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Fructooligosaccharides (FOS) are recognized prebiotics with proven beneficial effects, usually produced by two-step processes. In this work, an in vivo bioprocess was developed for the one-step production of a functional sweetening mixture containing FOS. Sucrose was directly fermented by yeast towards process simplification and cost reduction. Saccharomyces cerevisiae YIL162W lacking the gene responsible for sucrose hydrolysis (SUC2) was transformed to express -fructofuranosidase FTase inv gene from Schwanniomyces occidentalis (clone GAL1_S196), and its mutated version (clone GAL1_L196), under the inducible galactokinase (GAL1) promotor. The FTase inv mutated gene was also expressed under the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GPD) constitutive promoter (clone GPD_L196). GPD_L196 clone showed the highest potential for FOS production, achieving a maximum productivity of 8.9±0.4mg.g-1.h-1 after 60h, with sucrose supplementation by two pulses, 150g.L-1 at 0 and 24h. When co-cultured with S. cerevisiae wild type (WT), GPD_L196 clone achieved the maximum productivity of 10.9±0.5mg.g-1.h-1 (48h) with an 1:200 inoculum ratio (WT:GPD_L196) and 150g.L-1 of sucrose added at 0 and 24h. After partial purification, a sweetening mixture composed by 75±2% of FOS and 24±2% of sucrose was obtained. This bioprocess approach presents high potential for industrial production of functional sweetening mixtures towards food applications., Cláudia Amorim, João Rainha, Beatriz B. Cardoso and Daniela Gomes acknowledge their grants (2020.00293.CEECIND, SFRH/BD/138325/2018, SFRH/BD/132324/2017, and SFRH/BD/04433/2020, respectively) from Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT). The study received financial support from FCT under the scope of the strategic funding of UIDB/04469/2020 unit and the project FoSynBio (POCI-01-0145-FEDER-029549)., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

The online version contains supplementary material available at https://doi.org/10.1007/s00253-022-12037-3, Zymomonas mobilis ZM4 is an attractive host for the development of microbial cell factories to synthesize high-value compounds, including prebiotics. In this study, a straightforward process to produce fructooligosaccharides (FOS) from sucrose was established. To control the relative FOS composition, recombinant Z. mobilis strains secreting a native levansucrase (encoded by sacB) or a mutated -fructofuranosidase (Ffase-Leu196) from Schwanniomyces occidentalis were constructed. Both strains were able to produce a FOS mixture with high concentration of 6-kestose. The best results were obtained with Z. mobilis ZM4 pB1-sacB that was able to produce 73.4±1.6 g L1 of FOS, with a productivity of 1.53±0.03 g L1 h1 and a yield of 0.31±0.03 gFOS gsucrose1. This is the first report on the FOS production using a mutant Z. mobilis ZM4 strain in a one-step process., s Cláudia Amorim, João Rainha, Beatriz B. Cardoso, and Daniela Gomes acknowledge their grants (UMINHO/ BPD/4/2019, SFRH/BD/138325/2018, SFRH/BD/132324/2017, and SFRH/BD/04433/2020, respectively) from Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT)., info:eu-repo/semantics/publishedVersion

XXVIII Congreso Nacional de Microbiología, 28 de junio a 2 de julio de 2021, formato virtual, La quitina, el segundo polímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa, está constituida por unidades de N-acetil-D-glucosamina (GlcNAc) con enlaces ß(1¿4). La hidrólisis de quitina o quitosano (su producto desacetilado) da lugar una serie de quitooligosacáridos (COS) que contienen diferentes proporciones de D-glucosamina (GlcN) y GlcNAc, según el método empleado en su obtención. Los COS muestran propiedades interesantes como antimicrobianos, antioxidantes, antivirales, antitumorales, antiinflamatorios, neuroprotectores, antihipertensivos y prebióticos. Su actividad biológica depende en gran medida del grado de polimerización (DP), grado de desacetilación (DD) y patrón de acetilación (PA). En nuestro consorcio GLICOENZ (http://www.glicoenz.org) estamos desarrollando distintas estrategias para la obtención de COS con una composición química definida: COS totalmente acetilados (faCOS, formados exclusivamente por GlcNAc), COS parcialmente acetilados (paCOS, compuestos por GlcN y GlcNAc) y COS desacetilados (fdCOS, formados solo por GlcN). Para ello trabajamos con varias quitinasas (Chit33 y Chit42) de Trichoderma harzianum, que han sido expresadas en Pichia pastoris, además de otros extractos con actividad quitinolítica. Recientemente hemos empezado la búsqueda de enzimas con actividad quitina-desacetilasa, que nos permitirían un mayor control sobre el grado de acetilación de los COS. Las mezclas complejas que se obtienen en estas reacciones se caracterizan mediante cromatografía aniónica con detección amperométrica de pulsos (HPAEC-PAD) y espectrometría de masas MALDI-TOF. La estructura 3D de alguna de las quitinasas ha sido resuelta y además se han realizado estudios estructura-función para determinar los aspectos diferenciales que modulan la especificidad de estas enzimas., EU-EMFF-Blue-Economy-2018 (proyecto FISH4FISH-863697), MICINN Proyectos PID2019-105838RB-C31/C32/C33, Fundación Ramón Areces

Chitin-active enzymes are of great biotechnological interest due to the wide industrial application of chitinolytic materials. Non-stability and high cost are among limitations that hinder industrial application of soluble enzymes. Here we report the production and characterization of chitooligosaccharides (COS) using the fungalexo-chitinase Chit42 immobilized on magnetic nanoparticles and food-grade chitosan beads with an immobilization yield of about 60% using glutaraldehyde and genipin linkers. The immobilized enzyme gained operational stability with increasing temperature and acidic pH values, especially when using chitosan beads-genipin that retained more than 80% activity at pH 3. Biocatalysts generated COS from colloidal chitin and different chitosan types. The immobilized enzyme showed higher hydrolytic activity than free enzyme on chitosan, and produced COS mixtures with higher variability of size and acetylation degree. In addition, biocatalysts were reusable, easy to handle and to separate from the reaction mixture., Spanish Ministry of Economy and Competitiveness [BIO2016-76601-C3-1/-2], the Spanish Ministry of Science and Innovation PID2019-105838RB-C32/-31, Fundación Ramón Areces

The antioxidant properties of polyphenols make these compounds useful for treatments of diseases related with oxidative processes, such as cancer or Alzheimer disease. However, they exhibit low bioavailability due to their low stability and low solubility, so their biotechnological application is very limited. An alternative to optimize these properties is by means of glycosylation. Polyphenol glycosides have shown a greater solubility and stability compared to their respective aglycones. In this work, we report the enzymatic synthesis of glucosides of some polyphenols: epigallocatechin gallate (EGCG), pterostilbene, rutin and hesperetin. The enzyme employed was a cyclodextrin glucosyltransferase (CGTase). Furthermore, the combined use of CGTase with an amyloglucosidase (STA1) from Saccharomyces cerevisiae enhances, in some cases, the formation of a single monoglycosylated product (Scheme 1). Finally, some properties such as stability, solubility or cellular toxicity of EGCG and pterostilbene glucosides have been evaluated, comparing the results with their aglycones.

