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Con el objetivo de diseñar un biocatalizador para la reducción del contenido en L-Fenilalanina con aplicación a la producción de fórmulas para pacientes con Fenilcetonuria, PAL fue obtenida a partir de Rhodosporidium toruloides NBRC 0559. Luego, PAL fue recuperada, purificada, inmovilizada por encapsulación en membranas semipermeables y empleada en: a) reactor de columna con recirculación y b) reactor tipo tanque agitado. La bioconversión se monitoreó espectrofotométricamente (DO290) siguiendo la producción de ácido t-cinámico. La enzima obtenida evidenció una elevada actividad enzimática, gran afinidad por el sustrato y una temperatura óptima de  43C. En cuanto al empleo de PAL inmovilizada, la utilización de un reactor tipo tanque agitado resultó óptima para la reducción de Lfenilalanina dado el efecto de la agitación en la reducción del espesor de la película estanca adyacente a la membrana. El factor más influyente en la velocidad de reacción fue el espesor de membrana, alcanzando de este modo la eliminación completa de una solución 0,1 mM de L-Fenilalanina en 6 h. En conclusión, PAL inmovilizada por encapsulación en membranas celulósicas es un método viable para la reducción del contenido de L-Fenilalanina en soluciones diluidas. Este método podría extrapolarse a sustratos más complejos como lo son hidrolizados proteicos. For the design of a biocatalyst capable of reducing the L-Phenylalanine content to produce formulas for Phenylketonuria patients, PAL was obtained from Rhodosporidium toruloides NBRC 0559. PAL was produced, recovered from the culture medium, purified, immobilized by encapsulation in semipermeable membranes and used in: a) column reactor with recirculation and b) stirring tank reactor. The bioconversion was spectrophotometrically monitored (OD290) by t-cinnamic acid production. PAL demonstrated to have high activity and affinity for L-Phenylalanine, with an optimal temperature of  43C. In relation to PAL utilization, the stirring tank reactor was the most appropriate system for bioconversion because of agitation effect in the diffusion of substrate and products to the membrane. In addition, membrane wall thickness was a key factor in bioconversion rate, reaching the complete removal of 0,1 mM L-Phenylalanine in 6 h. These results indicate that purified PAL immobilized by encapsulation in semipermeable membranes can be applied for the reduction of L-Phenylalanine content in diluted solutions. It could be potentially used with protein hydrolysates as a model substrate in the development of low L-Phenylalanine foodstuff. Fil: Castañeda, María Teresita. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ingeniería. Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentina. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ingeniería. Departamento de Electrotecnia. Laboratorio de Electrónica Industrial, Control e Instrumentación; Argentina Fil: Adachi, Osao. Yamaguchi University; Japón Fil: Hours, Roque Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Mar del Plata. Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales. Universidad Nacional de Mar del Plata. Facultad de Ingeniería. Instituto de Investigaciones en Ciencia y Tecnología de Materiales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - La Plata. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas. Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales; Argentina

Con el objetivo de diseñar un biocatalizador para la reducción del contenido en L-Fenilalanina con aplicación a la producción de fórmulas para pacientes con Fenilcetonuria, PAL fue obtenida a partir de Rhodosporidium toruloides NBRC 0559. Luego, PAL fue recuperada, purificada, inmovilizada por encapsulación en membranas semipermeables y empleada en: a) reactor de columna con recirculación y b) reactor tipo tanque agitado. La bioconversión se monitoreó espectrofotométricamente (DO290) siguiendo la producción de ácido t-cinámico. La enzima obtenida evidenció una elevada actividad enzimática, gran afinidad por el sustrato y una temperatura óptima de  43C. En cuanto al empleo de PAL inmovilizada, la utilización de un reactor tipo tanque agitado resultó óptima para la reducción de L-fenilalanina dado el efecto de la agitación en la reducción del espesor de la película estanca adyacente a la membrana. El factor más influyente en la velocidad de reacción fue el espesor de membrana, alcanzando de este modo la eliminación completa de una solución 0,1 mM de L-Fenilalanina en 6 h. En conclusión, PAL inmovilizada por encapsulación en membranas celulósicas es un método viable para la reducción del contenido de L-Fenilalanina en soluciones diluidas. Este método podría extrapolarse a sustratos más complejos como lo son hidrolizados proteicos., For the design of a biocatalyst capable of reducing the L-Phenylalanine content to produce formulas for Phenylketonuria patients, PAL was obtained from Rhodosporidium toruloides NBRC 0559. PAL was produced, recovered from the culture medium, purified, immobilized by encapsulation in semipermeable membranes and used in: a) column reactor with recirculation and b) stirring tank reactor. The bioconversion was spectrophotometrically monitored (OD290) by t-cinnamic acid production. PAL demonstrated to have high activity and affinity for L-Phenylalanine, with an optimal temperature of  43C. In relation to PAL utilization, the stirring tank reactor was the most appropriate system for bioconversion because of agitation effect in the diffusion of substrate and products to the membrane. In addition, membrane wall thickness was a key factor in bioconversion rate, reaching the complete removal of 0,1 mM L-Phenylalanine in 6 h. These results indicate that purified PAL immobilized by encapsulation in semipermeable membranes can be applied for the reduction of L-Phenylalanine content in diluted solutions. It could be potentially used with protein hydrolysates as a model substrate in the development of low L-Phenylalanine foodstuff., Centro de Investigación y Desarrollo en Fermentaciones Industriales, Instituto de Investigaciones en Electrónica, Control y Procesamiento de Señales

