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[ES] El potasio es un catión monovalente clave en múltiples aspectos del crecimiento y de la supervivencia celular, como la compensación de cargas negativas de las macromoléculas, el mantenimiento del volumen celular y la turgencia, la actividad enzimática, la síntesis de proteínas, el mantenimiento del potencial de membrana y el control de pH intracelular. En las plantas, además de las funciones fisiológicas básicas a nivel celular mencionadas, este catión está implicado en un importante proceso fisiológico, el control de la apertura estomática. A través del estoma la planta controla la transpiración y el intercambio de gases, además de ser una vía de entrada para patógenos. Los canales de entrada de potasio (Kin) regulan la entrada de este ion en las células oclusivas y participan en el control de la apertura estomática. KAT1 y su ortólogo KAT2 son los principales canales de entrada de potasio localizados en la membrana plasmática de las células oclusivas, las cuales forman el poro estomático. La identificación y caracterización funcional de reguladores de canales de potasio es una aproximación prometedora de cara a mejorar la tolerancia a sequía, así como la susceptibilidad a patógenos. En el presente proyecto caracterizamos la función de MEE31 y la interacción entre MEE31 y KAT1. MEE31 es una proteína que surgió como posible interactor de KAT1 en un rastreo Split-Ubiquitin realizado en nuestro laboratorio. Para ello se realizaron estudios de complementación funcional en distintos fondos mutantes de S. cerevisiae. Adicionalmente, se realizaron ensayos de interacción proteína-proteína y estudios de localización celular en plantas modelo. Además se presenta un análisis de los estudios previos de la función de MEE31 con el objetivo de desarrollar hipótesis contrastables sobre los posibles roles de MEE31 como regulador de KAT1., [EN] Potassium is a key monovalent cation in multiple aspects of cell growth and survival, such as the compensation of negatives charges of macromolecules, maintenance of cell volume and turgor, enzymatic activity, protein synthesis, maintenance of membrane potential and intracellular pH control. In plants, in addition to the basic physiological functions mentioned at the cellular level, this cation is involved in an important physiological process, the control of stomatal opening. Through the stomata the plant controls transpiration and gas exchange, in addition to being a path of entry for pathogens. The inward rectifying potassium channels (Kin) regulate the entry of this ion into the guard cells thus participate in the control of stomatal opening. KAT1, and its orthologue KAT2, are the main inward rectifying channels located in the plasma membrane of the guard cells that form the stomatal pore, where they form homo- or heterotetrameric type channels. The identification and functional characterization of potassium channel regulators is a promising approach to improve drought tolerance, as well as susceptibility to pathogens. In the present project, we functionally characterized the function and interaction between MEE31 and KAT1. MEE31 is a protein that emerged as a possible KAT1 interactor in a Split-Ubiquitin screen carried out in our laboratory. For this, functional complementation studies were carried out in different S. cerevisiae mutant backgrounds. In addition, we performed protein-protein interaction assays and cell localization studies in a plant model. We also present an analysis of the prior studies of MEE31 function in order to develop testable hypotheses about the possible roles of MEE31 as a KAT1 regulator.

