by multimodular nonribosomal peptide synthetase (NRPS) assembly lines. Each module within these megaenzyme systems comprises a number of domains that have distinct catalytic functions and interact specifically to ensure the incorporation and modification of one building block. In many cases the products contain D-amino acids, the majority of which is generated in an equilibrium-forming reaction by module integrated epimerization (E) domains from the corresponding peptidyl carrier protein- (PCP-) bound L-intermediates. Within the scope of this work a chemoenzymatic approach was developed in order to investigate the native substrate specificity of four E domains derived from different synthetases. For this purpose, corresponding PCP-E bidomains were isolated at gene level. Two of these constructs (TycB3- and FenD2-PCP-E) originated from elongation modules containing so-called peptidyl-E domains, while the two other (TycA- and GrsA-PCP-E) were derived from initiation modules accordingly including aminoacyl-E domains. The recombinant apo-proteins were overproduced and modified with a selection of peptidyl-CoAs utilizing the promiscuous 4´-phosphopantetheine- (Ppant-) transferase Sfp. Enzyme-bound peptidyl-S-Ppant reaction products of the subsequently occurring stereoinversion catalyzed by the E domains were cleaved chemically and analyzed for their L to D-ratio. Individually calculated kobs values and final L/D-equilibria observed for each reaction showed that all four E domains tolerate various peptidyl-S-Ppants. Apparently, the substrate tolerance of an E domain does not correlate with the specificity of the module (activated amino acid) it originates from. The epimerization efficiency can equally be affected by alterations of the substrate at the C-terminus (directly thioester-bound amino acid) and the N-terminal part. All tested E domains converted N-methylated substrates with great activity. The most interesting observation was the ability of aminoacyl-E domains to epimerize peptidyl-substrates. Additionally, it could be demonstrated that the condensation (C) domain of TycB1 is able to elongate peptidyl-substrates transferred from TycA. In several systems the C-termini of synthetases harbor E domains, which in these cases seem to facilitate the ordered interaction with the following enzyme and the directed transfer of intermediates. Therefore, the second part of the work presented here aimed at elucidating this additional functional role. Bimodular derivatives of the tyrocidine synthetase B were constructed at gene level and the overproduced recombinant proteins were characterized. Initially, sequent tryptic proteolysis and high-resolution mass spectrometry were optimized for the direct interrogation of intermediates attached to the TycB3-PCP domain of the wild-type TycB2-3 and the E domain exchange protein TycB2-3-AT.CAT/EtycA. The E domain exchange significantly affected dipeptide- (Phe-Phe-) formation. In addition, the two mentioned proteins and a version of TycB2-3 fused to the communication-mediating (COM) domain of TycA were applied in product formation assays with the acceptor TycB1 to corroborate E domain impact on intermodular NRPS action. Significant functional differences in terms of in trans interaction and misinitiation were observed between the two types of C-terminal E domains. Peptidyl-E domains seem to be optimized for regulating the progression of peptide bond formation, epimerization, and intermediate transfer to the downstream module, whereas aminoacyl-E domains impair upstream condensation and cause misinitiation. These perceptions will be of fundamental importance for the successful generation of novel bioactive compounds by biocombinatorial rearrangements of NRPSs involving E domains., Naturstoffe mit einem außerordentlich breiten Spektrum an Strukturen und pharmakologischen Bedeutungen werden fließbandartig an multimodular aufgebauten