We isolated thermotolerant Gluconobacter strains that are able to produce 5-keto-d-gluconic acid (5KGA) at 37 degrees C, a temperature at which regular mesophilic 5KGA-producing strains showed much less growth and 5KGA production. The thermotolerant strains produced 2KGA as the major product at both 30 and 37 degrees C. The amount of ketogluconates produced at 37 degrees C was slightly less than the amount produced at 30 degrees C. To improve the yield of 5KGA in these strains, we disrupted flavin adenine dinucleotide-gluconate dehydrogenase (FAD-GADH), which is responsible for 2KGA production. Genes for FAD-GADH were cloned by using inverse PCR and an in vitro cloning strategy. The sequences obtained for three thermotolerant strains were identical and showed high levels of identity to the FAD-GADH sequence reported for the genome of Gluconobacter oxydans 621 H. A kanamycin resistance gene cassette was used to disrupt the FAD-GADH genes in the thermotolerant strains. The mutant strains produced 5KGA exclusively, and the final yields were over 90% at 30 degrees C and 50% at 37 degrees C. We found that the activity of pyrroloquinoline quinone (PQQ)-dependent glycerol dehydrogenase, which is responsible for 5KGA production, increased in response to addition of PQQ and CaCl(2) in vitro when cells were grown at 37 degrees C. Addition of 5 mM CaCl(2) to the culture medium of the mutant strains increased 5KGA production to the point where over 90% of the initial substrate was converted. The thermotolerant Gluconobacter strains that we isolated in this study provide a promising new option for industrial 5KGA production.

En la presente tesis se aborda el estudio y desarrollo de una metodología biotecnológica novedosa para la producción de fórmulas o suplementos alternativos para pacientes con fenilcetonuria. Dicha metodología se basa en el empleo de un biocatalizador, particularmente de la enzima L-Fenilalanina amonio liasa (PAL, EC 4.3.1.25), producida a partir del cultivo de Rhodosporidium toruloides NBRC 0559. PAL cataliza la desaminación no oxidativa de L-Fenilalanina (L-Phe) en ácido trans-cinámico. Esta enzima fue aplicada para la reducción o deprivación del contenido de fenilalanina, empleando como modelo hidrolizados proteicos comerciales de diferente origen. La metodología desarrollada consiste en una primera etapa basada en la obtención del biocatalizador. Ésta incluyó, por un lado, la optimización de los componentes del medio de cultivo a emplear, mediante diseños experimentales, con la finalidad de incrementar la actividad PAL. Seguidamente, se procedió a la recuperación del biocatalizador de dos maneras. Por un lado, se obtuvieron células conteniendo PAL, las cuales se permeabilizaron adecuadamente para funcionar como un microreactor y se caracterizaron como tal. Por otro lado, se contrastó el biocatalizador obtenido con PAL purificada, obtenida a partir de un protocolo estándar de purificación. En una segunda etapa, se inmovilizaron las células catalíticas por inclusión en polímeros, empleando alginato de calcio. Las mismas se caracterizaron para determinar su factibilidad de uso, teniendo en cuenta su potencial aplicación industrial. A su vez, este sistema se contrastó con la enzima purificada inmovilizada por inclusión en membranas celulósicas. Finalmente, en una tercera etapa, el biocatalizador seleccionado se empleó en el tratamiento de hidrolizados proteicos comerciales, como modelo de aplicación. A su vez, se empleó como alternativa PAL parcialmente purificada, libre en solución. De acuerdo al biocatalizador, se evaluó la necesidad del pretratamiento de los sustratos, así como también, las condiciones óptimas de operación para lograr la mayor reducción en menor tiempo. A partir de los estudios llevados a cabo en la presente tesis, se logró demostrar la factibilidad del método propuesto, en la reducción del contenido de L-Phe en hidrolizados proteicos. Estos estudios son la base para el desarrollo de fórmulas para pacientes con fenilcetonuria, obtenidas por métodos biotecnológicos. Futuros estudios requerirán un abordaje más tecnológico a escala piloto para su transferencia a la industria local., Facultad de Ingeniería