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BackgroundCOVID-19 severity has been linked to an increased production of inflammatory mediators called “cytokine storm”. Available data is mainly restricted to the first international outbreak and reports highly variable results. This study compares demographic and clinical features of patients with COVID-19 from Córdoba, Argentina, during the first two waves of the pandemic and analyzes association between comorbidities and disease outcome with the “cytokine storm”, offering added value to the field.MethodsWe investigated serum concentration of thirteen soluble mediators, including cytokines and chemokines, in hospitalized patients with moderate and severe COVID-19, without previous rheumatic and autoimmune diseases, from the central region of Argentina during the first and second infection waves. Samples from healthy controls were also assayed. Clinical and biochemical parameters were collected.ResultsComparison between the two first COVID-19 waves in Argentina highlighted that patients recruited during the second wave were younger and showed less concurrent comorbidities than those from the first outbreak. We also recognized particularities in the signatures of systemic cytokines and chemokines in patients from both infection waves. We determined that concurrent pre-existing comorbidities did not have contribution to serum concentration of systemic cytokines and chemokines in COVID-19 patients. We also identified immunological and biochemical parameters associated to inflammation which can be used as prognostic markers. Thus, IL-6 concentration, C reactive protein level and platelet count allowed to discriminate between death and discharge in patients hospitalized with severe COVID-19 only during the first but not the second wave.ConclusionsOur data provide information that deepens our understanding of COVID-19 pathogenesis linking demographic features of a COVID-19 cohort with cytokines and chemokines systemic concentration, presence of comorbidities and different disease outcomes. Altogether, our findings provide information not only at local level by delineating inflammatory/anti-inflammatory response of patients but also at international level addressing the impact of comorbidities and the infection wave in the variability of cytokine and chemokine production upon SARS-CoV-2 infection.

Immunoprophylaxis for bovine babesiosis has two presentations of a live attenuated vaccine (fresh and deep-frozen). Despite being effective, their durability, as well as the conditions necessary for their transfer and handling, make them impractical. The incorporation of a third presentation, using dehydrated merozoites as immunogens, constitutes an innovative alternative, which combines practicality and stability over time. The objective of this work was to test dehydration processes and cryopreservative and rehydrating substances. For this, erythrocytes highly parasitized with Babesia bovis and B. bigemina were subjected to two dehydration techniques: lyophilization and spray drying. In turn, for the lyophilization process, several lyoprotectants were tested: Dimethylsulfoxide, Glycerol, Dextrose and Polyvinylpyrrolidone (PVP). The only one that achieved a properly dehydrated powder, crystalline in appearance and brittle to the touch was the PVP. Subsequently, the erythrocytes obtained by both techniques were reconstituted with sucrose solutions (0.25, 0.5, 1 M), 0.9% saline solution, Vega y Martínez solution, phosphate buffer and distilled water. Optical microscopy with an immersion objective showed that the best reconstituent for both lyophilized and spray-dried red blood cells was the 0.25 M sucrose solution, showing a high number of lyophilized and reconstituted red blood cells with preserved morphology. Extrapolating these results to the haemoparasites under study, their application as immunogens would be promising., La inmunoprofilaxis de la babesiosis bovina cuenta con dos presentaciones de una vacuna viva atenuada (fresca y ultracongelada). Pese a ser efectivas, su durabilidad, así como las condiciones necesarias para su traslado y manipulación, las hacen poco prácticas. La incorporación de una tercera presentación, utilizando merozoitos deshidratados como inmunógenos, constituye una innovadora alternativa, que combina practicidad y estabilidad en el tiempo. El objetivo del presente trabajo fue ensayar procesos de deshidratación y sustancias criopreservadoras y rehidratantes. Con este fin, eritrocitos altamente parasitados con Babesia bovis y B. bigemina fueron sometidos a dos técnicas de deshidratación: liofilización y secado por aspersión. A su vez, para el proceso de liofilización se ensayaron varios lioprotectores: Dimetilsulfóxido, Glicerol, Dextrosa y Polivinilpirrolidona (PVP). El único que logró un polvo adecuadamente deshidratado, de aspecto cristalino y quebradizo al tacto fue la PVP. Posteriormente, los eritrocitos obtenidos por ambas técnicas fueron reconstituidos con soluciones de sacarosa (0.25, 0.5, 1 M), solución salina 0.9%, solución Vega y Martínez, buffer fosfato y agua destilada. La microscopía óptica con objetivo de inmersión evidenció que el mejor reconstituyente tanto para los glóbulos rojos liofilizados como para los secados por aspersión fue la solución de sacarosa 0.25 M, pudiéndose apreciar un alto número de glóbulos rojos liofilizados y reconstituidos con morfología conservada. Extrapolando este comportamiento a los hemoparásitos en estudio, resultaría promisoria su aplicación como inmunógenos.