nichtribosomalen Peptidsynthetasen (NRPS) assembliert. Jedes Modul dieser Megaenzyme umfasst dabei eine Anzahl von katalytisch eigenständigen Domänen, deren spezifische Interaktion den Einbau und die Modifikation eines Bausteins sichert. Sehr häufig enthalten die Produkte D-Aminosäuren, die zum Großteil durch modulintegrierte Epimerisierungs- (E-) Domänen aus den entsprechenden über einen Thioester peptidyl carrier protein (PCP) gebundenen L-Intermediaten in einer Gleichgewichtsreaktion erzeugt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein chemoenzymatischer Ansatz zur quantitativen Untersuchung der nativen Substratspezifität von vier unterschiedlichen Synthetasen entstam-menden E-Domänen entwickelt. Dazu wurden entsprechende PCP-E-Didomänen auf geneti-scher Ebene isoliert. Zwei dieser Konstrukte (TycB3- und FenD2-PCP-E) enstammten Elongationsmodulen und enthielten sogenannte Peptidyl-E-Domänen, während die beiden anderen (TycA- und GrsA-PCP-E) Initiationsmodulen entnommen wurden und entsprechend Aminoacyl-E-Domänen trugen. Die Apo-Proteine wurden überproduziert und unter Verwen-dung der promiskuitiven 4´-Phophopantethein- (Ppant-) Transferase Sfp mit einer Auswahl synthetisierter Peptidyl-CoAs fehlmodifiziert. Enzymgebundene Peptidyl-S-Ppant Reaktions-produkte der darauffolgenden, durch die E-Domänen katalysierten Stereoinversion wurden chemisch abgespalten und auf ihr L zu D-Verhältnis untersucht. Wie anhand von jeweils berechneten kobs-Werten und vorgefundenen L/D-Endgleichgewichten evaluiert wurde, tolerieren alle vier getesteten E-Domänen eine Vielfalt von Peptidyl-S-Ppant-Substraten. Es zeigte sich, dass kein Zusammenhang zwischen der Spezifität (aktivierter Aminosäure) eines Moduls und der Toleranz der ihm entstammenden E-Domäne existiert. Veränderungen am N-terminalen Ende des Substrats können dabei gleiche Auswirkungen auf die Epimerisierungs-aktivität haben wie Variationen des C-Terminus (der Thioester gebundenen Aminosäure). Die E-Domänen invertierten N-methylierte Substrate besonders effizient. Hervorzuheben ist die entdeckte Fähigkeit von Aminoacyl-E-Domänen zur Epimerisierung von Peptidyl-Substraten. Außerdem konnte deutlich gemacht werden, dass die Kondensations (C-) Domäne von TycB1 ebenso in der Lage ist, Peptidyl-Substrate von TycA zu empfangen und zu prozessieren. Da E-Domänen in vielen Systemen am C-Terminus einer Synthetase stehen, wurde angenommen, dass sie in dieser Position an der gezielten Interaktion mit dem nachfolgenden Enzym und dem geregelten Transfer von Intermediaten beteiligt sind. Deshalb setzte sich der zweite Teil der vorliegenden Arbeit mit der Beleuchtung dieser funktionellen Rolle auseinander. Es wurden dimodulare Derivate aus der Tyrocidin-Synthetase B auf genetischer Ebene konstruiert und die überproduzierten rekombinanten Proteine charakterisiert. Zunächst wurde eine optimierte Abfolge aus tryptischer Proteolyse und hochauflösender Massenspek-trometrie eingesetzt, um die Bildung von Intermediaten am TycB3-PCP des TycB2-3-Wildtyps und des E-Domänen-Austauschproteins TycB2-3-AT.CAT/EtycA direkt zu verfolgen. Der E-Domänen-Austausch beeinträchtigte die Dipeptid- (Phe-Phe-) Bildung signifikant. Ferner wurden die beiden genannten Enzyme und ein weiteres, bei dem die Kommunikation vermittelnde (COM-) Domäne gegen die entsprechende von TycA ausgetauscht worden war, mit dem Akzeptor TycB1 getestet. Funktionelle Unterschiede zwischen Peptidyl- und Aminoacyl-E-Domänen im Kontext der in trans Interaktion wurden hierbei deutlich. Peptidyl-E-Domänen scheinen für die Regulation von Kondensation, Epimerisierung und Transfer von Zwischenstufen zum downstream Modul optimiert zu sein, während Aminoacyl-E-Domänen die upstream Kondensation beeinträchtigen und Misinitiation hervorrufen. Diese Erkenntnisse werden für die erfolgreiche Gestaltung neuer Wirkstoffe per Biokombinatorik mit NRPS unter Einbeziehung von E-Domänen von Bedeutung sein.

