Search

Spinacia oleracea is an economically important crop and is full of health and nutritional benefits. Bolting is a serious problem in spinach faced by growers and plant breeders which reduces the quality and yield on large scale. The novel CRISPR/Cas technology assists researchers with knocking-out genes that are liable for unwanted attributes in plants. Tissue culture plays a vital role in developing a transgenic plant, but low plant transformation efficiency is the main bottleneck in plant genome editing. Especially regeneration of an entire transgenic plant from a single transformed cell remains difficult for most plant species. Therefore, combined study for gene knockout through CRISPR/Cas in spinach, tissue culture regeneration in spinach and 13 other important crops was conducted. Flowering Locus T (Ft) and Ft-interacting protein 1 (FtPI1) were selected as these are the major genes responsible for flowering in number of angiosperm plants. Primers were designed to find these genes in spinach as a part of CRISPR/Cas study. In-vitro seed germination and shoot regeneration of spinach was performed in different growth medias. New generation of in silico designed cytokinin oxidase inhibitors (CPPU, JN1 and JN4) were applied alone and in combination with BA and 2iP on fourteen different economically relevant crops to develop efficient leaf regeneration systems and number of shoots were compared with spinach. Results revealed that both genes are present in our spinach variety in heterozygous form. Among all in-vitro protocols only 25-30% seeds of Spinach were germinated. Regeneration of spinach was comparatively better in simple MS media then in MSmod3B media. However, regeneration was less than 50% in both medias. Each plant specie demonstrated different growth pattern to different treatments of cytokinin oxidase / dehydrogenase (CKO/CK). Among these 14 plant species only 5 plant species developed shoots, while in other 9 plant species including spinach only callus formation was observed. Highest number of shoots were observed when these cytokinin oxidase/dehydrogenase inhibitors were used in combination with BA and 2iP. Regeneration of plant species is highly dependent on genotype. More research needs to be conducted to establish efficient tissue culture of spinach and to develop CRISPR/Cas protocol for heterozygous plants. The new cytokinin inhibitors can be further optimized for better regeneration. This research can help in future to develop protocols for different crops both for CRISPR/Cas and tissue culture study., Ekonomik olarak önemli bir ürün olan Spinacia oleracea, sağlık ve besin içeriği bakımından çok faydalıdır. Çiçeklenme, ıspanak yetiştiricileri ve ıslahçılarının karşılaştığı ciddi bir sorundur ve kaliteyi ve verimi büyük ölçüde düşürür. Yeni CRISPR/Cas teknolojisi, araştırmacılara bitkilerdeki istenmeyen özelliklerden sorumlu olan genlerin devre dışı bırakılması konusunda yardımcı olmaktadır. Doku kültürü, transgenik bitkinin geliştirilmesinde büyük öneme sahiptir, ancak düşük transformasyon oranı bitki genom editing‟de en önemli darboğaz olarak karşımıza çıkar. Özellikle trasformasyona uğramış tek bir hücreden transgenik bir bitkinin rejenerasyonu, çoğu bitki türü için halen zor olmaya devam etmektedir. Bu nedenle, ıspanak ve önemli 13 üründe CRISPR/Cas ile genin devre dışı bırakılması, doku kültürü rejenerasyonu ile kombine edilerek gerçekleştirildi. Bunun için çalışmada, çıplak tohumlu bazı bitkilerde çiçeklenmeden sorumlu ana genler olan T (Ft) lokusu ve Ft ile etkileşen protein 1 (FtPI1) seçildi. CRISPR / Cas çalışmasının bir parçası olarak ıspanakta bu genlerin bulunabilmesi için primerler tasarlandı. Ispanakta in vitro tohum çimlenmesi ve sürgün rejenerasyonu farklı büyüme ortamlarında gerçekleştirildi. Yeni nesil in silico tasarlanmış sitokinin oksidaz inhibitörleri (CPPU, JN1 ve JN4) tek başına ve BA ve 2iP ile kombinasyon halinde, etkili yaprak rejenerasyonunun sağlanması amacıyla ekonomik bakımdan önemli on dört farklı ürün üzerinde uygulanmış ve elde edilen sürgün sayısı ıspanak ile karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar, ıspanak çeşidimizde her iki genin heterozigot formda bulunduğunu ortaya çıkardı. Uygulanan in vitro protokollerinde Ispanak tohumlarının sadece %25-30‟u