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Rice is one of the most important crops in the world and is considered a strategic crop for food security. Furthermore, the excessive use of chemical fertilizers to obtain high yields causes environmental problems. A sustainable alternative includes taking advantage of beneficial bacteria that promote plant growth. Here, we investigate the effect of five bacterial biofertilizers from halophytes on growth, and we investigate photosynthetic efficiency in rice plants grown under saline conditions (0 and 85 mmol L−1 NaCl) and future climate change scenarios, including increased CO2 concentrations and temperature (400/700 ppm and 25/+4 °C, respectively). Biofertilizers 1–4 increased growth by 9–64% in plants grown with and without salt in both CO2- temperature combinations, although there was no significant positive effect on the net photosynthetic rate of rice plants. In general, biofertilizer 1 was the most effective at 400 ppm CO2 and at 700 ppm CO2 +4 °C in the absence of salt. Inocula 1–5 also stimulated plant length at high CO2 levels without salt. Finally, the positive effect of biofertilization was attenuated in the plants grown under the interaction between salt and high CO2. This highlights the significance of studying biofertilization under stress interaction to establish the real potential of biofertilizers in the context of climate change conditions.

The Donana ˜ wetlands comprise an emblematic Mediterranean landscape protected as a UNESCO World Heritage Site. Some parts of these wetlands have been transformed into intensive rice cultivation areas, which are currently the most productive rice-growing areas in Europe. We examined the bacterial communities in these domesticated soils as they are key for plant health and productivity and have a strong influence on biochemical cycles. To identify the bacteria, we used metabarcoding analysis coupled with metabolic predictions and cooccurrence networks. This analysis was performed in the bulk and rhizosphere soils during different stages in the growing season. These soil compartments had a greater effect on the bacterial communities than the plant phenological stages. The diversity and richness of the bacterial population inhabiting the rhizosphere was much lower than that in the bulk soil, comprising taxa that were significantly more represented in this soil compartment, such as bacteria from the genus Hydrogenophaga, three genera from the order Rhizobiales, and unclassified genera from the families Desulfocapsaceae and Actinobacteria. Rhizosphere co-occurrence networks revealed a high number of negative connections, indicating unstable bacterial communities that may be highly influenced by biotic and abiotic factors. Rhizosphere networks mostly rely on two taxa belonging to the phyla Proteobacteria and Cyanobacteria, which are the predicted network hubs in this soil compartment. The bulk soil conserved high bacterial diversity and richness that was stable throughout the growth period of rice. Anaerobic bacteria from genera Marmoricola, the uncultured Gemmatimonadota bacteria SDR1034 terrestrial group, Anaerolinea, and the sulphur oxidizer, Thiobacillus were highly represented. This analysis provides valuable information for understanding bacterial diversity in the rhizosphere of rice cultivated in this region, which is critical for enhancing plant growth and productivity. Corporación Tecnológica de Andalucía (CTA) - BFE14300 Universidad de Sevilla - VI PPIT-US

The exponential growth of the population, the trend towards organic food consumption and the increasingly restrictive regulations imposed by the European Union are forcing the agricultural sector to evolve towards more sustainable practices that are less harmful to the environment. In addition to these challenges, farmers need to cope with other biotic and abiotic factors affecting plant productivity, such as drought, diseases and pests. To that end, biotechnological approaches to obtain food in a sustainable way are being explored. The lower Guadalquivir region, at the South of Spain, contains the largest area devoted to intensive agriculture practices in Andalusia. This region faces two main problems, which are high salinity in irrigation water and N contamination by synthetic fertilizers (Paredes et al., 2020). In this work we provide two different biotechnological approaches to address these problems: 1) We have characterized salt resistance in nine rice varieties that are being cultivated in the Guadalquivir paddies. This analysis has been complemented through morphological, physiological and biochemical approaches, using analytical methods such as HPLC and mass chromatography, among others. We have identified metabolites that are overproduced in salt stress conditions and might be used for the early detection of salt stress in the plant. A comparative analysis of the different rice varieties analysed provided valued information about the different tolerance to salt. 2) In order to reduce the use of synthetic nitrogen fertilizers, we tested three bioinoculants that had been previously isolated from cotton soils. First, we characterized them biochemically for the PGPR activities, comprising N2 fixation and production of plant phytohormones. Effectiveness of these bioinoculants was assayed in microcosms experiments. We found a significant plant growth stimulation in two of the three bioinoculants evaluated.