The therapeutic benefit of phosphorothioate oligodeoxynucleotides (PS-ODN) containing immune stimulatory sequences has been demonstrated in animal models of cancer and infection. Several tools are available for the determination of these oligonucleotides in biological samples and pharmaceutical preparations, including UV spectroscopy, dye binding, isotopic tracing, capillary gel electrophoresis (CGE), hybridization-based enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), and chromatography techniques. However, due to inter-assay variability and accuracy problems associated with the afore mentioned methods, we have developed and validated an isocratic high performance liquid chromatographic (HPLC) for analytical determination of PS-ODN containing unmethylated CpG motifs (CpG-ODN). Validation under Food and Drug Administration (FDA) guidelines of the analytical parameters include: linearity (r2 0.9996), LOD (0.86 lg/ml) and LOQ (6.25 lg/ml), intra (0.19?3.37%) and inter-day precision (0.63?3.75%) expressed as relative standard deviation (RSD), and robustness parameters (less than 2.80%). Using this method, recoveries ranging from 89.9% to 99.9% were obtained. Thus, this method provides a simple, sensitive, precise and reproducible examination which can be readily adapted for the assessment of CpG-ODN in different pharmaceutical preparations. Fil: Ullio Gamboa, Gabriela Veronica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina Fil: Llabot, Juan Manuel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina Fil: Sánchez Vallecillo, María Fernanda. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Maletto, Belkys Angélica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Palma, Santiago Daniel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina Fil: Allemandi, Daniel Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Córdoba. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina

Although much is described about the molecules involved in neutrophil migration from circulation into tissues, less is known about the molecular mechanisms that regulate neutrophil entry into lymph nodes (LNs) draining a local inflammatory site. In this study, we investigated neutrophil migration toward LNs in a context of inflammation induced by immunization of BALB/c mice with OVA emulsified in CFA. We demonstrated that neutrophils can enter LNs of OVA/CFA-immunized mice not only via lymphatic vessels but also from blood, across high endothelial venules. By adoptive transfer experiments, we showed that this influx was dependent on an inflammatory-state condition and previous neutrophil stimulation with OVA/anti-OVA immune complexes. Importantly, we have demonstrated that, in the migratory pattern to LNs, neutrophils used L-selectin and P-selectin glycoprotein ligand-1, macrophage-1 Ag and LFA-1 integrins, and CXCR4 to get access across high endothelial venules, whereas macrophage-1 Ag, LFA-1, and CXCR4 were involved in their trafficking through afferent lymphatics. Strikingly, we found that stimulation with immune complexes significantly upregulated the expression of sphingosine-1-phosphate receptor 4 on neutrophils, and that treatment with the sphingosine-1-phosphate agonist FTY720 altered neutrophil LN-homing ability. These findings summarized in this article disclose the molecular pattern that controls neutrophil recruitment to LNs. Fil: Gorlino, Carolina Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Ranocchia, Romina Paola. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Harman, María Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: García, Iris Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Crespo, Maria Ines. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Moron, Victor Gabriel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Maletto, Belkys Angélica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina Fil: Pistoresi, Maria Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Córdoba. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 Giardia lamblia es un parásito protozoario que coloniza el epitelio intestinal de humanos y otros vertebrados. Las infecciones varían de agudas a crónicas, dependiendo de la susceptibilidad del hospedador y la cepa del parásito. En este trabajo de tesis, mostramos que los subtipos genéticos (ensamblajes) A y B de Giardia lamblia que infectan humanos poseen la capacidad de formar y liberar al medio extracelular vesículas de diferentes tamaños. Además, hemos realizado el primer análisis proteómico de las vesículas extracelulares de ambos ensamblajes y encontramos que, tanto las vesículas de tipo microvesículas como las de tipo exosomas, podrían estar seleccionando el contenido de proteínas conservadas y específicas de G. lamblia. Por otra parte, realizamos una combinación