çimlendi. Ispanak rejenerasyonunun, temel MS ortamında MSmod3B ortamına göre nispeten daha iyi olduğu görüldü. Bununla birlikte, rejenerasyon her iki ortamda da %50'den daha az olarak gerçekleşti. Bitki türleri, farklı sitokinin oksidaz / dehidrojenazın (CKO / CK) uygulamalarına karşı farklı büyüme modelleri gösterdi. Bu 14 bitki türünden sadece 5 tanesi sürgün geliştirirken, ıspanak da dahil olmak üzere diğer 9 bitki türünde sadece kallus oluşumu gözlemlendi. Sitokinin oksidaz/dehidrojenaz inhibitörleri, BA ve 2iP ile kombinasyon halinde kullanıldığında en yüksek sayıda sürgün elde edildi. Bitki türlerinin rejenerasyonunun büyük ölçüde genotipe bağlı odluğu belirlendi. Etkin ıspanak doku kültürü koşullarının oluşturulması ve heterozigot bitkiler için CRISPR / Cas protokolünün geliştirilmesi için daha fazla araştırma yapılmasının gerekli olduğu sonucuna varıldı. Daha iyi bitki rejenerasyonu için yeni sitokinin inhibitörleri daha da optimize edilebilir. Bu araştırma gelecekte farklı bitkisel ürünlerde, hem CRISPR/Cas hem de doku kültürü çalışmaları için protokollerin geliştirilmesine yardımcı olabilir.

OBJECTIVE This thesis examines sex differences in the structural properties of the corpus callosum (CC) during adolescence and investigates the possible role of sex hormones in the development of these sex differences, as well as hormonal effects on the inter-individual variations in the structure of the CC in young women. DESIGN This thesis is conducted on three separate study samples: 1) the Saguenay Youth Study (SYS) sample (n=737); 2) the IMAGEN Study sample (n=1,979); and 3) the Cycle Study sample (n=26). The SYS and IMAGEN studies are large-scale studies carried out with magnetic resonance imaging (MRI) in typically developing adolescents from Canada (12 to 18 years) and Europe (13 to 15 years), respectively. In these studies, the “sex hormone-CC” relationship is explored by examining the association between the CC and: testosterone level, duration of sex hormone exposure (since menarche), puberty stage and contraceptive use. The Cycle study examines the CC of 13 freely cycling and 13 oral contraceptives (OCP) using young women (18 to 30 years) scanned using MRI across four separate phases of their menstrual cycle. Freesurfer-based computational anatomy is used to estimate the volume of the total corpus callosum and its segments in all three studies. Magnetization transfer imaging (MTI) is used to assess microstructural properties of the corpus callosum in the Cycle study. RESULTS The relative volume of the corpus callosum is seen to be sexually dimorphic in both the SYS and IMAGEN adolescents with a female versus male advantage that is particularly significant for the anterior, central and posterior segment of the corpus callosum; the mid-anterior segment is larger in males versus females. Pubertal stage of adolescent boys (SYS) demonstrates a negative correlation with the relative volume of the anterior CC and a positive correlation with the relative volume of the mid-anterior CC. These associations are consistent with the sex differences observed (anterior: F>M; mid-anterior: M>F), thus suggesting that male sex hormones that are responsible for inducing pubertal development of boys may play a role in generating the sexually dimorphic volume of the corpus callosum in a region-specific manner. Contraceptive use in adolescent girls (SYS and IMAGEN) is negatively associated with the relative volume of the corpus callosum. In addition, the Cycle study demonstrates a trend for lower MTR values in women using contraceptives versus freely cycling women, thus suggesting that the natural sex steroids suppressed by use of oral contraceptives may exert a positive effect on the volume of the CC, possibly by increasing the degree of myelination. The Cycle study demonstrates an increase in the relative volume of the total corpus callosum of freely cycling women from the ovulatory to the luteal phase with corresponding decreases in the MTR value of the total CC. This finding suggests that increased production of progesterone during the luteal phase may cause an increase in the relative volume of the CC, possibly by increasing the axonal calibre. CONCLUSION Sex steroids influence the structure (relative volume and MTR) of the corpus callosum.