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPS) sind Multienzymkomplexe, die gleichzeitig Templat und biosynthetische Maschinerie für die Herstellung strukturell diverser peptidischer Produkte mit oftmals bedeutender pharmakologischer und biologischer Aktivität repräsentieren. Ein Schlüsselfaktor für die Bioaktivität nichtribosomaler Peptide ist die makrozyklische Struktur vieler dieser Verbindungen. Makrozyklisierung wird durch Thioesterase- (TE-) Domänen im letzten Schritt der nichtribosomalen Synthese katalysiert. Diese Arbeit beschreibt die erste biochemische Charakterisierung einer TE-Domäne eines Streptomyceten: Die Thioesterase des kalzium-abhängigen Antibiotikums (CDA) von S. coelicolor. Diese Zyklase katalysiert die Ringbildung linearer Peptidylthioester, die auf einer zu CDA analogen Sequenz basieren. Hierzu wurde der natürliche Phosphopantethein-Kofaktor durch verschiedene Abgangsgruppen ersetzt. Die höchsten Zyklisierungsraten wurden für die Thiophenol-Abgangsgruppe erzielt. Chemische Reaktivität ist demnach für eine effiziente Enzym-Acylierung wichtiger als Kofaktorerkennung. Die CDA-Zyklase katalysiert die Bildung zweier regioisomerer Laktone durch konzertierten Angriff der benachbarten Reste Thr2 und Ser1 auf das C-terminale Trp11 des Acyl-Enzym-Intermediates. Um diese relaxierte Regioselektivität der CDA TE eingehender zu untersuchen, wurden Änderungen im Peptidrückgrat und der Fettsäure vorgenommen. Substitution von Thr2 oder Ser1 durch Alanin führte zur selektiven Bildung eines Dekapeptid- oder Undekapeptid-Ringes. Die Stereoselektivität der Zyklase blieb voll erhalten, und nur L-konfiguriertes Ser1 bzw. Thr2 wurde toleriert. Elongation der Fettsäure um vier Methyleneinheiten auf die natürliche Länge (C6) von CDA wandelte die relaxierte in eine strikte Regioselektivität um, was zur ausschließlichen Bildung des Dekapeptid-Laktons führte. Zudem wurde weniger Hydrolyse beobachtet. Diese Ergebnisse verdeutlichen den Einfluss der Fettsäure auf die Regio- und Chemoselektivität der TE-vermittelten Makrozyklisierung. CDA gehört, wie das klinisch zugelassene Antibiotikum Daptomycin, den sauren Lipopeptiden an. Um das Potential der CDA-Zyklase zur chemoenzymatischen Synthese von Daptomycin abschätzen zu können, wurden sukzessive sechs Daptomycin-spezifische Reste in lineare CDA-Undekapeptidyl-Thioester eingebaut. Alle sechs Substrate wurden durch die CDA TE zyklisiert. Gleichzeitiger Einbau aller sechs Reste in das CDA-Peptidrückgrat und Verlängerung des N-Terminus um zwei Reste führte schließlich zur Synthese eines Daptomycin-Analogons, dem nur die -Methylgruppe von L-3-Methylglutamat fehlte. In Übereinstimmung mit sauren Lipopeptiden war die Bioaktivität des chemoenzymatisch hergestellten Daptomycin-Derivats von der Anwesenheit von Kalzium abhängig. Um Kalzium-Bindungsstellen in dem Daptomycin-Analogon zu identifizieren, wurden sukzessive alle vier sauren Reste gegen Asn oder Gln ausgetauscht. Bioaktivitätstests wiesen die essentielle Bedeutung von Asp7 und Asp9 für die antimikrobielle Potenz nach. Zudem sind diese Reste in allen nichtribosomalen sauren Lipopeptiden und dem Kalzium-bindenden EF-Motiv ribosomal-hergestellten Calmodulins konserviert. Der letzte Teil dieser Arbeit beschreibt die Detektion von Peptidzyklisierung durch Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET). Hierbei werden der Donor Trp und der Akzeptor Kyn (Kynurenin) durch TE-Domänen-katalysierte Peptidzyklisierung räumlich so nahe zusammengebracht, das effizienter FRET ermöglicht wird. Die beiden Fluorophore konnten mittels Festphasensynthese in das Peptidrückgrat eingebaut werden und zeigen exzellente spektrale Überlappung zwischen Donor-Emission und Akzeptor-Absorption. Mittels dieser Methode konnte TE-vermittelte Zyklisierung in Echtzeit verfolgt werden. Zudem konnten Zyklopeptide im picomolaren Bereich detektiert werden, was kinetische Studien TE-katalysierter Makrozyklisierung erleichterte. Die generelle Anwendbarkeit FRET-unterstützter Detektion von Zyklopeptiden wurde für zwei Zyklasen gezeigt: Tyrocidin (Tyc) TE und CDA TE. Bei letzterer wurde diese Methode mit ortsgerichtetem Affinitätslabelling kombiniert, was neue Möglichkeiten für das Hochdurchsatz-Enzymscreening eröffnete., Nonribosomal peptide synthetases (NRPS) are large multienzyme complexes, which simultaneously represent template and biosynthetic machinery for the production of structurally diverse peptidic products that feature high pharmacological and biological activities. A key determinant of nonribosomal peptide product activity is the common macrocyclic structure of many compounds. Macrocyclization is catalyzed in the last step of nonribosomal synthesis by thioesterase (TE) domain activity. The herein presented work describes the first