de metodologías que nos permitieron demostrar que G. lamblia secreta al medio extracelular vesículas que son notablemente similares a exosomas de otros tipos celulares en términos de tamaño, forma, densidad y presencia de proteínas típicas. Los resultados obtenidos también mostraron que, a pesar de la falta de cuerpos multivesiculares típicos presentes en el parásito, se pueden formar vesículas de tipo exosomas (tExo) en las vacuolas periféricas (PVs) endo-lisosomales de G. lamblia. Además, análisis ultraestructurales y determinación de la cantidad de tExo liberados mostraron que la actividad ATPasa de la proteína ESCRT Vps4a de G. lamblia y la presencia de la pequeña GTPasa Rab11, son esenciales para la formación de vesículas intraluminares en la PVs y, en consecuencia, para la obtención de tExo en el medio extracelular. También, observamos que la alteración en la función de GlVps4a genera una acumulación inusual de material electrodenso en las PVs, lo que indica que GlVps4p podría estar implicada en el mantenimiento del contenido de estas vacuolas. Los resultados observados, en su conjunto, sugieren que este parásito es capaz de producir diferentes tipos de vesículas extracelulares mediante mecanismos conservados, aunque con características únicas. 2023-06-30 Moyano, Sofía. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Touz, María Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Alvarez, Cecilia Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Cumino, Andrea Carina. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Biología; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Durante las últimas décadas se han comenzado a desarrollar las denominadas “vacunas de la nueva generación”. Su diseño difiere de las vacunas tradicionales y está basado en el uso de antígenos altamente purificados o recombinantes débilmente inmunogénicos combinados con poderosas estrategias adyuvantes capaces de compensar esta pérdida de inmunogenicidad. Adicionalmente el mayor problema de los adyuvantes licenciados para uso humano recae en su incapacidad de generar una respuesta del tipo celular Th1 y T CD8+ citotóxica adecuada para proteger contra patógenos intracelulares que perdure en el tiempo. El oligodeoxinucleótido con motivos citocina fosfato guanina no metilados (CpG-ODN), ligando sintético agonista del receptor de la respuesta inmune innata tipo toll 9 (TLR9), ha sido ampliamente considerado por sus efectos inmunoestimulantes como un candidato ideal como adyuvante. El CpG-ODN tiene la capacidad de generar una respuesta humoral y adicionalmente polarizar la respuesta inmune celular hacia un perfil Th1, induciendo también, bajo ciertas modalidades, células T CD8+ citotóxicas. Sin embargo, padece de una biodisponibilidad reducida, lo cual afecta su desempeño. Con el objetivo de optimizar su actividad adyuvante, proponemos una nueva estrategia de formulación para el CpG-ODN basado en un sistema nanoestructurado derivado de palmitato de ascorbilo (Coa-ASC16). En este trabajo, demostramos el potencial de una formulación constituida por ovoalbúmina (OVA), CpG-ODN y el Coa-ASC16 (OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16) para generar una respuesta humoral superior en magnitud y calidad que la solución OVA/CpG-ODN. La magnitud de dicha respuesta humoral resultó ser independiente de la vía de señalización mediada por IL-6. Además, la inmunización con OVA/CpG-ODN fue capaz de inducir una robusta respuesta de células T CD8+ citotóxicas efectoras, dependiente de interferones tipo I e independiente de IL-6 y de la asistencia mediada por células T CD4+. Consistentemente con esos resultados, la estrategia adyuvante demostró promover la internalización simultánea de OVA y CpG-ODN por células dendríticas. En adición, también fue capaz de inducir una buena respuesta de células T CD8+ de memoria. Ambas respuestas celulares T CD8+, efectora y de memoria, probaron su eficiencia protegiendo contra un modelo de infección intracelular con Listeria monocytogenes. Por otra parte, esta plataforma permite la reducción del número de inmunizaciones y la dosis antigénica sin afectar significativamente la inmunidad humoral o celular generada. Estos resultados demuestran el potencial de esta innovadora estrategia adyuvante para el desarrollo de futuras vacunas. Chiodetti, Ana Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Maccioni, Mariana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas.Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Allemandi, Daniel Alberto. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Unidad de Investigación y Desarrollo en Tecnología Farmacéutica; Argentina. Rumbo, Martín. Universidad Nacional de La Plata. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Estudios Inmunológicos y Fisiopatológicos; Argentina.

