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Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Diabetes mellitus (DM) is a degenerative disease representing one of the greatest concerns to modern global health, and worryingly with its incidence increasing worldwide at epidemic rates. DM is associated with the emergence of a variety of clinical complications, including reproductive dysfunction. Given the extension and multifactorial nature of diabetes-induced physiological changes, it remains unclear what are the mechanisms that may contribute for the reproductive dysfunction described in male diabetic patients. Considering that hyperglycemia has been described as a major effector of the disease pathophysiology, two different in vitro approaches were used to address the isolated effect of high glucose conditions on sperm function and spermatogenesis, thus avoiding other in vivo confounding players. A complete and integrated analysis, through a diversity of important indicators of spermatozoa functionality (motility, viability, capacitation status, acrosomal integrity, mitochondrial superoxide production and mitochondrial membrane potential) suggests that high glucose concentrations does not seem to directly affect spermatozoa, at least in vitro. Organ culture experiments, mimicking the spermatogenic process, determined that high glucose levels increase Sertoli cell number while decreasing tubular luminal area, therefore suggesting an impairment of this somatic cell type with hub importance in spermatogenic control. Taken together, this study suggests that high glucose levels per se seems to influence the male reproductive system only at the spermatogenesis level, stressing the importance of other factors involved in the disease. A Diabetes mellitus (DM) é uma doença degenerativa cuja incidência está a aumentar de forma galopante, sendo actualmente considerada um grave problema de saúde pública. A DM está ainda associada ao surgimento de uma grande variedade de complicações clínicas afectando todos os sistemas de órgãos, não sendo o sistema reprodutor masculino uma excepção. Dada a extensão e natureza multifatorial das alterações fisiológicas induzidas pela DM, permanecem ainda por esclarecer quais os mecanismos responsáveis pela disfunção reprodutora frequentemente reportada em pacientes diabéticos do sexo masculino, incluindo alterações na espermatogénese ou em vários parâmetros seminais. Considerando que a hiperglicémia tem sido descrita como um dos principais efectores das alterações associadas à DM, no presente projecto, foi estudado, através de duas abordagens in vitro distintas, o efeito isolado da hiperglicémia na função espermática e na progressão do processo espermatogénico. Estes sistemas permitiram assim excluir outros factores envolvidos na doença. Uma análise completa e integrada, realizada através da avaliação de uma grande diversidade de importantes indicadores da funcionalidade espermática (mobilidade, viabilidade, estado de capacitação, integridade acrossomal, produção de superóxido mitocondrial e potencial membranar mitocondrial) sugere que, pelo menos in vitro, elevadas concentrações de glucose não afectam directamente o espermatozóide. Os resultados obtidos com um sistema de cultura de órgãos permitiram verificar que elevados níveis de glucose levaram a um aumento do número de células de Sertoli e a uma diminuição da área luminal tubular. Estes resultados sugerem, portanto, uma disfunção neste tipo de células somáticas essenciais para o controlo da espermatogénese. Através deste estudo foi possível verificar e sugerir que a disfunção reprodutora de pacientes do sexo masculino parece não resultar apenas da influência da glucose, apesar de terem sido detectadas alterações ao nível da espermatogénese, sublinhando a importância da natureza multifactorial da doença.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-07T15:17:06Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Ricardo_Luis_Lopes_Braga.pdf: 3825535 bytes, checksum: d70831f28a0cbae7fc9266cf98918e38 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-07T15:17:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_FINAL_PUBLICADA_Ricardo_Luis_Lopes_Braga.pdf: 3825535 bytes, checksum: d70831f28a0cbae7fc9266cf98918e38 (MD5) Previous issue date: 2013-03-27 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Enteroaggregative Escherichia coli (EAEC) are an emerging pathotype associated with cases of acute or persistent diarrhea in children and adults in developed and emerging countries. It causes persistent diarrhea in HIV positive patients and it is the second most common cause of traveler s diarrhea. The aggregative adherence (AA) pattern characterized by arrangement in stacked brick monolayer HEp-2 (human larynx carcinoma) is related to the presence of a plasmid aggregative adherence (pAA) of 60 MDa. The hypothetical pathogenesis is represented by the heterogeneity of the category that covers a variety of putative virulence factors involved in the processes of colonization, cell adhesion and cytotoxicity. The present study aimed to investigate the ability of producing the standard AA by EAEC strains in HEp-2, Caco-2 (human colorectal adenocarcinoma) and T84 (human intestinal colon