biochemical characterization of a TE domain of a streptomycete, the thioesterase of the S. coelicolor calcium-dependent antibiotic (CDA) synthetase. This recombinant cyclase catalyzes macrolactone formation of linear peptidyl-thioesters based on a sequence analogous to natural CDA. For substrate mimics, the phosphopantetheine cofactor was successfully substituted by various thioester leaving groups. The best rates for cyclization were determined for the thiophenol leaving group, revealing that chemical reactivity is more important for enzyme acylation than cofactor recognition. Interestingly, CDA cyclase catalyzes the formation of two regioisomeric macrolactones, which arise from simultaneous nucleophilic attack of the two adjacent Thr2 and Ser1 residues onto the C-terminal Trp11 of the acyl-enzyme intermediate. To further explore this relaxed regioselectivity of CDA TE, alterations to the peptide backbone and the fatty acyl chain were made. Substitution of either Thr2 or Ser1 by alanine led to selective formation of a decapeptide or undecapeptide lactone ring. However, the stereoselectivity of CDA cyclase was fully retained, thus accepting only L-configured Ser1 and Thr2 for cyclization. Elongation of the fatty acyl group by four methylene groups to the natural length (C6) of CDA turned the relaxed regioselectivity into a strict regioselectivity, yielding solely the decapeptide lactone ring, along with decreased hydrolysis of the peptidyl-thioester substrate. This provides evidence for the crucial role of the lipid chain in controlling the regio- and chemoselectivity of TE-mediated macrocyclization. CDA belongs to the group of acidic lipopeptides, which includes the clinically approved antibiotic daptomycin. To evaluate the capability of CDA cyclase for the chemoenzymatic generation of daptomycin, six daptomycin-specific residues were successively incorporated into linear CDA undecapeptidyl-thioesters. All these six substrates were efficiently cyclized by CDA TE. Simultaneous incorporation of all six of these residues into the peptide backbone and elongation of the N-terminus of CDA by two residues finally yielded a daptomycin derivative that lacked only the -methyl group of L-3-methylglutamate. In accordance with acidic lipopeptide antibiotics, the bioactivity of the chemoenzymatic assembled daptomycin analogue is dependent on the presence of calcium ions. To identify calcium-binding sites in the lipo-tridecapeptide chain of the daptomycin analogue, all four acidic residues were successively substituted by either Asn or Gln. Bioactivity studies revealed that only Asp7 and Asp9 are essential for antimicrobial potency. Moreover, these two residues are strictly conserved among all other nonribosomal acidic lipopeptides and the calcium-binding EF-motif of ribosomally assembled calmodulin. The final part of this work is dedicated to the selective detection of peptide cyclization by fluorescence resonance energy transfer (FRET). In this approach, peptide cyclization catalyzed by NRPS-derived TE domains brings the donor Trp and the acceptor Kyn (kynurenine) in sufficiently close proximity to enable efficient FRET. Theses fluorophores were readily incorporated into the peptide backbone by solid-phase peptide chemistry and show excellent spectral overlap between the donor emission and acceptor absorption. Application of this method provided a tool to track TE-mediated peptide cyclization in real-time. Furthermore, picomolar detection limits of cyclopeptides were realized, thereby facilitating kinetic studies of TE-mediated macrocyclization. The general utility of FRET-assisted detection of cyclopeptides was demonstrated for two cyclases, namely tyrocidine (Tyc) TE, and CDA TE. For the latter cyclase, this approach was combined with site-directed affinity labelling, opening the possibility for high-throughput enzymatic screening.

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) katalysieren die Synthese einer großen Anzahl strukturell vielfältiger Naturstoffe. Hierbei bestimmen die Anzahl und Organisation von sich wiederholenden Modulen und Domänen innerhalb eines Proteintemplates die Primärstruktur, Größe und Komplexität des synthetisierten Peptid-Produktes. Aufgrund der modularen Organisation sind NRPSs für ein rationales Design prädestiniert, da durch Veränderung der Proteintemplate völlig neuartige Naturstoffderivate generiert werden können. In der Vergangenheit führten derartige Manipulationen zu erheblichen Einbußen in der Produktivität der konstruierten, artifiziellen Systeme, was auf eine gestörte Kommunikation zurückgeführt wurde. Diese Limitationen ließen sich durch den Einsatz evolutiver Verfahren überwinden, wobei jedoch der Aufbau solcher Systeme aufgrund der enormen Größe von NRPSs nicht ohne weiteres möglich