[ES] El potasio es un catión monovalente clave en múltiples aspectos del crecimiento y de la supervivencia celular, como la compensación de cargas negativas de las macromoléculas, el mantenimiento del volumen celular y la turgencia, la actividad enzimática, la síntesis de proteínas, el mantenimiento del potencial de membrana y el control de pH intracelular. En las plantas, además de las funciones fisiológicas básicas a nivel celular mencionadas, este catión está implicado en un importante proceso fisiológico, el control de la apertura estomática. A través del estoma la planta controla la transpiración y el intercambio de gases, además de ser una vía de entrada para patógenos. Los canales de entrada de potasio (Kin) regulan la entrada de este ion en las células oclusivas y participan en el control de la apertura estomática. KAT1 y su ortólogo KAT2 son los principales canales de entrada de potasio localizados en la membrana plasmática de las células oclusivas, las cuales forman el poro estomático. La identificación y caracterización funcional de reguladores de canales de potasio es una aproximación prometedora de cara a mejorar la tolerancia a sequía, así como la susceptibilidad a patógenos. En el presente proyecto caracterizamos la función de MEE31 y la interacción entre MEE31 y KAT1. MEE31 es una proteína que surgió como posible interactor de KAT1 en un rastreo Split-Ubiquitin realizado en nuestro laboratorio. Para ello se realizaron estudios de complementación funcional en distintos fondos mutantes de S. cerevisiae. Adicionalmente, se realizaron ensayos de interacción proteína-proteína y estudios de localización celular en plantas modelo. Además se presenta un análisis de los estudios previos de la función de MEE31 con el objetivo de desarrollar hipótesis contrastables sobre los posibles roles de MEE31 como regulador de KAT1., [EN] Potassium is a key monovalent cation in multiple aspects of cell growth and survival, such as the compensation of negatives charges of macromolecules, maintenance of cell volume and turgor, enzymatic activity, protein synthesis, maintenance of membrane potential and intracellular pH control. In plants, in addition to the basic physiological functions mentioned at the cellular level, this cation is involved in an important physiological process, the control of stomatal opening. Through the stomata the plant controls transpiration and gas exchange, in addition to being a path of entry for pathogens. The inward rectifying potassium channels (Kin) regulate the entry of this ion into the guard cells thus participate in the control of stomatal opening. KAT1, and its orthologue KAT2, are the main inward rectifying channels located in the plasma membrane of the guard cells that form the stomatal pore, where they form homo- or heterotetrameric type channels. The identification and functional characterization of potassium channel regulators is a promising approach to improve drought tolerance, as well as susceptibility to pathogens. In the present project, we functionally characterized the function and interaction between MEE31 and KAT1. MEE31 is a protein that emerged as a possible KAT1 interactor in a Split-Ubiquitin screen carried out in our laboratory. For this, functional complementation studies were carried out in different S. cerevisiae mutant backgrounds. In addition, we performed protein-protein interaction assays and cell localization studies in a plant model. We also present an analysis of the prior studies of MEE31 function in order to develop testable hypotheses about the possible roles of MEE31 as a KAT1 regulator.

[ES] El correcto funcionamiento de cualquier organismo requiere el mantenimiento de la homeostasis iónica, un proceso dinámico esencial que debe garantizar la presencia de iones a niveles adecuados, evitando su acumulación. Para ello, las células han desarrollado sistemas altamente eficientes que se encargan de captar y almacenar estos elementos, así como de permitir respuestas rápidas frente a posibles cambios ambientales. El potasio es el catión más abundante en las plantas, siendo también un nutriente esencial para estas. Tal es su importancia que juega un papel clave en funciones como la síntesis proteica, la activación enzimática o la turgencia celular. En relación con esta última, el flujo de potasio a través de las membranas de las células oclusivas regula su turgencia y, con ello, también la apertura o cierre estomáticos. Es a través de estas estructuras celulares, los estomas, que la célula es capaz de realizar tanto el intercambio gaseoso como la transpiración. La entrada de potasio en las células oclusivas viene regulada por distintos canales de entrada de potasio, entre estos se encuentra la familia Shaker de canales dependientes de voltaje. Pertenecientes a esta familia, en la membrana de las células oclusivas, se encuentran los principales responsables de dicha entrada de potasio: KAT1 y su homólogo KAT2. Dada su implicación directa en la apertura estomática, estos canales ganan importancia frente a un posible estrés abiótico como la sequía. En estudios previos, nuestro grupo identificó diferentes proteínas de Arabidopsis thaliana capaces de interaccionar con KAT1 mediante un rastreo basado en el sistema Split-Ubiquitina. Una de las proteínas identificadas fue BAG4, miembro de la familia BAG, que se caracteriza por un dominio BAG conservado cerca de la región C-terminal de sus proteínas. Este dominio interacciona directamente con una clase de las proteínas de