Trabajo presentado en la 33ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 18 de marzo de 2019., En la actualidad, la síntesis enzimática de productos específicos con un valor añadido está adquiriendo un mayor peso en la industria debido a su bajo coste y respeto hacia el medio ambiente. Por ello, la búsqueda de nuevas enzimas en levaduras no convencionales permite alternativas a los métodos químicos convencionales. La levadura Schwanniomyces occidentalis expresa una β-fructofuranosidasa (Ffase, EC 3.2.1.26) que, además de hidrolizar sacarosa, es capaz de transferir moléculas de fructosa al disacárido y generar pequeños fructooligosacáridos (FOS) con enlaces β-(2→6) y β-(2→1), básicamente 6-kestosa y 1-kestosa, respectivamente. La enzima puede fructosilar también distintos monosácaridos y compuestos hidroxilados, entre ellos polioles como el manitol y eritritol. La estructura 3D de la Ffase fue ya previamente caracterizada, se obtuvieron distintos complejos proteína-sustratos/productos y los determinantes estructurales implicados en la capacidad hidrolasa y transferasa de la proteína fueron también determinados. En este trabajo, se han analizado las bases moleculares de la selectividad del proceso de producción de fructosil-eritritol/manitol de Ffase. Para ello, se purificaron los correspondientes polioles fructosilados y se cristalizaron en complejo con la variante inactiva de la proteína Ffase-D50A, previamente expresada en Saccharomyces cerevisiae. El análisis cristalográfico de los complejos reveló que los residuos Q176 y Q228 de la proteína tenían un papel fundamental en el reconocimiento de manitol, y la posición N254 en el del eritritol. Se realizaron reacciones de fructosilación de polioles utilizando variantes mutantes de la Ffase en las que las posiciones referenciadas habían sido sustituidas por diferentes aminoácidos y se evaluaron los productos obtenidos utilizando técnicas cromatográficas (HPLC-ELSD). Los resultados verificaron el papel de estos residuos en el proceso de producción de polioles fructosilados, y en uno de los mutantes utilizados se logró mejorar la producción de fructosil-eritritol en un 20%.

Joint 12th EBSA congress / 10th ICBP – IUPAP congress: Biophysics for life and technology, Madrid, Spain, July 20-24, 2019. -- http://www.ebsa2019.org/

Trabajo presentado en la 2ª ed. del congreso nacional "Jornadas Españolas de Biocatálisis" (JEB) organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Campus de El Cristo de la Universidad de Oviedo (Asturias, España) durante los días 25 al 26 de junio de 2018., Los procesos sintéticos mediados por enzimas están adquiriendo hoy en día cada vez mayor importancia en la industria, especialmente para la obtención de moléculas altamente específicas de manera poco costosa y respetuosa con el medio ambiente. En este contexto, las levaduras no convencionales ofrecen una verdadera oportunidad para descubrir nuevas enzimas alternativas que permitan desempeñar acciones catalíticas inéditas con múltiples posibles aplicaciones. Recientemente, el ascomiceto Schwanniomyces occidentalis ha suscitado interés biotecnológico por disponer de un amplio sistema glicosilhidrolítico extracelular de elevada operatividad y robustez. Su enzima β-fructofuranosidasa (EC 3.2.1.26) no sólo se ha mostrado capaz de escindir eficientemente enlaces fructosídicos β-(2→1) ó β-(2→6) presentes en diversos sacáridos o heterósidos (actividad hidrolítica); sino que también tiene el potencial para transfructosilar con distinto grado de regioselectividad ciertos sustratos aceptores a partir de donadores no activados como la sacarosa (actividad transferente). El estudio en detalle de esta habilidad catalítica ha permitido conocer con mayor exactitud la especificidad aceptora de esta enzima sobre una gran cantidad de azúcares y glicitoles. Las reacciones con dos de los glicitoles que mostraron mayor rendimiento, eritritol y manitol, fueron escaladas y los productos obtenidos purificados y caracterizados. Asimismo, se han puesto en práctica distintas estrategias para aumentar la tasa de transfructosilación de los aceptores positivos, como son la optimización de las concentraciones de sustrato, la variación de los tiempos de reacción y el empleo de biodisolventes, tanto derivados de biomasa como líquidos iónicos. Todo ello está generando como resultado la formación biocatalítica de nuevos compuestos fructoconjugados de posible interés bioactivo que serían de lo contrario difíciles de obtener por síntesis química clásica.

Trabajo presentado en la 32ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 09 de marzo de 2018, La microbiota intestinal tiene un impacto directo en la salud del hospedador, lo que genera un gran interés en encontrar nuevas formas de manipular la composición y la actividad de determinados tipos de bacterias para mejorar la calidad de vida. Por esta razón, existe un creciente interés industrial en el desarrollo de nuevos productos con nuevas y/o mejores propiedades. En este contexto, los carbohidratos prebióticos estimulan selectivamente el crecimiento y/o la actividad de bacterias del tracto intestinal que son consideradas beneficiosas para la salud, entre ellas algunas especies de los géneros Bifidobacterium y Lactobacillus. Los isomaltooligosacáridos (IMOS) son azúcares prebióticos con un grado de polimerización de unos 2 a 10 monómeros de glucosa unidos mediante enlaces glucosídicos α(1-2, -3, ó -6), aunque también pueden contener uniones α(1-4). Para la producción de IMOS se pueden utilizar principalmente 2 tipos de enzimas: glucosidasas y glucosil-transferasas. Las α-glucosidasas (EC 3.2.1.20) por su estructura tridimensional y su secuencia se incluyen dentro de la familia 31 de las Glicosil Hidrolasas (GH31) (http://www.cazy.org/). Estas enzimas hidrolizan, por lo general, los enlaces α(1-4) del extremo no reductor de polímeros de glucosa y liberan las unidades constituyentes. Algunas de ellas muestran actividad de transglicosilación (TG) en condiciones saturantes de sustrato. La α-glucosidasa GAM1 de Schwanniomyces occidentalis además de hidrolizar maltooligosacáridos presenta actividad TG sobre maltosa. Por transferencia produce isomaltosa, kojibiosa, panosa, maltotriosa y otros productos de mayor tamaño. En este estudio, el gen de Gam1 (2883pb), responsable de la actividad α-glucosidasa GAM1, fue aislado a partir de DNA genómico de Sw. occidentalis, clonado en pIB4 bajo el control del promotor inducible por metanol AOX1p y transformado en Pichia pastoris. La proteína heteróloga fue expresada y utilizada en reacciones de TG basadas en maltosa y distintos aceptores no hidrolizables por la enzima. Los productos obtenidos fueron analizados mediante HPLC. Además, se realizó un estudio preliminar de la estructura 3D de la proteína y se obtuvieron distintos mutantes puntuales de la misma que fueron bioquímicamente analizados.