ist. In der vorliegenden Arbeit sollten die Grundlagen für den Aufbau von Modellsystemen für die Evolution von NRPSs geschaffen werden. Zum einen wurde ein System für die in vitro-Evolution der Substratselektivität von Adenylierungs-(A)-Domänen aufgebaut. In Anlehnung an vergleichbare Arbeiten an tRNA-Synthetasen wurde hierzu zunächst – ausgehend von TycA – eine A-Domäne geschaffen, in der nahezu alle Konstituenten der Substratbindungstasche zu Alanin mutiert wurden. Auf dem Weg hierhin wurden insgesamt 15 Einzel- und Mehrfachmutanten generiert, die hinsichtlich ihrer katalytischen Effizienz bei der Aktivierung der kognaten Aminosäure L-Phenylalanin, sowie auf die Aktivierung mis- und non-kognater Substrate untersucht wurden. Zur Implementierung des sogenannten in vitro compartmentalization-(IVC)-Systems wurde nachfolgend die beobachtete Nebenselektivität für 3-Nitro-Tyrosin ausgenutzt. Hierbei konnten alle Teilschritte des IVC-Systems zur Evolution der A-Domänenselektivität erfolgreich etabliert werden. Einzig die finale Detektion des Enzym-gebundenen 3-Nitro-Tyrosins scheiterte aufgrund einer unzureichenden Spezifität der kommerziell verfügbaren Antikörper. Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine in vivo-Methode für die Evolution von NRPSs entwickelt. Ausgangspunkt bildete die Konstruktion verschiedener, dimodularer NRPS-Systeme für die heterologe Produktion des zyklischen Dipeptides D-Phe-L-Pro-Diketopiperazin (DKP). Dieses Dipeptid besitzt verschiedene Bioaktivitäten u. a. als Biosensor und Antibiotikum, die im Hinblick auf die Etablierung von in vivo-Selektionssystemen ausgenutzt werden können. Die konstruierten NRPS-Systeme wurden in E. coli untersucht und nachfolgend hinsichtlich ihrer Effizienz optimiert. Durch Variation endo- und exogener Parameter konnte hierbei die Produktivität des heterologen Wirtes E. coli für die nichtribosomale Synthese von D-Phe-L-Pro-DKP um 400 % auf 38 µM (12 mg/g BDW) gesteigert werden. Dieser Produkttiter liegt in einem Bereich, der das generierte NRPS-System für den Aufbau eines auf der antibiotischen Wirkung von DKP basierten in vivo-Selektionssystems qualifiziert., Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) catalyze the synthesis of a large group of structurally diverse natural products. Primary structure, size and complexity of a peptide product are dictated by the number and organization of iterated modules and domains, which constitute the protein template. Due to their modular organization NRPSs are predestinated for a rational protein design. Changing the protein template allows the generation of novel peptide derivatives, but in the past such manipulations often lead to a radical decrease of the productivity of the artificial systems, which is ascribed to a disturbed communication. This limitation might be overcome by protein evolution of NRPSs, although their enormous sizes raise other challenges. The basis for the construction of model systems for the evolution of NRPSs was established in this study. First, a system for in vitro evolution of the substrate selectivity of adenylation-(A)-domains was arranged. Following a similar study on t-RNA synthetases, an A-domain (from the TycA protein) was constructed in which almost all residues forming the substrate binding pocket were changed to alanine, leading to 15 single and multi-ple mutants. These were investigated in regard to their catalytic efficiency in activating the cognate amino acid L-phenylalanine as well as to their ability of activating mis- and non-cognate substrates. An observed site specificity for 3-nitro-tyrosine was used for the implementation of the in vitro compartmentalization-(IVC)-system. It was shown that all partial steps of the IVC-system were established successfully. Merely the final detection of the enzyme bound 3-nitro-tyrosine failed due to an insufficient specificity of the available antibodies. In the second part of this study, an in vivo method for the evolution of NRPSs was developed. It was based on the construction of different dimodular NRPS systems for the heterologous production of the cyclic dipeptide D-Phe-L-Pro-diketopiperazine (DKP). This dipeptide shows diverse bioactive properties e.g. as biosensor or antibiotic that can be used for the establishment of an in vivo selection system. The generated NRPS systems were determined in the host Escherichia coli and optimized with regard to their efficiency of product formation. By varying endo- and exogenous parameters, the productivity of the heterologous host E. coli for the nonribosomal synthesis of D-Phe-L-Pro-DKP could be increased about 400 % to 38 µM (12 mg/g BDW). This concentration of the dipeptide is sufficient for the generation of an in vivo selection system based on the antibiotic effect of DKP.