choque térmico Hsp70, regulando así su actividad. En base a la función de sus homólogos en mam, [EN] The correct functioning of any type of organism requires the maintenance of ionic homeostasis. This is an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at The correct functioning of any organism requires the maintenance of ionic homeostasis, an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at adequate levels, preventing them from accumulating. To this end, cells have developed highly efficient systems that capture and store these elements, as well as allowing rapid responses to possible environmental changes. Potassium is the most abundant cation in plants, and is also an essential nutrient for them. This cation plays a key role in functions such as protein synthesis, enzyme activation or cell turgor. In relation to the latter, the flow of potassium through the membranes of the guard cells regulates their turgidity and, therefore, the opening or closing of the stomata. It is through these pore structures, the stomata, that the cell is able to perform both gas exchange and transpiration. The entry of potassium into the guard cells is regulated by different potassium entry channels, including the Shaker family of voltage-dependent channels. KAT1 and its close homologue KAT2 are Shaker family channels highly expressed in the guard cell membrane, that play a major role in potassium uptake in this cell type. Given their direct involvement in the stomatal opening, the regulation of the activity of these channels is crucial for the response to abiotic stresses such as drought. In previous studies, our group identified different proteins capable of interacting with KAT1 using a Split-ubiquitin screening in yeast. One of the identified proteins was BAG4, a member of the BAG family, which is characterized by a common BAG domain near the C-terminal region of these proteins. This characteristic domain interacts directly with the Heat Shock 70 (Hsp70) proteins, thus regulating their activity. Based on the role of their mammalian c

[ES] El correcto funcionamiento de cualquier organismo requiere el mantenimiento de la homeostasis iónica, un proceso dinámico esencial que debe garantizar la presencia de iones a niveles adecuados, evitando su acumulación. Para ello, las células han desarrollado sistemas altamente eficientes que se encargan de captar y almacenar estos elementos, así como de permitir respuestas rápidas frente a posibles cambios ambientales. El potasio es el catión más abundante en las plantas, siendo también un nutriente esencial para estas. Tal es su importancia que juega un papel clave en funciones como la síntesis proteica, la activación enzimática o la turgencia celular. En relación con esta última, el flujo de potasio a través de las membranas de las células oclusivas regula su turgencia y, con ello, también la apertura o cierre estomáticos. Es a través de estas estructuras celulares, los estomas, que la célula es capaz de realizar tanto el intercambio gaseoso como la transpiración. La entrada de potasio en las células oclusivas viene regulada por distintos canales de entrada de potasio, entre estos se encuentra la familia Shaker de canales dependientes de voltaje. Pertenecientes a esta familia, en la membrana de las células oclusivas, se encuentran los principales responsables de dicha entrada de potasio: KAT1 y su homólogo KAT2. Dada su implicación directa en la apertura estomática, estos canales ganan importancia frente a un posible estrés abiótico como la sequía. En estudios previos, nuestro grupo identificó diferentes proteínas de Arabidopsis thaliana capaces de interaccionar con KAT1 mediante un rastreo basado en el sistema Split-Ubiquitina. Una de las proteínas identificadas fue BAG4, miembro de la familia BAG, que se caracteriza por un dominio BAG conservado cerca de la región C-terminal de sus proteínas. Este dominio interacciona directamente con una clase de las proteínas de choque térmico Hsp70, regulando así su actividad. En base a la función de sus homólogos en mam, [EN] The correct functioning of any type of organism requires the maintenance of ionic homeostasis. This is an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at The correct functioning of any organism requires the maintenance of ionic homeostasis, an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at adequate levels, preventing them from accumulating. To this end, cells have developed highly efficient systems that capture and store these elements, as well as allowing rapid responses to possible environmental changes. Potassium is the most abundant cation in plants, and is also an essential nutrient for them. This cation plays a key role in functions such as protein synthesis, enzyme activation or cell turgor. In relation to the latter, the flow of potassium through the membranes of the guard cells regulates their turgidity and, therefore, the opening or closing of the stomata. It is through these pore structures, the stomata, that the cell is able to perform both gas exchange and transpiration. The entry of potassium into the guard cells is regulated by different potassium entry channels, including the Shaker family of voltage-dependent channels. KAT1 and its close homologue KAT2 are Shaker family channels highly expressed in the guard cell membrane, that play a major role in potassium uptake in this cell type. Given their direct involvement in the stomatal opening, the regulation of the activity of these channels is crucial for the response to abiotic stresses such as drought. In previous studies, our group identified different proteins capable of interacting with KAT1 using a Split-ubiquitin screening in yeast. One of the identified proteins was BAG4, a member of the BAG family, which is characterized by a common BAG domain near the C-terminal region of these proteins. This characteristic domain interacts directly with the Heat Shock 70 (Hsp70) proteins, thus regulating their activity. Based on the role of their mammalian c