Trabajo presentado en la 7ª ed. del congreso internacional "FEMS" organizado por la Sociedad Española de Microbiología y la Federación Europea de Sociedades Microbiológicas en el Centro de Convenciones Feria Valencia (Valencia, España) durante los días 9 al 13 de julio de 2017., BACKGROUNDS: Chitooligosaccharides (COS) are β-(1,4)-linked oligomers of N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) and glucosamine (GlcN) formed by chemical or enzymatic hydrolysis of chitosan or chitin. The growing biotechnological interest of COS in fields such as food or health increases the demand of the producing enzymes as well as their characterization and functional improvement. | OBJETIVES: Express a chitinase of 42 kDa from Trichoderma harzianum in a heterologous system, obtain protein levels compatible with its crystallization for the future protein structural resolution and evaluate the ability of the recombinant protein to produce COS. | METHODS: The chitinase gene cDNA from T. harzianum was expressed in Pichia pastoris using a restriction-free cloning strategy, production of heterologous protein was analysed and escalated up to a 5 L fermenter level. Recombinant protein was purified and some crystals were obtained which allows undertake the protein structural resolution. Synthesis of oligosaccharides from different substrates were evaluated and optimized using the recombinant enzyme. HPAEC-PAD on a Dionex ICS3000 system and Mass Spectrometry were used in the reaction studies and product characterization. | CONCLUSIONS: A chitinase of 42 kDa from T. harzianum was overexpressed in P. pastoris, the recombinant protein was purified, characterized and crystallized for the protein structural resolution. Production of COS mediated by this enzyme was evaluated and some of the molecules formed were characterized.

Se describe una experiencia llevada a cabo en el CEIP Las Eras (Malpartida de Plasencia, Cáceres) que consistió en montar una pequeña ciudad dentro del centro, en la que, entre otras actividades, se buscó un nombre para la ciudad, su escudo y bandera, se creó un un banco, un supermercado, un restaurante, un museo, un hospital, etc. y se trabajaron las gestiones propias de cada espacio ESP

Additional file 4: Figure S2. Glucose effect on transcript levels of genes involved in carotenogenesis. The expression kinetics at the mRNA level after the addition of glucose (final concentration of 20 g l−1) was determined relative to control (without glucose) for different genes involved in carotenogenesis (early stages: HMGR, idi, FPS and crtE; final stages: crtI, crtYB, crtS and crtR) and genes used as controls (INV and grg2) in the X. dendrorhous wild-type, 385cyc8 − and 385tup1 − strains. The horizontal axis of the graphs was set at 1. The data represent the average of three independent experiments, and the bars represent the standard error.

Additional file 1: Table S1. Primers used in this work. Hybridization targets, sequences and orientations of the primers used in the study.

Additional file 6: Table S4. Identified overexpressed DEGs (according to the DESeq 2 results) in strain 385tup1 −. Results of the BLAST analysis of the ORF sequences identified as overexpressed DEGs in strain 385tup1 −.

Trabajo presentado en el evento conjunto de la 12ª ed. del simposio internacional "Jornada de Carbohidratos" y la 3ª ed. de la reunión nacional "Grupo Especializado de Química Biológica" organizado por la Real Sociedad Española de Química en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC) en Madrid (España) del 14 al 16 de marzo del año 2016., Enzymatic glycosylation of hydrophobic scaffolds can be catalyzed by glycosidases and glycosyltransferases. Glycosylation dramatically changes the physico-chemical properties of bioactive molecules, modulates their pharmacokinetic properties and influences their membrane transport. Polyphenols are, in general, hydrophobic compounds exhibiting poor absorption, which renders a very low bioavailability. The main objective of this work was to develop strategies for the enzymatic glycosylation of polyphenols, namely epigallocatechin gallate (EGCG, present in green tea), hesperetin (citrus fruits), resveratrol (grapes) and hydroquinone. The yield of glycoderivatives is usually low because the active-site architecture of glycosidic enzymes is not designed to accommodate non-natural acceptors −in contrast with the natural ones, i.e. carbohydrates−. In addition, the reactivity of phenolic groups is notably lower than the corresponding to typical hydroxyls. However, the synergistic combination of enzyme screening, medium engineering and structural analysis was employed to develop strategies for the glycosylation of different polyphenols. We have achieved the enzymatic synthesis of various α-glucosyl derivatives of resveratrol, EGCG or hesperetin by a transglycosylation reaction catalyzed by cyclodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19, CGTase), a transglycosidase that employs easily available carbohydrates (e.g. starch or maltodextrins) as glucose donors. A common strategy to increase the yield of glycoderivatives was the use of cosolvents that favoured the solubilization of the phenolic acceptors. The antioxidant and surfactant properties of several of the synthesized compounds were evaluated. For the introduction of fructosyl groups, we found that the β-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26) from the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous was able to fructosylate hydroquinone. Interestingly, other polyphenols such as EGCG acted as strong inhibitors of β-fructofuranosidases from X. dendrorhous and Schwanniomyces occidentalis. The experimental results were validated by soaking the enzyme with the polyphenols followed by structural characterization of the complexes.

Additional file 2: Table S2. Carotenoid composition in X. dendrorhous wild-type and mutant strains cultured in MMv with 2% glucose. Analysis of carotenoid composition at different growth phases in X. dendrorhous wild-type, 385cyc8 − and 385tup1 − strains.

Additional file 7: Figure S3. Plasmids used for X. dendrorhous transformation. Up: pgCYC8-Hyg and pgCYC8-Zeo plasmids used for 385cyc8 − mutant strain construction. Down: pgTUP1-Hyg and pgTUP1-Zeo plasmids used for 385tup1 − mutant strain construction. The restriction sites used to release the transformant DNA are shown. pEF: elongation factor 1α promoter (X. dendrorhous); GPDHt: glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase terminator (X. dendrorhous). hph: hygromycin phosphotransferase gene (E. coli); ble: ble gene (Streptoalloteichus hindustanus); AmpR: ampicillin resistance; pUC ori: pUC replication origin.

Additional file 5: Table S3. Identified overexpressed DEGs (according to the DESeq 2 results) in strain 385cyc8 −. Results of the BLAST analysis of the ORF sequences identified as overexpressed DEGs in strain 385cyc8 −.

Additional file 3: Figure S1. HPLC analysis of carotenoid composition of X. dendrorhous wild-type, 385cyc8 − and 385tup1 − strains. For each strain, a representative sample obtained at the late stationary phase of growth is shown. Values are the percentage representativeness of each compound with respect to the total carotenoid content.