La regeneración axonal es una respuesta de las células nerviosas dañadas necesaria y crítica para la reparación del nervio en neuropatías agudas immunes humanas, tales como el Síndrome de Guillaín Barré (SGB). Muchos estudios clínicos asocian la presencia de anticuerpos anti-gangliósidos (anticuerpos anti-Ggs) con recuperación incompleta en SGB. La transferancia pasiva del anticuerpo monoclonal anti-GD1a/GT1b (clon 1137) inhibe la regeneración axonal en un modelo animal. Cultivos de neuronas disociadas DRGs (ganglio de la raíz dorsal, por sus siglas en inglés) (DRGn) demostraron que el anticuerpo anti-Ggs inhibe el crecimiento neurítico a través de la vía dependiente de RhoA/ROCK. Sin embargo, los mecanismos moleculares inducidos por el anticuerpo anti-Ggs que desencadenan la activación de RhoA no han sido esclarecidos. Este trabajo explora las bases moleculares del efecto inhibitorio del anticuerpo anti-Ggs sobre la regeneración axonal de neuronas DRGs tanto en modelos in vitro como in vivo. El efecto del anticuerpo anti-Ggs sobre la dinámica del citoesqueleto en conos de crecimiento (CC) asocidado con el efecto inhibitorio sobre la regeneración axonal fue analizada por video microscopía. Encontramos que la inhibición en DRGs inducidas por el anticuerpo monoclonal dirigido contra los gangliósidos GD1a/GT1b (clon 1137) involucra: i) un colapso temprano de lamela a través de una vía independiente de RhoA/ROCK; u) una retracción de filopodios dependiente de RhoA/ROCK; y iii) alteraciones en la organización/dinámica de microtúbulos en el cono de crecimiento mediante la fosforilación de la proteina que media la respuesta de colapso del cono 2 (CRMP-2) en la treonina 555 dependiente de la vía de señalización RhoA/ROCK. Estos resultados fueron confirmados en un modelo in vivo, donde la inhibición de la regeneración axonal inducida por el anticuerpo anti-Ggs se produjo mediante la fosforilación/inactivación de la proteina CRMP-2 en la treonina 555. En conclusion, este trabajo sugiere que el anticuerpo 1137 inhibe la regeneración axonal mediante vías dependiente e independiente de RhoA/ROCK a través de la desestabilización de microtúbulos. Axon regeneration is the response of injured nerve celis critical for nerve repair in human acute immune neuropathies, like Guillain Barré Syndrome (GBS). Severa¡ clinical studies associate the presence of anti-ganglioside antibodies (anti-Gg abs) with poor recovery in GBS. Passive transfer of mAb (GD1a/GTlb, done 1137) halts axon regeneration in experimental models. Cultures of dissociated DRG neurons (DRGn) demonstrated that anti- Gs inhibits neurite outgrowth through a RhoA/ROCKdependent pathway. However, molecular intermediates between anti-Gg abs and RhoA activation have not been described. This work explores the molecular basis of the inhibitory effect of anti-Gg abs on axon regeneration of DRG neurons (DRGn) both in vitro and in vivo. Time-lapse video microscopy was used to study their cytoskeleton dynamics at growth cones (GC) in DRGn cultures. We now report that axon growth inhibition in DRGn induced by a well characterized mAb targeting gangliosides GD1a/GT1b (done 1137) involves: i) an early RhoA/ROCK-independent collapse of lamellipodia; u) a RhoA/ROCK-dependent shrinking of fulopodia; and iii) alteration of GC microtubule organization/and presumably dynamics via RhoA/ROCK-dependent phosphorylation of CRMP-2 at threonine 555. Our results also show that mAb 1137 inhibits peripheral axon regeneration in an animal model via phosphorylation/inactivation of CRMP-2 at threonine 555. In conclusion, this work suggest that anti-Ggs ab impair axon regeneration by RhoA/ROCKdependent and independent signaling pathways. Fil: Rozés Salvador, María Victoria. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: Lopez, Pablo Héctor Horacio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra; Argentina. Fil: Nores, Gustavo Alejandro. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Nores, Gustavo Alejandro. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Cancela, Liliana Marina. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Cancela, Liliana Marina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angélica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Paratcha, Gustavo. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina; Argentina. Fil: Paratcha, Gustavo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología Celular y Neurociencia "Profesor Eduardo de Robertis"; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016 La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruz¡, afecta a 8 millones de personas e impone una importante carga económica debido a la mortalidad temprana y discapacidad fisica. Es endémica en América Latina, pero se convirtió en un problema de salud pública mundial por la migración de las personas infectadas. La progresión de la enfermedad, desde asintomática a grave, está vinculada a la heterogeneidad de las distintas cepas del parásito existentes y a una variable respuesta inmune del hospedador infectado. Se ha informado que la persistencia del parásito, así como la intensidad de la respuesta inflamatoria son determinantes de las manifestaciones clínicas de la enfermedad [1, 21. A pesar de que la inflamación es indispensable para la defensa del huésped [3-14], cuando está desregulada puede contribuir a lesiones tisulares y disfunción orgánica [15-19]. En consecuencia, la identificación de la naturaleza de las células y moléculas capaces de mantener la integridad del hospedador, así como la replicación del patógeno, es crucial para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Chagas y también para el diseño de nuevos enfoques terapéuticos. La fase aguda de la enfermedad de Chagas en ratones y seres humanos se caracteriza por un estado de inmunosupresión en el que T. cruz¡ se replica extensivamente e induce moléculas inmunomoduladoras que retrasan las respuestas de linfocitos (Li) T específicos del parásito. Este estado de las células T coexiste con la activación policlonal de LiB, lo que sugiere que los LiB pueden influir en la función de LiT y viceversa. Durante la infección por T cruz¡, se ha establecido que los LiB tienen un rol protector fundamental [20], y se ha descripto que los anticuerpos (Acs), los cuales son producto de estas células, pueden ejercer funciones tanto protectoras [21-23] como deletéreas (Acs autoreactivos) [24, 251]. Sin embargo, no se han descripto en profundidad mecanismos ejercidos por los LiB independientes de su capacidad para producir Acs. Últimamente, en diversos modelos experimentales, se han reportado funciones regulatorias tanto para los LiB [26] como para LiB que expresan CD138 y que corresponden a estadios de diferenciación, denominados plasmoblastos y/o células plasmáticas (PL/CP), siendo las células plasmáticas (CF) el estadio de diferenciación terminal [27-30]. La mayoría de los mecanismos regulatorios, ejercidos por las células mencionadas, involucran la secreción de citoquinas [28-31]. Sin embargo, queda por esclarecer el posible papel regulador desempeñado por los LiB y los PL/CP vía moléculas inhibitorias expresadas en la superficie celular. Es por ello que el objetivo de este trabajo de tesis fue: Evaluar la función regulatoria de los LiB y de su producto de diferenciación, los PL/CP, sobre la respuesta 1q inflamatoria disparada en la infección con T. cruz¡ y tratar de identificar alguno de los mediadores involucrados. Para ello, utilizamos un modelo de infección en ratones ya descripto y en curso en nuestro laboratorio, que consiste en la infección de ratones C57BL/6 (controles, del Inglés: WT) con tripomastigotes del T cruzi cepa Y-br. Para llevar a cabo nuestro objetivo empleamos además ratones muMT, los cuales son ratones modificados genéticamente deficientes en LiB maduros. Observamos que los ratones muMT infectados presentan una prematura mortalidad pero son capaces de controlar la replicación del T. cruz¡. Los ratones muMT infectados presentaron un aumento significativo en la concentración plasmática de IFN-y y TNF, en comparación a ratones WT infectados; sugiriendo que en ausencia de LiB la infección dispara una exacerbada respuesta inmune pro-inflamatoria. En particular, los ratones muMT infectados presentaron alteraciones clínicas y bioquímicas asociadas a elevados niveles de TNF en suero, y una correlación entre la concentración de TNF y su mortalidad. El bloqueo de TNF promovió una recuperación inicial en el peso corporal de los ratones muMT infectados tratados, pero a tiempos