Die Kälteschockadaptation erfolgt in Mikroorganismen nach einem rapiden Abfall der Umgebungstemperatur. Ein Temperaturschock von 37°C auf 15°C hat sich zur Untersuchung der Kälteschockantwort in mesophilen Bakterien durchgesetzt. B. subtilis reagiert auf diesen Kälteschock mit der globalen Veränderung seiner Genexpression. Diese Veränderung führt in dem kältegeschockten Bakterium zu einer Anpassung seiner Zellphysiologie, die ihm das Wachstum bei niedrigen Temperaturen ermöglicht. Dabei schützt B. subtilis die Funktion seiner kälteempfindlichen Systeme durch die rasche Induktion kälteprotektiver Proteine. Zu den bekannten kälteempfindlichen Systemen in B. subtilis gehören die Translationsinitiation und die Proteinbiosynthese am Ribosom, die Faltung von mRNA durch die Bildung kältestabilisierter Sekundärstrukturen und die abnehmende Fluidität der Zellmembran und dadurch bedingten Funktionsverlust der membrangekoppelten Prozesse. In dieser Arbeit wurden bislang unbekannte kälteinduzierte Proteine und Gene aus B. subtilis durch systematische Untersuchungen mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese und genomweiter Transkriptionsanalyse identifiziert. Diese kälteinduzierten Gene wurden auf eine Beteiligung an der Kälteschockanpassung untersucht. Ein kältespezifischer Phänotyp konnte für eine DyplP-Mutante und eine DyqfR/DydbR-Doppelmutante beobachtet werden. Das yplP-Gen kodiert für einen von fünf homologen sL-abhängigen Transkriptionsaktivatoren in B. subtilis, dessen Rolle für die Kälteschockanpassung noch nicht geklärt werden konnte. Die Gene yqfR und ydbR kodieren für DEAD-Box mRNA-Helikasen, die bereits in mehreren Organismen als kälteinduzierte Proteine identifiziert wurden. In dieser Arbeit durchgeführte fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von GfP-Fusionen konnten die transkriptionsabhängige Kolokalisierung der Helikasen YdbR und YqfR aus B. subtilis mit den CSP und Ribosomen an den Zellpolen zeigen. Ausgehend von diesem Experiment wird ein Modell vorgeschlagen, in dem die RNA-Helikasen kältestabilisierte Sekundärstrukturen von mRNA entwinden. Danach kann die mRNA von den CSP gebunden werden, wodurch die Translationsinitiation bei niedrigen Temperaturen erleichtert wird. Außerdem wurde in dieser Arbeit die Regulation der Fettsäuredesaturase Des aus B. subtilis untersucht. Die Desaturase Des erhöht die Fluidität der Zellmembran nach Kälteschock durch die Synthese ungesättigter Fettsäuren in der Membran. Genetische Experimente konnten zeigen, dass die Transkription des des Gens durch das temperatursensitive Zweikomponentensystem DesKR aus B. subtilis reguliert wird. Die kältespezifische Regulation weiterer Gene durch DesKR konnte ausgeschlossen werden., Unknown cold-induced proteins and genes of Bacillus subtilis were identified by two-dimensional gelelectrophoresis and genomewide transcriptional analysis. The role of the cold-induced genes in the adaptation to low temperature was investigated. A cold-specific phenotype was observed for a yplP deletion mutant and a yqfR/ydbR double-deletion mutant. The yplP-gene encodes a sigL-dependent transcriptional activators in B. subtilis. The YplP-regulon is currently unknown. The genes yqfR and YdbR encode for DEAD-box mRNA-helicases, which were already identified as cold-induced proteins in several microorganisms. It could be demonstrated by fluorescence-microscopy of helicase-gfp fusions that the RNA helicase co-localize at the cell-poles with coldshock-proteins and ribosomes, depending on active transcription. Based on this experiment the following model was proposed: The RNA-helicases unwind cold-stabilized secondary structures of mRNA. After that the coldshock-proteins bind to the mRNA to prevent refolding of mRNA, resulting in efficient initiation of translation at low temperatures. In addition the regulation of the fatty-acid desaturase Des of Bacillus subtilis was investigated. The desaturase Des maintains the fluidity of the membrane after coldshock by synthesis of unsaturated fatty-acids in the membrane. Genetic studies could show that the transcription of the des-gene is regulated by the temperature-sensitive two-component system DesKR of Bacillus subtilis. The cold-specific regulation of other genes by DesKR could be excluded.