Trabajo presentado en la 29ª ed. de la reunión científica regional "ZYMOMADRID" organizada por la Sra. Catedrática en Microbiología y Pasitología Dra. dña. María Molina Martín (Dpto. Microbiología II, Fac. Farmacia, UCM) en el Campus de Moncloa (UCM, Madrid, España) durante el día 27 de febrero de 2015., The relevance of enzyme-catalysed processes in many areas of industry is gradually increasing year after year, especially for synthesizing pharmaceutical drugs and food ingredients. In this context, non-conventional yeasts are playing an import role in the discovery of alternative enzymes with new abilities and potential applications. Recently, the ascomycetous Schwanniomyces occidentalis has gained a great biotechnological interest because of, among other things, its outstanding extracellular glycosyl-hydrolytic enzyme system. β-Fructofuranosidase or invertase (EC 3.2.1.26) from this yeast is reported not only to be able to efficiently cleave β-(2→1) linkage of sucrose to split off fructose (hydrolytic activity), but also to transfer a fructosyl moiety from a donor sucrose molecule into another acceptor one (transfructosylating activity) through the formation of a new glycosidic bond. This enzyme is capable to synthesize 6-kestose from sucrose, with one of the highest selectivity and yields yet described for this trisaccharide using an enzymatic system, as well as 1-kestose in a 3:1 ratio. Interestingly, the study in detail of this peculiar capacity on the basis of analytical techniques has shown that this enzyme can fructosylate certain substrates different from sucrose as well, including, monosaccharides, disaccharides, and sugar alcohols. Thus, resulting in the enzymatic generation of fructo-conjugated compounds of a kind that may be difficult to obtain by classical chemical synthesis.

Trabajo presentado en la 1ª ed. del congreso nacional "Jornadas Españolas de Biocatálisis" organizado por la Sociedad Española de Biotecnología en el Centro de Investigaciones Biológicas (CIB, CSIC) en Madrid (España) del 2 al 3 de julio del año 2015., Los azúcares reducidos en su función carbonílica –denominados polialcoholes ó azúcares alcohólicos– son compuestos no cariogénicos que se emplean como edulcorantes en productos de uso tan cotidiano como los chicles o las pastas dentífricas. Además, tienen aplicaciones en preparados para diabéticos y personas con sobrepeso, así como excipientes en formulaciones farmacéuticas. La mayoría de ellos se absorben en el intestino delgado y pasan al torrente sanguíneo. Sin embargo, si están glicosilados (p. ej. en el caso del lactitol) dicha absorción se ve dificultada, y los derivados llegan al intestino grueso donde pueden actuar como prebióticos. Una de las estrategias más empleadas en glicosilación enzimática es la fructosilación. Para la introducción de grupos fructosilo suelen utilizarse enzimas como las β-fructofuranosidasas (EC 3.2.1.26). En particular, la procedente de la levadura Schwanniomyces occidentalis se caracteriza por transferir un residuo de fructosa al 6-OH de otra fructosa que a su vez forma parte de una molécula de sacarosa, generando 6-kestosa como producto principal. Las propiedades prebióticas de este trisacárido son comparables a las de los fructooligosacáridos (FOS) de la serie inulina. En este trabajo hemos explotado la actividad de transfructosilación de la β-fructofuranosidasa de Schw. occidentalis utilizando como aceptores varios azúcares polialcohólicos. Las reacciones se llevaron a cabo a 50°C con sacarosa (200 g/L) como donador de grupos fructosilo y 400-600 g/L del aceptor, en acetato sódico 0.2 M pH 5.5, y se analizaron mediante cromatografía HPLC con detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD). Las reacciones con dos de los polialcoholes que dieron mayor rendimiento (eritritol y manitol) fueron escaladas, y los productos obtenidos se purificaron mediante HPLC preparativa para posteriormente ser caracterizados mediante espectrometría de masas y RMN bidimensional.

Amylolytic enzymes have important applications in the food, pharmaceutical and biofuel industries. The synthesis of prebiotic isomaltooligosaccharides (IMOS) from starch is one of the biotransformations of greatest interest. It is a multi-enzyme process based on a first hydrolytic step (liquefaction), for which we are testing -amylases obtained from non-conventional yeasts, in particular Schwanniomyces occidentalis. To obtain syrups enriched in maltose or maltotriose, different β-amylases or maltotriose-forming enzymes are being investigated in our laboratory. The final step is a transglucosylation process catalyzed by α-glucosidases, which selectively form α(1→6) linkages between glucosyl residues. This transfer reaction is being studied with commercially available enzymes or those obtained from the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma). Immobilization of the above enzymes (in the same support or compartmentalized in different carriers) allows a better control of the multi-step process and may help to reduce the costs.

Trabajo presentado en el 2nd World Congress on Targeting Microbiota, celebrado en París (Francia) del 16 al 17 de octubre de 2014., In the last decades, the selective sugar metabolism of the gut microbial communities has aroused huge interest. Today, sugars based on fructose (FOS), galactose (GOS) or isomaltose (IMOS) are increasingly being added to food for their beneficia! properties to stimulate the growth and activity of health-promoting Lactobacilli and Bifidobacteria species, the so-called prebiotic effect. Beside sugars hydrolysis, many glycosyl-hydrolases catalyze the transfer of a monosaccharide moiety from the hydrolysed substrate to other carbohydrates, thereby forming horno- and hetero-oligosaccharides with potential new applications in functional food, pharmaceutical and cosmeceutical industry. In that way, sorne fungal ­ fructofuranosidases (-FFases) catalyze the formation of (21) linkages between fructose units (inulin-type 1F­ FOS, e.g. 1-kestose or nystose). We have characterized severa! -FFases with new specificities from yeast such as Xanthophyllomyces dendrorhous, Schwanniomyces occidentalis and Rhodotorula dairenensis . -FFase from X. dendrorhous produces FOS of the 6G-serie (neoFOS, e.g. neokestose and neonystose), that contain a (26) linkage between a fructose and the glucosyl moiety of sucrose1. S. occidentalis -FFase forms 6F-FOS, that include (26)-linked fructose units (with a levan-type structure; e.g. 6-kestose)2 and the enzyme from R. dairenensis synthesizes a complex mixture of 1F-FOS, 6F-FOS and 6G-FOS.3 In addition, we have characterized an a-glucosidase from X. dendrorhous producing IMOS, basically panose (Glc-a(16)-Glc­ a(14)-Glc) instead of the typical mixture of isomaltose/isomaltotriose (1:1) produced by the Aspergillus niger.4 The potential prebiotic activity of sugars synthesized by these enzymes has been evaluated in an in vitro assay developed by Biopolis S.L using different probiotic bacteria! species. 1-Kestose and nystose favour mainly the growth of Lactobacillus plantarum and Bifidobacterium bifidum, respectively; neokestose enhances Enterococcus faecium and to a lesser extent L. plantarum and B. bifidum; panose promotes B. longum and B. catenulatum. lnterestingly, the growth of L. rhamnosus was not substantially improved by any sugars used in this assay and Salmonella typhimurium pathogen was strongly inhibited by 1-kestose.