tardíos los ratones murieron por exacerbación de la respuesta pro-inflamatoria. En correlación con los incrementados valores de TNF en plasma, los ratones muMT infectados presentaron un mayor porcentaje y número relativo de células productoras de TNF en bazo y ganglios linfáticos. En particular, la composición de la población secretora de TNF de los ratones muMT infectados con respecto a ratones WT infectados fue diferente; contenía un mayor porcentaje de LiT CD4*Ly6C+, LiT CD8Ly6C y de células con fenotipo de neutrófilo Ly6GLy6C. A su vez, siendo los LiT CD4 la mayoría de las células productoras de TNF en ambas cepas de ratones, los LiT CD4 de ratones muMT infectados presentaron un perfil pro-inflamatorio más exacerbado que sus análogos en ratones WT infectados, y la transferencia de LiT CD4 de ratones muMT infectados a ratones WT infectados alteró el perfil de los LiT CD4 en los ratones receptores y aumentó la secreción de IFN-y sistémico. Debido a que las alteraciones presentes en los ratones muMT infectados se producen en ausencia de los LiB, evaluamos los cambios fenotípicos y funcionales que sufre esta población celular durante la infección en los ratones WT, para así poder identificar a las poblaciones regulatorias B. Observamos que los Li B sufrieron una expansión inicial y posterior contracción tanto en bazo como en ganglios linfáticos, y que se generaron LiB de centro geiiiiinal (CG) y CF. Evaluando posibles mediadores regulatorios, observamos que durante la infección con T. cruz¡ los LiB y CP produjeron las citoquinas ILlO, TGF!3 e 1L6 y expresaron significativamente el Ligando 1 para el receptor PD1 (PDL1). Por medio de ensayos de eliminación de LiB y PL/CP, dentro de las células esplénicas de ratones infectados, evidenciamos que los LiB son capaces de regular negativamente, in vitro, a células secretantes de TNF a través de un mecanismo dependiente de contacto celular y que dicha función se abolió con el bloqueo de PDL1. Con el mismo tipo de ensayos evidenciamos que los PL/CP generadas durante la infección también son capaces de regular negativamente a células secretantes de TNF e IFN-y in vitro presentes en esplenocitos de ratones WT infectados. Al caracterizar en mayor profundidad a las CP de los ratones infectados con T. cruz¡, determinamos que las CP se ubican en focos extrafoliculares (EF), expresan CD11 c, PDL1 y otros receptores asociados a funciones supresoras como PDL2 y CD39. Demostramos que PDL1 se induce en los LiB a través de estímulos como ligandos de Toli, tripomastigotes de T cruz¡ e IFNy, y que CP generadas in vitro, al igual a lo determinado in vivo, presentaron mayor expresión de PDL1 que LiB activados. En base a este dato decidimos expandir, in vitro, a los LiB PDL1 para poder evaluar la función supresora de éstas células. Contrariamente a lo esperado, observamos que LiB activados con ligandos de TLR, o parásitos e IFNy o combinaciones de ellos y que expresan PDL1 indujeron la secreción de TNF y de IFNy por células esplénicas sin LiB (NoB) de ratones infectados. En estas condiciones experimentales los LiB parecían tener más una función presentadora de antígenos (Ag) que una función regulatoria. Para poder comprender este último resultado evaluamos el perfil fenotípico de los LiB y de las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ y los comparamos con el perfil de los LiB activados in vitro con los estímulos arriba mencionados. Observamos que las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ expresaron menos niveles de CD80 y MHCII, y mayores niveles de PDL1 y CD39 que LiB estimulados in vitro. Los resultados indican que los LiB y CP de los ratones infectados que ejercen una función regulatoria tienen un fenotipo particular que no es expresado por sus equivalentes obtenidos in vitro y que el solo aumento de la expresión de PDL1 en LiB o CP no garantiza una función regulatoria. En conclusión general, en la presente tesis doctoral, determinamos que las CP generadas en la infección con T cruzi son capaces de ejercer funciones adicionales a las de secretar Acs, como es la de ejercer una función regulatoria de células secretantes de TNF e IFN'y, a través de la expresión de PDL1. Fil: Gorosito Serrán, Melisa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina.