carcinoma), the correlation between AA and pAA in each strain in addition to the interaction of EAEC strains using in vitro organ culture model (IVOC). For the first two objectives were used seventeen EAEC strains (10 from children with acute diarrhea and seven from children without diarrhea). For the last were employed five EAEC strains from children with acute diarrhea. The adhesion assays were performed with strains co-incubated with cell lines under study for a period of 3 h and 6 h. Among the 17 strains EAEC 29.4%, 41.1% and 82.3% showed AA at 3 h in cell lines HEp-2, Caco-2 and T84, respectively. In 6 h, 52.9% EAEC strains exhibited AA in HEp-2 and Caco-2 and 100% strains exhibited AA in T84. As the line T84 has phenotypic characteristics of colon cells and Caco-2 of the cells of the small intestine, data suggested that EAEC may have a higher tropism for the human colon. PCR for detection of pAA showed 29.4%, 41.1% and 52.9% of the strains as pAA-positive showing the AA pattern in HEp-2, Caco-2 and T84 cells, simultaneously, in tests of 3 h. In 6 h, 47%, 52.9% and 70.5% of the strains pAA + exhibited AA pattern in HEp-2, Caco-2 and T84, respectively. The in vitro adhesion assays using cultured tissue were performed with EAEC strains co-incubated with intestinal fragments of ileum and colon over a period of 6 h. Light microscopy (LM) revealed two strains more adherent to the colon, one to the ileum and two to both. The scanning electron microscopy (SEM) showed three strains more adherent to the colon, one to the ileum and another to both. Bacterial aggregates on the epithelium or overlapping the mucus were observed by LM and SEM. LM assays also showed morphological changes such as cellular extrusion, structural disorganization and destruction of the villi. The results showed that the line T84 proved to be more susceptible to aggregative pattern formation, as well as the adherence of strains AA / pAA +, which was ratified by the higher degree of adherence to the colonic mucosa in the IVOC. Finally, data indicated that these models are more effective for elucidating the pathogenicity of these strains. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patotipo emergente associado a casos de diarreia aguda ou persistente em crianças e adultos de países desenvolvidos e em desenvolvimento. É causador da diarreia persistente em pacientes HIV positivos e a segunda causa mais comum de diarreia dos viajantes. Seu padrão de aderência agregativo (AA) caracterizado pelo arranjo em tijolos empilhados em monocamada de células HEp-2 (carcinoma de laringe humana), está relacionado com a presença de um plasmídeo de aderência agregativa (pAA) de 60 MDa. A hipotética patogenia é representada pela heterogeneidade da categoria que abrange diversos fatores putativos de virulência envolvidos nos processos de colonização, adesão celular e citotoxicidade. O presente estudo teve como objetivos investigar a habilidade de produção do padrão AA pelas cepas EAEC nas linhagens HEp-2, Caco-2 (adenocarcinoma colo-retal humano) e T84 (carcinoma de cólon intestinal humano), a correlação entre AA e pAA em cada linhagem e analisar a interação de cepas EAEC utilizando modelo de cultura de órgão in vitro (IVOC). Para os dois primeiros objetivos foram utilizadas dezessete cepas EAEC, sendo 10 provenientes de crianças com diarreia aguda e sete de crianças sem diarreia. Para o último foram empregadas cinco cepas EAEC de crianças com diarreia aguda. Os ensaios de aderência foram realizados com as cepas co-incubadas com as linhagens celulares em estudo por um período de 3 e 6 horas. Entre as 17 cepas EAEC 29,4%, 41,1% e 82,3% apresentaram AA em 3 horas nas linhagens celulares HEp-2, Caco-2 e T84, respectivamente. Em 6 horas, 52,9% exibiram AA em HEp-2 e Caco-2 e 100% exibiram AA em T84. Como a linhagem T84 apresenta características fenotípicas das células do cólon e Caco-2 das células do intestino delgado, nossos resultados sugerem que EAEC pode apresentar maior tropismo pelo cólon humano. Para a pesquisa do pAA foi realizado uma reação em cadeia de polimerase (PCR). Observamos que 29,4%, 41,1% e 52,9% das cepas pAA+ apresentaram padrão AA em HEp-2, Caco-2 e T84, simultaneamente, nos testes de 3 horas. Em 6 horas, 47%, 52,9% e 70,5% das cepas pAA+ exibiram padrão AA em HEp-2, Caco-2 e T84, respectivamente. Os ensaios de aderência em tecido cultivado in vitro foram realizados com as cepas co-incubadas com fragmentos intestinais de íleo e cólon por um período de 6 horas. A microscopia de luz (ML) duas cepas foram mais aderentes ao cólon, uma ao íleo e duas a ambos. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) três cepas foram mais aderentes ao cólon, uma ao íleo e outra a ambos. A ML e MEV foram observados agregados bacterianos sobre o epitélio ou sobreposto ao muco. A ML ainda foi observada alterações morfológicas como extrusão celular, desorganização estrutural e destruição das vilosidades. Os resultados evidenciaram que a linhagem T84 mostrou ser mais suscetível a formação do padrão agregativo, bem como à aderência de cepas AA/pAA+, o que foi ratificado pelo maior grau de aderência a mucosa colônica no IVOC. Nossos dados indicam que estes modelos são mais eficazes para a elucidação da patogenicidade dessas cepas.