Motivation: Cyanobacteria of the genus Nostoc are capable of establishing symbiosis relationships with many different types of plants. In these mutualistic relationships the cyanobacterium provides the plant with fixed nitrogen, while the plant provides the cyanobacterium with protection from hostile environments and carbon compounds as energy for N2 fixation. It has recently been described that Nostoc punctiforme performs a stable symbiosis with Oryza sativa (Álvarez et al., 2020). In order to know the molecular mechanisms involved in the recognition between the plant and the cyanobacterium, a proteomic study was carried out in the early stages of co-culture of both organisms. In this study, proteins with homology to the Nod factors of Rhizobium sp. were identified in Nostoc, which could be related to signaling in the plant. The aim of this work is to study the regulation of the expression of the genes encoding these Nod proteins by means of RT-qPCR. Methods: The expression of Nostoc punctiforme Nod genes was studied in response to the presence of the plant at 1, 2, 3, 5 and 7 days of co-culture. On the one hand, a Nostoc punctiforme culture grown at 25°C in Roux flasks with 1% CO2, continuous illumination and at 30°C was prepared. On the other hand, Oryza sativa seedlings were obtained germination of seeds under axenic conditions. At one week of growth, the seedlings were transplanted into flasks with hydroponic medium. Co-culture was performed by adding a fixed amount of Nostoc to the Oryza culture medium, and incubating the mixture in thermostated chambers at 25°C, 12h light/dark cycles and 75% relative humidity. RNA was extracted from Nostoc samples that had been in contact with the plant. As a control, Nostoc incubated without the plant was used. After RNA retrotranscription, the resulting cDNA was used to evaluate the expression of the genes of interest. Results: It was observed that the expression of certain Nod genes is activated in the presence of Oryza, although there are other Nod genes whose expression remains unchanged in response to inoculation with the plant.

Symbiosis between cyanobacteria and plants is considered pivotal for biological nitrogen deposition in terrestrial ecosystems. Despite extensive knowledge of the ecology of plant–cyanobacterium symbioses, little is known about the molecular mechanisms involved in recognition between partners. Here, we conducted a quantitative sequential window acquisition of all theoretical fragment ion spectra mass spectrometry pipeline to analyze protein changes in Oryza sativa and Nostoc punctiforme during early events of symbiosis. We found differentially expressed proteins in both organisms linked to several biological functions, including signal transduction, adhesion, defense-related proteins and cell wall modification. In N. punctiforme we found increased expression of 62 proteins that have been previously described in other Nostoc–plant symbioses, reinforcing the robustness of our study. Our findings reveal new proteins activated in the early stages of the Nostoc–Oryza symbiosis that might be important for the recognition between the plant and the host. Oryza mutants in genes in the common symbiosis signaling pathway (CSSP) show reduced colonization efficiency, providing first insights on the involvement of the CSSP for the accommodation of N. punctiforme inside the plant cells. This information may have long-term implications for a greater understanding of the symbiotic interaction between Nostoc and land plants. Fundación General Consejo Superior de Investigaciones Científicas (Programa ComFuturo) Universidad de Sevilla, Junta de Andalucía y fondos FEDER de la Unión Europea UE)-US–1380747

Trabajo realizado para optar al grado de Doctora en Bioquímica por la Licenciada Consolación älvarez Nuñez, Sevilla 2011, La cisteína es la primera molécula sintetizada en plantas que contiene azufre reducido y ocupa una posición central en el metabolismo debido a sus funciones bioquímicas. Las células de Arabidopsis thaliana contienen diferentes enzimas OAcetilserina( tiol)liasas (OASTL) que catalizan la biosíntesis de cisteína y están localizadas en el citosol, plastidios y mitocondrias, para dar lugar a múltiples conjuntos subcelulares de cisteína. Se ha avanzado mucho en el estudio de las OASTLs más abundantes, sin embargo, hasta ahora, la información