Tesis (Doctor en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2015 Durante la realización de la presente tesis doctoral se estableció un modelo terapéutico preclínico de administración intratumoral (i.t.) de polyadenylic–polyuridylic acid (poli A:U) desnudo, un análogo sintético de ARN doble cadena viral que es reconocido sólo por TLR3 y no por otros receptores citosólicos. Se demostró que el tratamiento terapéutico con poli A:U inhibe el crecimiento tumoral y aumenta la sobrevida en los ratones portadores de tumores de melanoma murino B16 tratados. Asimismo, se demostró que dicho tratamiento puede ser empleado con éxito en similares esquemas terapéuticos en distintos modelos murinos, tanto en el background genético C57BL/6 como en el BALB/c, aportando bases para una terapia alternativa antitumoral. También se estudió la contribución particular que las células del sistema inmune ejercen en nuestro modelo preclínico. Empleando ratones nude e IL-12 p40-/-, se demostró que tanto las células T (y/o NKT) así como la subunidad IL-12p40 (compartida por IL-12 e IL-23) participan en el control del crecimiento tumoral y la sobrevida en los ratones portadores de tumores B16 tratados. Cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado inmunológico en tumores de ratones tratados con poli A:U, se encontró un mayor infiltrado de células CD45+, de células dendríticas maduras CD11c+ (CD40+CD86+) productoras de IL-12 y de LiT CD8+, modificándose la relación CD4/CD8 en tumor. Empleando ratones reporteros Foxp3-GFP, se encontró que el tratamiento con poli A:U disminuye el número de células T reguladoras (Treg) en tumor y el porcentaje de células que expresan el marcador LAP, asociado a la producción de TGF-β. Además, se estudió la respuesta antitumoral antígeno específica empleando el modelo preclínico en ratones portadores de tumores B16 que expresan de forma estable ovalbúmina (OVA), mediante la transferencia adoptiva de células T CD4+ y CD8+ provenientes de ratones transgénicos OTI y OTII (que expresan TCR específicos para péptidos de OVA expresados en el contexto del CMH clase I y II respectivamente). Se evidenció que el tratamiento i.t. con poli A:U promueve el reclutamiento y la proliferación de LiT CD8+ antígeno específicos en ganglio drenante y favorece un perfil de respuesta Th1 antígeno específica en tumor. Por otra parte, mediante el empleo de nuestro modelo preclínico en ratones deficientes en el receptor de IFN-I (IFNAR1-/-) se demostró que se requiere la señalización de IFN-I sobre las células huésped para observar la inhibición del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida generada por el tratamiento con poli A:U. Además, cuando se caracterizó ex vivo el infiltrado leucocitario en tumor en ratones IFNAR1-/-, todas esas diferencias halladas entre los tratamientos en ratones wt se pierden. Para demostrar que el tratamiento con poli A:U induce la producción endógena de IFN-β, se emplearon ratones reporteros que expresan el gen de luciferasa en lugar de la secuencia codificante de IFN-β. El estudio de la cinética de la inducción de IFN-β in vivo demostró que el tratamiento i.t. con poli A:U desnudo es capáz de inducir un pico de dicha citocina luego de 6 h y que este se produce a lo largo de sucesivas dosis. Empleando cepas de ratones reporteros de IFN-β específicos para distintos linajes como células mieloides, dendríticas, LiT y B (LysM+/loxβLuc, CD11c+/loxβLuc, CD4+/loxβLuc y CD19+/loxβLuc respectivamente), se demostró que luego del tratamiento con poli A:U las células de origen mieloide son responsables de producir la totalidad de IFN-β en el microambiente tumoral y que las células CD11c+ también contribuyen en gran parte con dicha inducción. Además, se reprodujo el modelo preclínico en ratones reporteros de IFN-β deficientes en UNC93B1 (molécula involucrada en el tráfico de TLR endosomales) y en IRF3, 5 o 7 (factores de transcripción clave en las vías de señalización de TLR). De esta manera, se demostró que la producción de IFN-β en nuestro modelo preclínico, es dependiente de IRF3 y UNC93B1 pero no de IRF7 e IRF5, confirmando que poli A:U es ligando TLR3 y contribuyendo también con algunos aspectos importantes de su señalización in vivo. Por último, se evaluó el empleo de poli A:U en combinación con un quimioterapéutico convencional como doxorrubicina, con el fin de disminuir su dosis, manteniendo la eficacia del tratamiento y disminuyendo sus efectos adversos. Para ello, se empleó doxorubicina en altas y bajas dosis i.v. en ratones portadores de tumores B16 y se mantuvieron las condiciones y el esquema experimental de administración de poli A:U. La terapia combinada poli A:U y doxorubicina bajas dosis demostró tener un efecto sinérgico favorable, respecto a los demás tratamientos empleados, para el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados, reduciendo además los efectos tóxicos secundarios de doxorubicina evaluados mediante niveles ezimáticos y parámetros bioquímicos. La presente tesis revela el rol crucial de la inducción endógena de IFN-β, luego de la administración i.t. de poli A:U, en la modificación del tipo de infiltrado, funcionalidad de células del sistema inmune y en la respuesta inmune antitumoral que promueve el control del crecimiento tumoral y el aumento de la sobrevida de los ratones tratados Fil: Nocera, David Andrés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Maccioni, Mariana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maccioni, Mariana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Degano, Alicia Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Degano, Alicia Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Rubiales de Barioglio, Susana Elizabeth. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Schillaci, Roxana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biología y Medicina Experimental; Argentina.