Trabajo presentado en el ANQUE.ICCE.BIOTEC - Congress on Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, celebrado en Madrid del 01 al 04 de julio de 2014., β-fructofuranosidase from the non-conventional yeast Schwanniomyces occidentalis (Ffase) is a robust extracellular enzyme that catalyse the hydrolysis of several glycosidic subtrates with β-(2 → 1)-linked fructose moieties, such as sucrose, raffinose, and inulin [1]. The Ffase three dimentional structure has been solved as an homodimer of 160 KDa arranged like any other glycosyl-hydrolase (GH) enzyme included in family 32 (GH32); except that supplementary βsandwich domain of each molecular subunit is involved in substrate binding [2,3]. Interestingly, at high sucrose concentrations, this enzyme display varying degrees of fructosyltransferase activity by cleaving the β-(2 → 1) linkage, releasing glucose, and transferring a fructose unit onto a sucrose acceptor molecule. This results in an efficient production of two short-chain fructooligosaccharides (FOS), 6-kestose and 1-kestose, in a 3.5:1 ratio [1]. Both of them are considered as healthpromoting food ingredients because of their prebiotic properties [1]. In this work, we analysed in detail the hydrolytic and transfructosylating enzyme activity beneath the influence of different binary salts, containing, among others, Na+ ,Ca2+,Mg2+ and Fe3+. As it was expected from previous reports based on other GH32 yeast enzymes, all of these metal ions seem to affect significantly Ffase activity from a certain concentration on; albeit in a different way, despite the fact that all of them were supposed to be activators.

Trabajo presentado en el 3rd Multistep Enzyme Catalyzed Processes Congress, celebrado en Madrid (España) del 07 al 10 de abril de 2014., Amylolytic enzymes have important applications both in the food and the pharmaceutical industries. Among them, the synthesis of prebiotic isomaltooligosaccharides (IMOS) is of growing interest. We are currently optimizing the preparation of IMOS from starch following a multi-enzyme process based on a first hydrolytic step employing amylases from commercial sources or obtained from non-conventional yeasts, in particular Schwanniomyces occidentalis. A resulting syrup enriched in maltose or maltotriose is highly desirable to favour IMOS synthesis. The second step is the transglucosylation process catalyzed by alpha-glucosidases that can selectively form alpha-(1-6) linkages between glucoses. This reaction is also being studied with commercially available enzymes or that obtained from the yeast Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma). The process can be performed in one-pot or in two consecutive reactions. The main advances using the different methodologies will be addressed.

Trabajo presentado en el ANQUE.ICCE.BIOTEC - Congress on Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, celebrado en Madrid del 01 al 04 de julio de 2014., The β-fructofuranosidase Xd-INV from Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma) is an extracellular glycoprotein with a content of 59-67% N-linked carbohydrates and an estimated molecular mass of 160-200 kDa. This protein is included in family 32 of glycosylhydrolase (GH 32) on the basis of its amino acid sequence. Xd-INV, independently of the glycoforms, catalyzes the synthesis of neofructooligosaccharides (neoFOS), mainly neokestose and neonystose, sugars with enhanced prebiotic properties and higher chemical stability compared to traditional fructooligosaccharides (FOS). To the best our knowledge, this enzyme is the largest neoFOS microbial producer reported up to now [1]. Functionality of Xd-INV gene in Saccharomyces cerevisiae was previously reported [2], but only weak Xd-INV invertase activity was quantified in the cellular fraction of the transformant strain. In order to improve Xd-INV activity level, different heterologous expression systems, based in S. cerevisiae and Pichia pastoris, were evaluated. The DNA fragment encoding Xd-INV was fused to the S. cerevisiae MFα1 secretion signal and included in different expression vectors. The best expression level was obtained using P. pastoris and the produced enzyme was enzymatically characterized as well as analyzed on polyacrylamide gels using native or denaturing conditions and mass spectrometry. This study may provide the basis for a further mutational analysis of this enzyme that should shed additional light on the determinants responsible for fructosyltransferase activity within GH 32 enzyme family and the improvement of neoFOS production.

Trabajo presentado en la 4th International Conference on Novel Enzymes, celebrada en Gante (Bélgica) del 14 al 17 de octubre de 2014., Apart from sucrose hydrolysis, beta-fructofuranosidases (beta-FFases) also catalyze the transfer of the fructose moiety from sucrose to other carbohydrates (called acceptors, including sucrose itself), thus forming homo- and hetero-fructooligosaccharides (FOS) with potential applications in functional foods (prebiotics), pharmaceutical and cosmeceutical industries. Most fungal beta-FFases catalyze the formation of beta(2¿1) linkages between fructose units (inulin-type 1F-FOS, e.g. 1-kestose or nystose). We have isolated, purified, characterized and crystallized several extracellular ¿-fructofuranosidases from cultures of the yeasts Xanthophyllomyces dendrorhous (formerly Phaffia rhodozyma), Schwanniomyces occidentalis and Rhodotorula dairenensis with novel specificities. The ¿-FFase from X. dendrorhous is able to synthesize FOS of the 6G-series (neoFOS, e.g. neokestose and neonystose), which contain a ¿(2¿6) linkage between a fructose and the glucosyl moiety of sucrose.1 In addition, this enzyme fructosylates other disaccharides that contain glucose (maltose, isomaltulose, isomaltose, trehalose) and higher size oligosaccharides (maltotriose, raffinose, maltotetraose).2 S. occidentalis ¿-FFase forms 6F-FOS, which contain ¿(2¿6)-linked fructose units (with a levan-type structure; e.g. 6-kestose).3 The ¿-FFase from R. dairenensis synthesizes a complex mixture of 1F-FOS, 6F-FOS and 6G-FOS.4 The immobilization of several FFases has been also investigated to improve the corresponding bioprocesses.

Trabajo presentado en el ANQUE.ICCE.BIOTEC - Congress on Chemistry, Chemical Engineering and Biotechnology, celebrado en Madrid del 01 al 04 de julio de 2014., The control of the intestinal flora is one of the targets of the functional foods. A symbiotic equilibrium can be achieved by the intake of live microorganisms (probiotics) or by the so-called prebiotics (non-digested oligosaccharides). In the EU, the main prebiotics are inulin, fructooligosaccharides (FOS), galactooligosaccharides (GOS) and lactulose. Second generation prebiotics with improved activities, lower intestinal gas, major selectivity and/or stability are being investigated. Among them, chitooligosaccharides (COS) derived from chitin or chitosan exhibit interesting properties [1]. Chitin, which is formed by N-acetyl-D-glucosamine moieties with ß(1¿4) linkages, is the second most abundant natural polymer after cellulose. Chitosan is obtained by partial deacetylation of chitin and is a cationic polysaccharide composed of glucosamine and N-acetylglucosamine units. The low solubility of chitosan in neutral and alkaline solutions can be overcome by its partial hydrolysis into low-molecular-weight chitosan (LMWC) and COS, which renders molecules with higher aqueous solubility and improved biological properties [2]. We are currently investigating the synthesis of chitooligosaccharides from chitosan using glycosydic enzymes of the GH18 family (chitosanases). A colorimetric assay based on the DNS method was developed to screen chitosanase activity in different enzyme preparations. The sample with the highest activity was selected for further studies. The heterogeneity and low solubility of chitosan and related products makes difficult the analysis and identification of the reaction mixtures. In our work, the hydrolytic degradation of chitosan was analyzed in detail using various HPLC methodologies. First, the hydrolytic breakage of chitosan was visualized by size exclusion chromatography (SEC) with evaporative light-scattering detectors (ELSD). In order to analyze the composition of the resulting LMWC and COS, anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD) was employed. The composition of the mixtures obtained under different experimental conditions will be addressed.

