Il ?-NGF (Nerve Growth Factor) è un fattore neurotrofico derivante da una pro-proteina, il proNGF. Quest'ultima esiste in quattro differenti varianti di splicing tra le quali le isoforme proNGF-A e proNGF-B si sono rivelate biologicamente attive. Negli ultimi anni sono state prodotte evidenze sperimentali circa la possibilità che le isoforme A e B possano avere attività biologica diversa, rispettivamente neurotrofica e neurotossica. Questi risultati tuttavia non hanno ancora avuto un ampio riscontro in letteratura, a causa della difficoltà oggettiva che esiste sia nel produrre in maniera selettiva, attraverso sistemi di espressione eterologhi, le due diverse varianti proteiche, sia nel discriminare la loro presenza all'interno di campioni biologici. Infatti, le due proteine condividono la gran parte della sequenza amminoacidica primaria, cosa che rende difficile la produzione di anticorpi specifici; inoltre, nei sistemi di sovra-espressione, contrariamente a quanto si osserva in vivo per le proteine native, è difficile prevenire la conversione del proNGF-A in proNGF-B. In questo elaborato abbiamo voluto studiare in maniera approfondita la sequenza primaria del proNGF-A con lo scopo di progettare, tramite l'utilizzo di software bioinformatici basati su algoritmi denominati reti neurali artificiali (ANN), delle mutazioni che consentissero di produrre, attraverso sistemi di sovra-espressione eucariotici, un'isoforma di proNGF-A integra ed utilizzabile in futuro per studiare selettivamente l'attività di questa variante proteica di proNGF. Attraverso l'approccio bioinformatico, seguito dalla costruzione di vettori plasmidici e dalla loro espressione in un sistema di espressione eucariotico, siamo riusciti inizialmente a generare un proNGF-A resistente all'azione delle pro-convertasi endocellulari che determinano la sua conversione in ?-NGF. Successivamente, grazie alla sostituzione specifica e mai descritta precedentemente di un'alanina in una tirosina in posizione 73, siamo riusciti a generare un proNGF-A che non venisse più convertito in proNGF-B. Questo proNGF mutante è stato denominato proNGF-A_A73Y. Attraverso l'analisi di lisati e mezzi cellulari provenienti da cellule HeLa sovra-esprimenti l'isoforma mutante abbiamo caratterizzato il profilo di espressione della proteina, e confermato la sua capacità di resistere ai diversi processi di conversione in intermedi a peso molecolare più basso. Infine, abbiamo messo a punto con successo una procedura di sovra-espressione, grazie al sistema baculovirus/sf9, ed un successivo protocollo di purificazione che ci ha consentito di isolare la proteina mutante. Il lavoro esposto in questo elaborato ha permesso di ottenere per la prima volta quantità consistenti della variante proteica proNGF-A, che potrà essere infine utilizzata per studi di farmacologia e fisiopatologia. In particolare, sarà possibile, alla luce di quanto precedentemente emerso studiando forme native della proteina, chiarire con maggior rigore gli effetti neuro-protettivi del proNGF-A, comparandoli a quelli noti del ?-NGF. Inoltre, sarà possibile studiare determinate peculiarità della proteina, emerse come indizi in analisi precedenti, che potrebbero rendere vantaggioso il suo utilizzo per sviluppare farmaci alternativi a quelli basati sull'isoforma matura.