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2014 Los adyuvantes aprobados para uso humano, cuando se administran con antígenos recombinantes o purificados (vacunas de la nueva generación), inducen una débil respuesta inmune celular. Por lo tanto, existe un gran interés en desarrollar nuevas estrategias adyuvantes. Oligodeoxinucleótidos sintéticos que contienen motivos CpG no metilados en un contexto particular de bases (CpG-ODN) están siendo utilizados con éxito como adyuvante en ensayos clínicos de fase I y III, pero los mismos poseen una biodisponibilidad reducida. Nosotros evaluamos la actividad adyuvante de CpG-ODN formulado en un sistema nanoestructutrado derivado de 6-0-palmitato de ascorbilo (Coa-ASC16). Los ratones inmunizados con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16 (régimen de co-formulación) desarrollaron una potente respuesta inmune humoral (IgG1 e IgG2a) y celular (Th1 y Th17) específica sin generar efectos adversos. Esta respuesta fue superior a la inducida por animales inmunizados con OVA/CpG-ODN o con la formulación OVA/CpG-ODN/Al(OH)3. Además, la inmunización con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16 facilitó la generación de una respuesta inmune específica de memoria (principalmente de tipo celular) durante al menos 6,5 meses. La administración de OVA/CpG-ODN + Coa-ASC16 (régimen de co-inyección) indujo una respuesta inmune específica similar a la inducida con la administración de OVA/CpG-ODN, lo cual indica que se necesita de la formulación completa para potenciar la actividad inmunoadyuvante del oligodeoxinucleótido. Por otro lado, Coa-ASC16 por sí mismo, genera una liberación controlada de CpG-ODN y OVA in vitro e induce una respuesta inflamatoria local. Esto último, coincide con estudios recientes que demuestran que determinados biomateriales no son inmunológicamente inertes, aunque el mecanismo por el cual muchos de ellos son reconocidos por el sistema inmune innato aún no se describe por completo. El efecto inflamatorio inducido por Coa-ASC16 se caracteriza por el reclutamiento de neutrófilos y monocitos Ly6Chigh, así como por la inducción de IL-1?, IL-6 e IL-12 a nivel del sitio de la inyección. Este efecto resultó dependiente de la señalización mediada por la proteína adaptadora MyD88. Además, TLR4, TLR2, TLR7 y NLRP3 no están implicados en el reclutamiento celular ni en la producción de IL-6 e IL12. La administración de Coa-ASC16 se asocia con un aumento de la concentración de ADN de doble hebra (dhADN) en el sitio de la inyección. Frente al tratamiento previo con DNasa o en ratones Tlr9-/- no hubo modificación en el reclutamiento celular pero la producción de IL-6 se vio afectada. Por otro lado, Coa-ASC16 posee actividad adyuvante “per se”, la cual depende de MyD88 e IL-6. Nuestros resultados muestran una conexión mediada por IL-6, entre la respuesta inmune innata y adaptativa inducida por Coa-ASC16. De esta manera, Coa-ASC16 no sólo constituye una plataforma para la administración de CpG-ODN, sino también posee propiedades adyuvantes intrínsecas. Estos resultados demuestran el potencial de esta nueva formulación para el desarrollo de vacunas más eficaces. Además, la comprensión del mecanismo de acción de Coa-ASC16 es muy importante para su uso de manera más racional en el futuro. Fil: Sánchez Vallecillo, María Fernanda. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Maletto, Belkys Angelica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Acosta Rodríguez, Eva Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Argentina. Fil: Acosta Rodríguez, Eva Virginia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Fil: Cuadra, Gabriel Ricardo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología; Argentina. Fil: Cuadra, Gabriel Ricardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Fil: Daniotti, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica; Argentina. Fil: Cassataro, Juliana. Universidad Nacional de San Martín; Argentina. Fil: Cassataro, Juliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Biotecnológicas; Argentina.