Many microorganisms use multimodular nonribosomal peptide synthetases (NRPS) for the production of structurally diverse and pharmacological interesting compounds. Each module within these multifunctional NRPSs represents a functional unit of catalytic domains, which is responsible for recognition, activation and incorporation of the substrate into the growing peptide product. Due to the modular arrangement NRPSs are especially suitable for the construction of artificial enzymes. In this work different strategies of domain and module fusions were used to develop dimodular synthetases for the production of the dipeptide alpha-aspartyl-phenylalanine (Asp-Phe), which is used as a precursor in the production of the high intensity sweetener aspartame. Comparison of six Asp-Phe-Synthetases exposed the influence of artificial fusions on the activity of the hybrid enzymes. Varying turnover rates as well as turnover-dependent formation of the by-product beta-Asp-Phe were observed. The knowledge to design hybrid peptide synthetases is enlarged by this comparison of different fusion strategies. Structural diversity of nonribosomally synthesized peptides is mainly insured by catalysis of modifying domains. The remarkable heterocyclization-(Cy)-domain catalyzes the peptide bond-formation associated with the cyclization of the side chains of cysteine, serine or threonine. This reaction results in the formation of thiazoline and oxazoline rings respectively. Based on the first two modules of the bacitracin synthetase A, a model system was constructed that produces the heterocyclic isoleucinylcystein. Starting from this model system dimodular hybrid synthetases were assembled, which were able to form new heterocyclic products. The activities of these constructs demonstrate the biocombinatorial potential of the Cy-domain. Additionally the reaction sequence of peptide bond-formation and cyclization was clarified by mutation of conserved residues within the Cy-domain of the model system. On the basis of mutated synthetases that catalyzes the peptide bond-formation but not the cyclization, the independence of condensation and heterocyclization was demonstrated., Die modular aufgebauten, multifunktionalen nichtribosomalen Peptid-synthetasen (NRPS) katalysieren in vielen Mikroorganismen die Produktion strukturell vielfältiger, pharmakologisch interessanter Naturstoffe. Für die Integration eines Bausteins in das wachsende Produkt ist jeweils ein Modul verantwortlich, welches seinerseits in einzelne Domänen unterteilt werden kann. Diese Domänen katalysieren die Erkennung, Aktivierung und den Einbau der Substrate. Aufgrund ihrer modularen Organisation stellen die NRPS ein geeignetes System für die gezielte Entwicklung artifizieller Enzyme dar. In dieser Arbeit wurden verschiedene Strategien der Domänen- und Modulfusion verfolgt, um dimodulare Synthetasen für die Produktion des Dipeptids alpha-Aspartyl-Phenylalanin (Asp-Phe), das als Vorläufer in der Produktion des Zuckerersatzstoffs Aspartam eingesetzt wird, zu entwickeln. Ein Vergleich von sechs Asp-Phe-Synthetasen verdeutlicht die Auswirkungen von künstlichen Fusionen auf die Aktivität der Enzyme. So konnten deutliche Unterschiede in der Umsatzrate sowie die von der Umsatzrate abhängige Synthese des Nebenprodukts beta-Asp-Phe beobachtet werden. Durch den Vergleich verschiedener Fusionsstrategien am Beispiel der Asp-Phe-Synthetasen konnte das Wissen über das Design hybrider Peptidsynthetasen erweitert werden. Die strukturelle Vielfalt nichtribosomal synthetisierter Peptide wird nicht zuletzt durch die Katalyse von modifizierenden Domänen gewährleistet. Eine spezielle Domäne ist die Heterozyklisierungs-(Cy)-Domäne. Sie katalysiert neben der Bildung einer Peptidbindung die Zyklisierung der Seitenkette von Cystein, Serin oder Threonin zu Thiazolin- bzw. Oxazolin-Ringen. In dieser Arbeit wurde, basierend auf den ersten beiden Modulen der Bacitracin-Synthetase A, ein Modellsystem zur Untersuchung der Cy-Domäne entwickelt, welches das heterozyklische Isoleucinyl-Thiazolinylcystein bildet. Ausgehend von diesem Modellsystem konnten durch Modulfusionen dimodulare Hybridsynthetasen konstruiert werden, deren Fähigkeiten, neue heterozyklische Produkte zu bilden, das biokombinatorische Potential der Cy-Domäne verdeutlichen. Zusätzlich konnte durch Mutation von konservierten Resten innerhalb der Cy-Domäne des Modellsystems die Reaktionsabfolge von Peptidbindungsbildung und Zyklisierung aufgeklärt werden. Anhand der erhaltenen, mutierten Synthetasen, die nur noch die Bildung der Peptidbindung aber nicht die nachfolgende Zyklisierung katalysieren, konnte der Beweis für die Unabhängigkeit von Kondensations- und Heterozyklisierungsreaktion innerhalb der Cy-Domäne erbracht werden.