[ES] El correcto funcionamiento de cualquier organismo requiere el mantenimiento de la homeostasis iónica, un proceso dinámico esencial que debe garantizar la presencia de iones a niveles adecuados, evitando su acumulación. Para ello, las células han desarrollado sistemas altamente eficientes que se encargan de captar y almacenar estos elementos, así como de permitir respuestas rápidas frente a posibles cambios ambientales. El potasio es el catión más abundante en las plantas, siendo también un nutriente esencial para estas. Tal es su importancia que juega un papel clave en funciones como la síntesis proteica, la activación enzimática o la turgencia celular. En relación con esta última, el flujo de potasio a través de las membranas de las células oclusivas regula su turgencia y, con ello, también la apertura o cierre estomáticos. Es a través de estas estructuras celulares, los estomas, que la célula es capaz de realizar tanto el intercambio gaseoso como la transpiración. La entrada de potasio en las células oclusivas viene regulada por distintos canales de entrada de potasio, entre estos se encuentra la familia Shaker de canales dependientes de voltaje. Pertenecientes a esta familia, en la membrana de las células oclusivas, se encuentran los principales responsables de dicha entrada de potasio: KAT1 y su homólogo KAT2. Dada su implicación directa en la apertura estomática, estos canales ganan importancia frente a un posible estrés abiótico como la sequía. En estudios previos, nuestro grupo identificó diferentes proteínas de Arabidopsis thaliana capaces de interaccionar con KAT1 mediante un rastreo basado en el sistema Split-Ubiquitina. Una de las proteínas identificadas fue BAG4, miembro de la familia BAG, que se caracteriza por un dominio BAG conservado cerca de la región C-terminal de sus proteínas. Este dominio interacciona directamente con una clase de las proteínas de choque térmico Hsp70, regulando así su actividad. En base a la función de sus homólogos en mam, [EN] The correct functioning of any type of organism requires the maintenance of ionic homeostasis. This is an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at The correct functioning of any organism requires the maintenance of ionic homeostasis, an essential, dynamic process that must guarantee the presence of ions at adequate levels, preventing them from accumulating. To this end, cells have developed highly efficient systems that capture and store these elements, as well as allowing rapid responses to possible environmental changes. Potassium is the most abundant cation in plants, and is also an essential nutrient for them. This cation plays a key role in functions such as protein synthesis, enzyme activation or cell turgor. In relation to the latter, the flow of potassium through the membranes of the guard cells regulates their turgidity and, therefore, the opening or closing of the stomata. It is through these pore structures, the stomata, that the cell is able to perform both gas exchange and transpiration. The entry of potassium into the guard cells is regulated by different potassium entry channels, including the Shaker family of voltage-dependent channels. KAT1 and its close homologue KAT2 are Shaker family channels highly expressed in the guard cell membrane, that play a major role in potassium uptake in this cell type. Given their direct involvement in the stomatal opening, the regulation of the activity of these channels is crucial for the response to abiotic stresses such as drought. In previous studies, our group identified different proteins capable of interacting with KAT1 using a Split-ubiquitin screening in yeast. One of the identified proteins was BAG4, a member of the BAG family, which is characterized by a common BAG domain near the C-terminal region of these proteins. This characteristic domain interacts directly with the Heat Shock 70 (Hsp70) proteins, thus regulating their activity. Based on the role of their mammalian c

[ES] La homeostasis del ion potasio es clave para la supervivencia y el crecimiento de los seres vivos. El flujo de entrada de este ion en la célula está regulado por unos canales localizados en su membrana plasmática. Dada la gran importancia de su correcto funcionamiento estos transportadores se encuentran altamente regulados. En este proyecto nos hemos centrado en dos canales de potasio prototipo: el canal rectificador de entrada KAT1 de Arabidopsis thaliana y el trasportador de alta afinidad de potasio de Saccharomyces cerevisiae Trk1. El canal rectificador de entrada KAT1 pertenece a la familia Shaker y participa en la apertura y el cierre de estomas. Por esta razón su regulación es fundamental para la resistencia de la planta al estrés hídrico. En estudios anteriores utilizando el ensayo de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin nuestro grupo identificó 18 genes de A. thaliana cuyas proteínas interaccionan físicamente con KAT1. Sin embargo, para confirmar la especificidad de estas interacciones