sobre las menos abundantes es escasa. En el primer capítulo de esta tesis se establece la reacción enzimática catalizada por la isoforma minoritaria citosólica OASTL CS-LIKE (AT5G28030). Para ello, expresamos esta enzima en bacterias y caracterizamos la proteína recombinante purificada. Nuestros resultados demuestran que CS-LIKE cataliza la desulfuración de L-cisteína a sulfuro, amonio y piruvato. Por tanto, CS-LIKE es una nueva L-Cisteína desulfhidrasa localizada en el citoplasma y hemos propuesto que se designe DES1. El impacto y la funcionalidad de DES1 en el metabolismo de la cisteína se pone de manifiesto por el fenotipo de los mutantes insercionales de T-DNA des1-1 y des1-2. Los resultados obtenidos nos permiten proponer que DES1 es una L-Cisteína desulfhidrasa involucrada en mantener la homeostasis de cisteína en el citosol, principalmente durante los estadíos más tardíos del desarrollo o bajo perturbaciones ambientales. En el segundo capítulo de esta tesis se describe ampliamente el fenotipo de senescencia prematura de los mutantes des1, observándose un incremento de la expresión de los genes asociados a la senescencia, de otros marcadores como vacuolas asociadas a la senescencia (SAV) y una alteración del perfil transcripcional. Además se ha observado en ambos mutantes una clara inducción del proceso de autofagia mediante la acumulación de la proteína ATG8 y fundamentalmente de su forma conjugada. Puesto que la ausencia de DES1 en estos mutantes provoca una reducción en los niveles endógenos de sulfuro, hemos observado que tratamientos con H2S revierten la presencia de vacuolas asociadas a la senescencia, así como la inducción de la autofagia. Esta reversión de la autofagia por sulfuro se observa también en plantas sometidas a limitación por carbono. A nivel transcripcional también observamos que el sulfuro reduce considerablemente la alteración transcripcional de genes que muestra el mutante des1-1 en estadíos de crecimiento tardíos. Por tanto, proponemos que el H2S actúa como una molécula señalizadora que regula negativamente la autofagia y modula el perfil transcripcional en Arabidopsis., En A. thaliana, la mayoría de la cisteína es sintetizada en el citosol por la acción de la isoforma mayoritaria citosólica OAS-A1. Por otra parte, la única cisteína desulfhidrasa citosólica descrita hasta la fecha es DES1. De esta manera DES1 y OASA1 llevan a cabo funciones opuestas para mantener la homeostasis de cisteína en el citosol. En el tercer capítulo de esta tesis se describe el papel de la cisteína en la respuesta inmune de las plantas. Partiendo de la base de que los transcriptomas de los mutantes deficientes en OAS-A1 y DES1 presentaban una alta correlación con la respuesta a distintos estreses bióticos, se estudió la respuesta de ambos mutantes a la infección por distintos patógenos de plantas. Los mutantes des1 son resistentes a patógenos necrótrofos y biotrófos y acumulan ácido salicílico, es decir, se comportan como mutantes SAR (resistencia sistémica adquirida). En cambio, los mutantes oas-a1 son más sensibles a ambos tipos de patógenos y carecen de respuesta hipersensible durante la resistencia inducida por efector (ETI: effector-triggered immunity). Estos resultados muestran que la cisteína podría ser un metabolito crucial durante la interacción planta-patógeno, ya que su desequilibrio en el citosol tiene claras consecuencias en la susceptibilidad de las plantas a patógenos. Puesto que la isoforma citosólica OAS-A1 es la principal enzima OASTL de Arabidopsis, un control eficiente de su actividad es crucial para mantener la homeostasis de cisteína en condiciones de estrés. Tanto el estrés abiótico como biótico conducen a la producción de especies reactivas del oxígeno y nitrógeno, que conducen a la producción de peroxinitrito, un potente agente nitrante que tiene la capacidad de nitrar de forma no estocástica los residuos de tirosina de las proteínas. En el cuarto capítulo de esta tesis hemos demostrado que OAS-A1 sufre un proceso de inactivación producido por la modificación específica del residuo de tirosina 302 mediante nitración, inhibiendo la actividad enzimática de OAS-A1. Esta modificación posttraduccional de OAS-A1 mediante nitración puede representar un rápido y eficiente mecanismo regulatorio para controlar la biosíntesis de cisteína y glutatión en respuesta a distintos factores de estrés.