Trabajo presentado en la XVI Reunión de la Red Temática Española LIGNOCEL: Biotecnología de Materiales Lignocelulósicos, celebrada en Pontevedra del 26 al 27 de septiembre de 2013., La P-fructofuranosidasa de Schwanniomyces occidentalis cataliza la hidrólisis de sacarosa y la formación de fructooligosacáridos (preferentemente 6-kestosa y 1-kestosa) con propiedades prebióticas. Su estructura ha sido resuelta recientemente; su forma activa es dimérica con un amplio sitio de unión al sustrato en el que varias zonas del carbohidrato interaccionan con residuos de ambas subunidades (1,2). Ello explica su actividad sobre fructanos de alto peso molecular, y concretamente sobre inulina (p. ej. de achicoria) y otros fructanos ramificados corno los presentes en el agave. En este trabajo hemos estudiado la actividad de la enzima sobre inulina y fructano s de agave mediante cromatografía aniónica con detector amperornétrico de pulsos (HAEC-PAD). Los resultados obtenidos, en particular la tasa de actividad sobre sacarosa e inulina, indican que la enzima podría considerarse como una inulinasa en lugar de una p-tructofura nosidasa. Con objeto de poder utilizar la enzima en reactores de lecho fijo para la hidrólisis en continuo de inulina, se estudió su inmovilización en resinas de polimetacrilato funcionalizadas con grupos amino (Sepabeads-EA y Sepabeads-HA). Se siguieron dos estrategias de inmovilización: por un lado, la adsorción iónica; por otro, con el objeto de lograr una unión más fuerte entre la enzima y el soporte, se estudió la unión covalente-mediada por otra enzima, concretamente la transglutamina sa- entre los grupos NH2 del soporte y los residuos glutamina de la P-fructofuranosidasa. Los biocatalizadores obtenidos se empaquetaron en un reactor de lecho fijo (12 mi) sin recirculación. Se estableció una corriente continua de entrada al reactor con una solución de inulina, y la composición de la corriente de salida se analizó mediante HPAEC- PAD. En ambos casos, el comportamiento del biocatalizador fue muy positivo: después de 7 días de operación en continuo no se detectó pérdida apreciable de actividad enzimática. En definitiva, la simple adsorción iónica de la inulinasa sobre el material aminado permite obtener un biocatalizador muy adecuado para la hidrólisis de fructanos en continuo. Además, esta estrategia podría usarse con otras enzimas glicosídicas.

Trabajo presentado en el Congreso de la Sociedad Española de Catálisis SECAT 13, celebrado en Sevilla (España) del 26 al 28 de junio de 2013., Los fructooligosacáridos (FOS) son oligómeros de fructosa con una glucosa terminal, en los que los grupos fructosilo se encuentran generalmente unidos mediante enlaces glicosídicos del tipo β(21), lo que les confiere propiedades prebióticas [1]. No obstante, es posible controlar la naturaleza de los FOS formados; así, la - fructofuranosidasa de Aspergillus sp. sintetiza una mezcla de 1-kestosa, nistosa y fructosilnistosa, las de las levaduras Schwanniomyces occidentalis, Rhodotorula dairinensis y Saccharomyces cerevisiae producen fundamentalmente 6-kestosa. En particular, la enzima de Xanthophyllomyces dendrorhous se caracteriza por transferir un residuo de fructosa sobre la posición 6- de la glucosa en la molécula de sacarosa dando lugar a la formación de neokestosa como producto principal [2]. En este trabajo hemos explotado la peculiar regioespecificidad de la - fructofuranosidasa de X. dendrorhous para llevar a cabo la fructosilación de maltosa., Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (Proyectos BIO2010-20508-C04-01 y BIO2010-20508-C04-04).

Generally two selection markers are required to obtain homozygous mutations in a diploid background, one for each gene copy that is interrupted. In this chapter is described a method that allows the double gene deletions of the two copies of a gene from a diploid organism, a wild-type strain of the Xanthophyllomyces dendrorhous yeast, using hygromycin B resistance as the only selection marker. To accomplish this, in a first step, a heterozygous hygromycin B-resistant strain is obtained by a single process of transformation (carrying the inserted hph gene). Following, the heterozygous mutant is grown in media with increasing concentrations of the antibiotic. In this way, the strains that became homozygous (by mitotic recombination) for the antibiotic marker would able to growth at higher concentration of the antibiotic than the heterozygous. The method can be potentially applied for obtaining double mutants of other diploid organisms. © 2012 Springer Science+Business Media New York., This work was supported by Fondecyt 1100324, Innova CORFO 07CN13PZT-17, CICYT BIO2010-20508-C04-01/04, and by an institutional grant from the Fundación Ramón Areces to the Centro de Biología Molecular Severo Ochoa.

Double-stranded RNA (dsRNA) molecules are widely found in yeasts and filamentous fungi. It has been suggested that may play important roles in the evolution of eukaryote genomes and may be a valuable tool in yeast typing. The characterization of these extrachromosomal genetic elements is usually a laborious process, especially when trying to analyze a large number of samples. In this chapter, we describe a simple method to isolate dsRNA elements from yeasts using low amounts of starting material, and their application to different Xanthophyllomyces dendrorhous strains. Furthermore, the methodologies for enzymatic and hybridization characterizations, and quantification of relative dsRNA abundance are detailed. © 2012 Springer Science+Business Media New York.