ÖZET DİPEPTİD BİYOSENTEZİNIN MOLEKULER BİYOLOJİ VE GENETİĞİ: SİSTEM, HÜCRE YOĞUNLUĞUNUN ALGILANDIĞI GLOBAL DÜZENLEME ZİNCİRİNİN ÇOK ÖNEMLİ BİR HALKASD3IR Karataş, Ayten Doktora, Biyoteknoloji Bölümü Tez yöneticisi: Prof. Gülay Özcengiz Ortak tez yöneticisi: Prof. Mohamed A. Marahiel Eylül 2000, 141 pages B. subtilis PY79'da (standard 168 susunun prototrofik türevi) dipeptid antibiyotik bacilysin biyosentezinden sorumlu genlerin izolasyonu için transpozon mutaj enezi yaklaşımı kullanılmıştır. Bloke olmuş mutantlar transpozon kütüphanesinden biyoassay yoluyla fenotipik olarak seçilmiş, daha sonra ESI-kütle spektrometri analizleri ile biyosentetik kapasiteyi tamamen kaybeden mutantlar belirlenmiştir. Transpozon kütüphanesinden 4 farklı bacilysin üretemeyen mutant [AKİ, AK2, AK3, and AK4] izole edilmiş, bu mutantlarda bloke olan genler klonlanmış, nükleotid dizileri analiz edilerek ilgili genler karakterize edilmiştir. Bu genler, sırasıyla, ihyA (timidilat sentetaz), ybgG (bilinmeyen protein, homoserin methyl VItransferazlara benzemektedir) ve oppA (oligopeptid permeaz) olarak belirlenmiştir. Opp proteinin bacilysin biyosentezi ile ilgisinin kanıtlanması, biyosentezin `hücre yoğunluğunun algılandığı` ve sporlanmamn (farklılaşmamn) başlamasından, kompetans oluşmasmdan ve bazı B. subtilis suşlannda surfaktin biyosentezinin gerçekleşmesinden sorumlu global kontrol (fosforelay sistemi) zincirinde esasiyel bir yer oluşturduğunu açığa çıkarması bakımından çok önemli bir bulgudur. İlgili fizyolojik çalışmalar, bu bulguyu daha da güçlendirmiştir. Yine bu çalışma kapsamında kısmen saflaştırılmış bir enzim fraksiyonu kullanılarak biyosentetik mekanizmaya ilişkin araştırmalar da yapılmıştır. In vitro bacilysin biyosentezi, sentezlenen antibiyotiğin saf bacilysin ile ince tabaka kromatografi ve biyootografi yöntemleri kullanılarak karşılaştırılması ile doğrulanmıştır. Yüksek basmçlı jel filtrasyon kromatografisi (Superdex 200 kolonu) ile büyüklüğü yaklaşık 125 kDA olarak belirlenen enzim, DEAE- Sepharose kolonu kullanılarak gerçekleştirilen yüksek basmçlı anyon kromatografisi ile daha ileri saflaştırılmıştır. Enzimatik bacilysin biyosentezinin ATP yada 2'-deoxy ATP'ye ve yapışım oluşturan amino asitlerin varlığına gereksinim gösterdiği gösterilmiştir. Amino asit aktivasyonu mekanizmasının belirlenmesi için, yapısındaki amino asitlerle, L- alanin ve L-anticapsin ile ATP- PPi ve ATP-Pi değişim reaksiyonları yapılmıştır. Enzim, L-alanin'e bağlı ATP- PPi değişim reaksiyonunu katalizlemiş, ancak diğer sübstratı L-anticapsin' i aym yolla aktive etmemiştir. Bir modifiye amino asit olan anticapsin'in `amino asit fosfat` formunda aktive edildiğine dair de herhangi bir ipucuna rastlanmamıştır. Pantotenik asitin biyosentetik enzimde yer aldığı gösterilmiş, L-alanin'in tiyoester Vllformunda enzime bağlandığının kamtianmsı pantotenik asit varlığına ilişkin sonucu desteklemiştir. Tüm bu bulgular, bacilysin biyosentezi mekanizmasının peptid sentetazlar için önerilen `çoklutaşıyıcı tiyokalıp modeli` ile tüm olarak örtüşmediğini göstermiş olup peptid biyosentezinde alternatif model(ler)in varlığma işaret etmiştir. Bu çalışmada, bacilysinin hızlı ve hassas tayini için HPLC-ESI kütle analizi yöntemi geliştirilmiş ve ilgili moleküler çalışmalarda etkin bir biçimde kullanılmıştır. Anahtar kelimeler: Bacilysin, bacilysin sentetaz, peptid antibiyotikler, sekonder metabolitler, B. subtilis, sporulasyon, kompetens. vuı ABSTRACT MOLECULAR BIOLOGY AND GENETICS OF DIPEPTIDE BIOSYNTHESIS: THE SYSTEM IS AN ESSENTIAL COMPONENT OF QUORUM-SENSING GLOBAL REGULATION Karataş, Ayten Ph.D., Department of Biotechnology Supervisor: Prof. Gülay Özcengiz Co-supervisor: Prof. Mohamed A. Marahiel September, 2000, 141 pages Transposon mutagenesis was employed to isolate the gene(s) related with the biosynthesis of dipeptide antibiotic bacilysin in Bacillus subtilis PY79 (a prototrophic derivative of the standard 168 strain). The blocked mutants were phenotypically selected from the transposon library by bioassay and the complete loss of biosynthetic ability was verified through ESI-mass spectrometry analyses. Four different bacilysin nonproducer mutants [Bac` 141