El creciente consumo energético acusado en las últimas décadas, motivado por el aumento de la población y la progresiva industrialización de los países, es hoy en día principalmente dependiente del crudo, lo que ha provocado el aumento del precio del mismo. Junto con este factor, el hecho de que sea un recurso natural no renovable así como que sea altamente contaminante, ha disparado la búsqueda de fuentes de energías renovables y más sostenibles con el medio ambiente. El etanol como biocarburante se ha posicionado como una de la mejores alternativas frente a la gasolina, siendo de principal interés el etanol de segunda generación por utilizar productos de deshecho tanto agrícolas como urbanos, de manera que no se compite con otros mercados como el de la alimentación. Dicho combustible se obtiene a partir de la fermentación de azúcares provenientes de biomasa lignocelulósica, el mayor componente estructural de las plantas, siendo la fuente de energía renovable más abundante debido a su potencial de ser transformada en glucosa y/u otros azúcares fermentables. Sin embargo en el proceso de obtención de bioetanol de segunda generación ha de ser optimizado para la búsqueda de la rentabilidad del mismo. Uno de los factores de mayor impacto en el coste final del proceso es el cóctel enzimático utilizado para la degradación de la lignocelulosa a azúcar fermentables. Una de las claves para reducir costes es la utilización de enzimas eficaces en este proceso, por lo que desde el sector biotecnológico se trabaja para la mejora de la calidad de las enzimas que lo componen. En este contexto se enmarca el trabajo de esta tesis doctoral en la que se presentan la purificación desde caldo de cultivo industrial y caracterización de las enzimas celulolíticas β-glucosidasa 1, celobiohidrolasa 1, celobiohidrolasa 4 y endoglucanasa 2 del hongo filamentoso Myceliophthora thermophila implicadas en la degradación de biomasa lignocelulósica. Desde distintos ámbitos se han sugerido diferentes enfoques para la mejora de las propiedades de las enzimas celulolíticas. Una manera de reducir la cantidad de enzima requerida es la formulación de cócteles enzimáticos más eficientes específicos para cada tipo de sustrato. La determinación de las enzimas principales y la variación de las proporciones de éstas pueden ayudar a formular cócteles más eficaces en la degradación de materiales lignocelulósicos. En este línea se presenta como segundo bloque de resultados distintas pruebas funcionales de hidrólisis de rastrojo de maíz pretratado con las enzimas purificadas y se demuestra la existencia de una proporción de enzimas, distinta a las presentes en el caldo de cultivo, cuyo rendimiento en hidrólisis es superior. Además se ha confirmado que la suplementación de distintas enzimas con actividad polisacárido monooxigenasa, procedentes del caldo de cultivo de M. thermophila C1, supone una gran mejora del rendimiento en liberación de glucosa de en la hidrólisis del rastrojo de maíz pretratado. En el segundo bloque de trabajo de esta tesis doctoral se presenta la mejora de la hidrólisis de hemicelulosa del rastrojo de maíz pretratado. Aproximadamente el 70% de la hemicelulosa está compuesta por polímeros de xilano, siendo por tanto la xilosa el monosacárido más abundante en la lignocelulosa tras la glucosa. En el proceso de obtención de bioetanol de segunda generación el aprovechamiento de la xilosa para la conversión a etanol es fundamental para el rendimiento global del proceso. Se ha demostrado que la cepa industrial de M. thermophila C1 es deficitaria en enzimas con actividad β-xilosidasa que hidrolicen los dímeros de xilosa. Para subsanar este cuello de botella se presenta el escrutinio de enzimas con actividad β-xilosidasa de hongos celulolíticos y la posterior expresión en M. thermophila C1 para la mejorar de la hidrólisis de la hemicelulosa.