son necesarios más análisis. Con este objetivo, el fin de este trabajo consistió en detectar entre estos 18 interactores posibles falsos positivos. Los falsos positivos pueden aparecer cuando las proteínas bait y las prey se acumulan en compartimentos intracelulares dando lugar a la activación inespecífica del sistema. Por ello, los análisis realizados para su detección consistieron en repetir el análisis de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin con las 18 proteínas candidatas utilizando la subunidad gamma del complejo oligosacariltransferasa de levadura, Ost3, como proteína bait. Con este ensayo se identificaron como falsos positivos tres de las proteínas candidatas debido a su interacción con la proteína Ost3, la cual no está relacionada con ellas. Éstas fueron descartadas para futuros análisis. Pero, lo que es más importante, se confirmó la especificidad con KAT1 de 13 de ellas. Con éstas se llevarán a cabo futuros ensayos en planta para determinar si, [EN] Potassium homeostasis is crucial for survival and development of essentially all living organisms. Inward fluxes of this ion are mediated by channels located in the plasma membrane. Due to the importance of the correct operation of these transporters, they are highly regulated. In this project, we have focused on two prototypic potassium channels: the rectifying inward cannel KAT1 from Arabidopsis thaliana and the Trk1 high affinity potassium transporter from Saccharomyces cerevisiae. The inward rectifying channel, KAT1 belongs to the Shaker family and its activity participates in stomatal opening and closing. For this reason its regulation is proposed to be fundamental for plant drought resistance. In previous studies using the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay, our group has identified 18 A. thaliana genes whose proteins interact physically with KAT1. However, in order to confirm the specificity of these interactions it is necessary to carry out further analyses. To this end, in this project our aim was to identify possible false positives among the 18 clones we identified. False positives may arise in cases where the prey and bait proteins artifactually accumulate in intracellular compartments leading to non-specific activation of the system. The analysis presented here consisted of repeating Split-Ubiquitin protein-protein interaction analysis with the 18 candidate clones using the gamma subunit of the yeast oligosaccharyltransferase complex, Ost3 as the bait protein. Three candidate proteins that interact with the unrelated Ost3 bait protein were identified as false positives and will be discarded from future analyses. But, more importantly, the specificity of 13 was confirmed. These proteins will be the subject of further studies in plants to determine if they are bona fide KAT1 regulators. In addition, we aimed to generate tools to apply the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay to the Trk1 yeast potassium transporter and the

[ES] La homeostasis del ion potasio es clave para la supervivencia y el crecimiento de los seres vivos. El flujo de entrada de este ion en la célula está regulado por unos canales localizados en su membrana plasmática. Dada la gran importancia de su correcto funcionamiento estos transportadores se encuentran altamente regulados. En este proyecto nos hemos centrado en dos canales de potasio prototipo: el canal rectificador de entrada KAT1 de Arabidopsis thaliana y el trasportador de alta afinidad de potasio de Saccharomyces cerevisiae Trk1. El canal rectificador de entrada KAT1 pertenece a la familia Shaker y participa en la apertura y el cierre de estomas. Por esta razón su regulación es fundamental para la resistencia de la planta al estrés hídrico. En estudios anteriores utilizando el ensayo de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin nuestro grupo identificó 18 genes de A. thaliana cuyas proteínas interaccionan físicamente con KAT1. Sin embargo, para confirmar la especificidad de estas interacciones son necesarios más análisis. Con este objetivo, el fin de este trabajo consistió en detectar entre estos 18 interactores posibles falsos positivos. Los falsos positivos pueden aparecer cuando las proteínas bait y las prey se acumulan en compartimentos intracelulares dando lugar a la activación inespecífica del sistema. Por ello, los análisis realizados para su detección consistieron en repetir el análisis de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin con las 18 proteínas candidatas utilizando la subunidad gamma del complejo oligosacariltransferasa de levadura, Ost3, como proteína bait. Con este ensayo se identificaron como falsos positivos tres de las proteínas candidatas debido a su interacción con la proteína Ost3, la cual no está relacionada con ellas. Éstas fueron descartadas para futuros análisis. Pero, lo que es más importante, se confirmó la especificidad con KAT1 de 13 de ellas. Con éstas se llevarán a cabo futuros ensayos en planta para determinar si, [EN] Potassium homeostasis is crucial for survival and development of essentially all living organisms. Inward fluxes of this ion are mediated by channels located in the plasma membrane. Due to the importance of the correct operation of these transporters, they are highly regulated. In this project, we have focused on two prototypic potassium channels: the rectifying inward cannel KAT1 from Arabidopsis thaliana and the Trk1 high affinity potassium transporter from Saccharomyces cerevisiae. The