β-Fructofuranosidases can divert their hydrolytic activity towards transglycosylation for the synthesis of high value-added products, including prebiotic fructooligosaccharides (FOS). A directed evolution strategy has been employed to enhance the transferase rate of the β-fructofuranosidase (SoINV) from the Schwanniomyces occidentalis yeast for the production of β-(2→6)-linked FOS. To screen for transferase activity of the SoINV functionally expressed in Saccharomyces cerevisiae, a high-throughput screening protocol based on two colorimetric assays was validated (with coefficient of variance below 11%). Mutagenic libraries were constructed by error-prone PCR and clones showing higher glucose:fructose ratio with respect to the parental type were identified. Further analysis by anion-exchange chromatography coupled with pulsed amperometric detection helped to identify mutants with improved yields for the synthesis of β-(2→6) fructooligosaccharides. Selected mutants displayed transferase initial rates enhanced ∼2-fold over parent type, reaching production levels up to 47 g/L after 48 h of reaction for the formation of 6-kestose. © 2011 Bentham Science Publishers Ltd., This study is based upon work funded National projects (BIO2007-67708-C04-01, -03; CCG08-CSIC/PPQ-3706, BIO2010-20508-C04-01-, 03) and by an institutional grant from the Fundación Ramón Areces to the Centro de Biología Molecular Severo Ochoa. M. Abreu and M. Alvaro-Benito were supported by a FPU fellowship from the Spanish Ministry of Education and Science and the Comunidad de Madrid program, respectively.

Fecha de solicitud: 16/11/2009.- Titular: Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC), Nueva actividad fructofuranosidasa de Rhodotorula para la obtención de oligosacáridos prebióticos. Se proporciona un procedimiento viable industrialmente de obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales, que utiliza una nueva enzima fructofuranosidasa de Rhodotorula. También se proporciona un procedimiento de obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, así como de la enzima sustancialmente pura con esta actividad.

[EN] Procedure of obtainment of a biocatalyst comprising: immobilisation of a fungal enzyme through inclusion in a calcium alginate gel and subsequent drying of the immobilised biocatalyst obtained in step (a). The invention furthermore relates to the biocatalyst obtained through the procedure of the invention and comprising fungal enzymes, preferably fructosyltransferase or B-fructofuranosidase, immobilised in alginate. Moreover the invention relates to the use of said biocatalyst for such biotransformation wherein the substrate is a concentrated solution of a carbohydrate and, [ES] Procedimiento de obtención de un biocatalizador, que comprende: inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato calcico. y el secado posterior el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a). La invención también se refiere al biocatalizador obtenido por el procedimiento de Ia invención y que comprende enzimas fúngicas, preferiblemente fructosiltransferasa o ss-fructofuranosidasa, inmovilizadas en alginato. Además Ia invención se refiere al uso de dicho biocatalizador para Ia biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad Autónoma de Madrid, A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

[EN] Procedure of obtainment of a biocatalyst comprising: immobilisation of a fungal enzyme through inclusion in a calcium alginate gel and subsequent drying of the immobilised biocatalyst obtained in step (a). The invention furthermore relates to the biocatalyst obtained through the procedure of the invention and comprising fungal enzymes, preferably fructosyltransferase or B-fructofuranosidase, immobilised in alginate. Moreover the invention relates to the use of said biocatalyst for such biotransformation wherein the substrate is a concentrated solution of a carbohydrate and [ES] Procedimiento de obtención de un biocatalizador, que comprende: inmovilizar una enzima fúngica por inclusión en un gel de alginato calcico. y el secado posterior el biocatalizador inmovilizado obtenido en el paso (a). La invención también se refiere al biocatalizador obtenido por el procedimiento de Ia invención y que comprende enzimas fúngicas, preferiblemente fructosiltransferasa o ss-fructofuranosidasa, inmovilizadas en alginato. Además Ia invención se refiere al uso de dicho biocatalizador para Ia biotransformación en las que el sustrato es una disolución concentrada de un carbohidrato y se puede llevar a cabo en un reactor continuo. Peer reviewed Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), Universidad Autónoma de Madrid A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

Referencia OEPM: P200501875.-- Fecha de solicitud: 29/07/2005.-- Titulares: Universidad Autónoma de Madrid (UAM), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC)., Nueva enzima, con actividad fructofuranosidasa para la obtención de oligosacaridos prebióticos. Se proporciona un procedimiento de obtención de oligosacáridos prebióticos viable industrialmente que utiliza una nueva enzima extracelular (fructofuranosidasa) de Xanthophyllomyces dendrorhous, caracterizada por presentar, además, actividad transfructosilasa. También se proporciona un procedimiento de obtención de un producto enzimático con actividad fructofuranosidasa, así como de la enzima sustancialmente pura con esta actividad. El producto enzimático y la enzima presentan como aspectos positivos un alto espectro de actuación, alta termoestabilidad y una alta actividad específica. Los oligosacáridos prebióticos se usan en alimentación.

Filing Date: 2005-12-15.-- Priority Data: ES P 200402994 (2004-12-16)., The invention relates to a method of producing industrially-viable prebiotic oligosaccharides using a novel enzyme of Xanthophyllomyces dendrorhous, which is characterised by having α-glucosidase activity. The invention also relates to a method of obtaining an enzymatic product with α-glucosidase activity and the substantially-pure enzyme with α-glucosidase activity. The enzymatic product and the enzyme offer the advantage of having a high performance spectrum and a high specific activity. Said prebiotic oligosaccharaides are used in food.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica y, en particular, en el sector agroalimentario dedicado a la obtención de oligosacáridos prebióticos para ser utilizados como ingredientes funcionales en productos dietéticos, productos lácteos, alimentos infantiles y alimentos para animales. Se proporciona un procedimiento de obtención, a partir de sacarosa, de oligosacáridos prebióticos, principalmente 6-kestosa, viable industrialmente, que utiliza una nueva actividad transfructosidasa asociada a la invertasa extracelular de la levadura Schwanniomyces occidentalis. También se proporciona un procedimiento para la obtención del producto enzimático con actividad transfructosilasa, así como de la correspondiente enzima pura. Algunos aspectos positivos del producto enzimático y de la enzima de la invención, son que presentan un variado espectro de actuación y una alta actividad específica, convirtiéndolos en candidatos idóneos para hidrolizar o modificar oligosacáridos. Otro aspecto importante a nivel industrial es que la enzima es estable durante largos tiempos de reacción a una temperatura de aproximadamente 50 ºC. La secuencia nucleotídica codificante para la actividad analizada muestra marcadas diferencias con la secuencia del gen previamente descrito. Las variaciones se muestran también en la invención.

[EN] Metschnikowia reukaufii is a widespread yeast able to grow in the plants’ floral nectaries, an environment of extreme conditions with sucrose concentrations exceeding 400 g l−1, which led us into the search for enzymatic activities involved in this sugar use/transformation. New oligosaccharides were produced by transglucosylation processes employing M. reukaufii cell extracts in overload‐sucrose reactions. These products were purified and structurally characterized by MS‐ESI and NMR techniques. The reaction mixture included new sugars showing a great variety of glycosidic bonds including α‐(1→1), α‐(1→3) and α‐(1→6) linkages. The main product synthesized was the trisaccharide isomelezitose, whose maximum concentration reached 81 g l−1, the highest amount reported for any unmodified enzyme or microbial extract. In addition, 51 g l−1 of the disaccharide trehalulose was also produced. Both sugars show potential nutraceutical and prebiotic properties. Interestingly, the sugar mixture obtained in the biosynthetic reactions also contained oligosaccharides such as esculose, a rare trisaccharide with no previous NMR structure elucidation, as well as erlose, melezitose and theanderose. All the sugars produced are naturally found in honey. These compounds are of biotechnological interest due to their potential food, cosmeceutical and pharmaceutical applications., This work was supported by the Projects BIO2016‐76601‐C3‐2‐R/‐1‐R from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness and Fundación Ramón Areces (XIX Call of Research Grants in Life and Material Sciences). Martin Garcia‐Gonzalez fellowship FPU16/02925 was supported by the Spanish Ministry of Education, Culture and Sport. We thank Fundación Ramón Areces for an institutional grant to the Center of Molecular Biology Severo Ochoa. We also thank Mrs. Asunción Martín‐Redondo for the technical support.

10 pags., 2 figs., 1 tab., Zymomonas mobilis ZM4 is an attractive host for the development of microbial cell factories to synthesize high-value compounds, including prebiotics. In this study, a straightforward process to produce fructooligosaccharides (FOS) from sucrose was established. To control the relative FOS composition, recombinant Z. mobilis strains secreting a native levansucrase (encoded by sacB) or a mutated β-fructofuranosidase (Ffase-Leu196) from Schwanniomyces occidentalis were constructed. Both strains were able to produce a FOS mixture with high concentration of 6-kestose. The best results were obtained with Z. mobilis ZM4 pB1-sacB that was able to produce 73.4 ± 1.6 g L-1 of FOS, with a productivity of 1.53 ± 0.03 g L-1 h-1 and a yield of 0.31 ± 0.03 gFOS gsucrose-1. This is the first report on the FOS production using a mutant Z. mobilis ZM4 strain in a one-step process. KEY POINTS: • Zymomonas mobilis was engineered to produce FOS in a one-step fermentation process. • Mutant strains produced FOS mixtures with high concentration of 6-kestose. • A new route to produce tailor-made FOS mixtures was presented., The study received financial support from Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) under the scope of the strategic funding of UIDB/04469/2020 unit and the project FoSynBio—Synthetic biology approaches to design and construct microbial cell factories for the production of fructooligosaccharides (POCI-01–0145-FEDER-029549).

17 pags., 5 figs., 1 tab. -- This article belongs to the Special Issue Protein Structure and Function in Microorganisms, Rhodotorula dairenensis β-fructofuranosidase is a highly glycosylated enzyme with broad substrate specificity that catalyzes the synthesis of 6-kestose and a mixture of the three series of fructooligosaccharides (FOS), fructosylating a variety of carbohydrates and other molecules as alditols. We report here its three-dimensional structure, showing the expected bimodular arrangement and also a unique long elongation at its N-terminus containing extensive O-glycosylation sites that form a peculiar arrangement with a protruding loop within the dimer. This region is not required for activity but could provide a molecular tool to target the dimeric protein to its receptor cellular compartment in the yeast. A truncated inactivated form was used to obtain complexes with fructose, sucrose and raffinose, and a Bis-Tris molecule was trapped, mimicking a putative acceptor substrate. The crystal structure of the complexes reveals the major traits of the active site, with Asn387 controlling the substrate binding mode. Relevant residues were selected for mutagenesis, the variants being biochemically characterized through their hydrolytic and transfructosylating activity. All changes decrease the hydrolytic efficiency against sucrose, proving their key role in the activity. Moreover, some of the generated variants exhibit redesigned transfructosylating specificity, which may be used for biotechnological purposes to produce novel fructosyl-derivatives., This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness through grants BIO2016-76601-C3-3-R/-C3-2-R/-C3-1-R, PID2019-105838RB-C33/-C32/C31 and Fundación Ramón Areces [XIX Call of Research Grants in Life and Material Sciences]. We are grateful to the staff of the Synchrotron Radiation Sources at Alba (Barcelona, Spain) for providing access and for technical assistance at BL13-XALOC beamline and to the Fundación Ramón Areces for an institutional grant to the Centre of Molecular Biology Severo Ochoa

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 15-09-2021, Los ambientes hipersalinos se caracterizan por elevadas concentraciones de sales, que permiten su hábitat a un limitado grupo de microorganismos denominados halófilos. Dichos microorganismos halófilos han sido capaces de colonizar estos entornos debido a una serie de modificaciones en su fisiología. Una de esas modificaciones es la gran producción de exopolisacáridos (EPS), cuya composición química les confiere características singulares con aplicaciones en la industria alimentaria, cosmética o farmacéutica, así como la biorremediación de ambientes contaminados. Para la realización de esta Tesis Doctoral se recogieron muestras de 5 salinas en la comunidad de Castilla-La Mancha, a partir de las cuales se diseñó un proceso de screening a partir de propiedades fenotípicas, proceso en el que se selecionaron y aislaron 20 cepas productoras de EPS diferentes. Se desarrolló un método de conservación a partir de glicerinados con porcentajes de sal y glicerol del 5% y 25% respectivamente, así como el estudio de varios métodos alternativos de conservación de menor coste energético, siendo el más efectivo la conservación en sal. Estas cepas fueron caracterizadas por técnicas genéticas y microbiológicas para obtener más información sobre su morfología, maquinaria celular y requerimientos nutricionales, perteneciendo muchas de ellas a la familia Halomonadaceae. Se produjeron los EPS para los 20 halófilos a partir de cuatro fuentes de carbono diferentes: glucosa, sacarosa, lactosa y glicerol. De estas cepas, 10 mostraron resultados significativos en cuanto al EPS producido cuando la fuente de carbono seleccionada fue lactosa, especialmente remarcable en Halomonas elongata AGH B. La composición química de los EPS producidos fue estudiada por técnicas espectrofotométricas UV-VIS y cromatográficas mediante HPLC. Destaca entre los resultados obtenidos la presencia de azúcares poco comunes en alto porcentaje dentro de su composición, como ramnosa o fucosa, así como la presencia de grupos sulfatos. Adicionalmente se revelaron distintas actividades biológicas, como una elevada actividad emulsionante o antioxidante, que sumadas a su capacidad de estabilización y gelificación de las soluciones, los hacen muy interesantes desde el punto de vista industrial. El candidato que mejores resultados mostró fue Halomonas elongata AGH B, presentando su composición más de un 39% de ramnosa y un 5% de sulfatos, considerable actividad antioxidante y emulsionante, así como propiedades gelificantes o mucoides, que permiten estirar sus colonias más de 10 cm en los aislamientos en medios de cultivo sólidos. Los parámetros de producción y el medio de cultivo se optimizaron para esta cepa, alcanzándose una capacidad productiva de más de 3,4g/L de medio de cultivo, revelando una de la mayores capacidades productoras de EPS de su género, similar a Halomonas maura S-30 o Halomonas

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 16-12-2016

Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 25-10-2000