inward rectifying channel, KAT1 belongs to the Shaker family and its activity participates in stomatal opening and closing. For this reason its regulation is proposed to be fundamental for plant drought resistance. In previous studies using the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay, our group has identified 18 A. thaliana genes whose proteins interact physically with KAT1. However, in order to confirm the specificity of these interactions it is necessary to carry out further analyses. To this end, in this project our aim was to identify possible false positives among the 18 clones we identified. False positives may arise in cases where the prey and bait proteins artifactually accumulate in intracellular compartments leading to non-specific activation of the system. The analysis presented here consisted of repeating Split-Ubiquitin protein-protein interaction analysis with the 18 candidate clones using the gamma subunit of the yeast oligosaccharyltransferase complex, Ost3 as the bait protein. Three candidate proteins that interact with the unrelated Ost3 bait protein were identified as false positives and will be discarded from future analyses. But, more importantly, the specificity of 13 was confirmed. These proteins will be the subject of further studies in plants to determine if they are bona fide KAT1 regulators. In addition, we aimed to generate tools to apply the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay to the Trk1 yeast potassium transporter and the

[ES] La homeostasis del ion potasio es clave para la supervivencia y el crecimiento de los seres vivos. El flujo de entrada de este ion en la célula está regulado por unos canales localizados en su membrana plasmática. Dada la gran importancia de su correcto funcionamiento estos transportadores se encuentran altamente regulados. En este proyecto nos hemos centrado en dos canales de potasio prototipo: el canal rectificador de entrada KAT1 de Arabidopsis thaliana y el trasportador de alta afinidad de potasio de Saccharomyces cerevisiae Trk1. El canal rectificador de entrada KAT1 pertenece a la familia Shaker y participa en la apertura y el cierre de estomas. Por esta razón su regulación es fundamental para la resistencia de la planta al estrés hídrico. En estudios anteriores utilizando el ensayo de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin nuestro grupo identificó 18 genes de A. thaliana cuyas proteínas interaccionan físicamente con KAT1. Sin embargo, para confirmar la especificidad de estas interacciones son necesarios más análisis. Con este objetivo, el fin de este trabajo consistió en detectar entre estos 18 interactores posibles falsos positivos. Los falsos positivos pueden aparecer cuando las proteínas bait y las prey se acumulan en compartimentos intracelulares dando lugar a la activación inespecífica del sistema. Por ello, los análisis realizados para su detección consistieron en repetir el análisis de interacción proteína-proteína Split-Ubiquitin con las 18 proteínas candidatas utilizando la subunidad gamma del complejo oligosacariltransferasa de levadura, Ost3, como proteína bait. Con este ensayo se identificaron como falsos positivos tres de las proteínas candidatas debido a su interacción con la proteína Ost3, la cual no está relacionada con ellas. Éstas fueron descartadas para futuros análisis. Pero, lo que es más importante, se confirmó la especificidad con KAT1 de 13 de ellas. Con éstas se llevarán a cabo futuros ensayos en planta para determinar si, [EN] Potassium homeostasis is crucial for survival and development of essentially all living organisms. Inward fluxes of this ion are mediated by channels located in the plasma membrane. Due to the importance of the correct operation of these transporters, they are highly regulated. In this project, we have focused on two prototypic potassium channels: the rectifying inward cannel KAT1 from Arabidopsis thaliana and the Trk1 high affinity potassium transporter from Saccharomyces cerevisiae. The inward rectifying channel, KAT1 belongs to the Shaker family and its activity participates in stomatal opening and closing. For this reason its regulation is proposed to be fundamental for plant drought resistance. In previous studies using the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay, our group has identified 18 A. thaliana genes whose proteins interact physically with KAT1. However, in order to confirm the specificity of these interactions it is necessary to carry out further analyses. To this end, in this project our aim was to identify possible false positives among the 18 clones we identified. False positives may arise in cases where the prey and bait proteins artifactually accumulate in intracellular compartments leading to non-specific activation of the system. The analysis presented here consisted of repeating Split-Ubiquitin protein-protein interaction analysis with the 18 candidate clones using the gamma subunit of the yeast oligosaccharyltransferase complex, Ost3 as the bait protein. Three candidate proteins that interact with the unrelated Ost3 bait protein were identified as false positives and will be discarded from future analyses. But, more importantly, the specificity of 13 was confirmed. These proteins will be the subject of further studies in plants to determine if they are bona fide KAT1 regulators. In addition, we aimed to generate tools to apply the Split-Ubiquitin protein-protein interaction assay to the Trk1 yeast potassium transporter and the