Search

Las cardiolipinas (CL) son fosfolípidos localizados exclusivamente en las mitocondrias, imprescindibles para el correcto funcionamiento mitocondrial. En condiciones de homeostasis, las CL se localizan en la membrana mitocondrial interna (MMI), pero ante condiciones de estrés son externalizadas hacia la membrana mitocondrial externa (MME), donde tienen un papel esencial en el ensamblaje del inflamasoma y, por tanto, en la generación de una respuesta inflamatoria. La lipina-2 es una enzima del metabolismo lipídico, mutaciones en el gen que la codifica en humanos, produce un síndrome autoinflamatorio conocido como Síndrome de Majeed. Resultados previos del grupo demuestran que los macrófagos Lpin2-/- presentan niveles elevados de CL, junto con un fenotipo proinflamatorio exacerbado y una mayor actividad de la vía glucolítica. Utilizando macrófagos inmortalizados derivados de médula ósea de ratones wt y Lpin2-/-, nos propusimos estudiar la expresión de las enzimas de síntesis, remodelación y degradación de CL, el efecto del silenciamiento de siCrls1 y las posibles diferencias en la externalización de CL entre ambos genotipos. Los resultados indican que los iBMdM Lpin2-/- presentan una mayor expresión de las enzimas de síntesis de CL, junto con una mayor externalización de CL. El silenciamiento de Crls1 reduce la inflamación en células carentes de lipina-2, aunque no se aprecian indicios de reversión de la sobrexpresión de genes relacionados con el metabolismo glucídico en estas condiciones. Estos resultados, permiten plantear nuevos estudios donde la CL sea una diana molecular que modular para paliar los síntomas del síndrome de Majeed., Departamento de Biología Celular, Histología y Farmacología, Máster en Investigación Biomédica y Terapias Avanzadas

For years, it was considered that the most important function of mitochondria was to provide the cell with energy in the form of ATP or even to function as a buffer of the cytosolic calcium concentration. However, it has been shown that mitochondria are a key part of signaling cascades or either, they establish shared functions with intra- and extracellular structures, allowing to maintain homeostasis and cell function. In addition, there are several reports showing that healthy cells are capable of transferring mitochondria to the bloodstream or to damaged cells with the aim of providing protection or to improve their bioenergetic condition under specific conditions. The signaling mechanisms for the recognition of marker molecules are decisive to establish the transfer of mitochondria between cells through vesicular structures or tunnels (TNT), among other systems. Currently, it has been developed strategies for mitochondrial isolation, which in turn, are injected into the tissues allowing their functional recovery, opening the door to what has been called “mitochondrial medicine” or “mitocure”. Although these findings suggest that mitochondria could be a new prophylactic method for diseases or metabolic disorders, it is also necessary to analyze mitochondrial transfer may not always be positive for the organism in certain ailments., Durante años se consideró que la función más importante de las mitocondrias era la de proveer a la célula de energía en forma de ATP o incluso, fungir como amortiguadores de la concentración del calcio citosólico. Sin embargo, se ha demostrado que las mitocondrias tienen más atributos al ser una parte medular de las cascadas de señalización, y de compartir funciones con las estructuras intra y extracelulares que permiten mantener la homeostasis y la función celular. Además, hay reportes que muestran que las células sanas pueden transferir a las mitocondrias por el torrente circulatorio o directamente a las células dañadas con el objetivo de brindarles protección y mejorar su función bioenergética en condiciones específicas. Los mecanismos de señalización para el reconocimiento de moléculas marcadoras son determinantes para establecer la transferencia de las mitocondrias entre células y a través de las estructuras vesiculares o de los túneles (TNT), entre otros sistemas. Actualmente, se han desarrollado estrategias para el aislamiento de las mitocondrias, las cuales, a su vez, se inyectan en los tejidos permitiéndoles su recuperación funcional, a lo que se ha llamado la “medicina mitocondrial” o la “mitocuración”. Aunque estos hallazgos sugieren que las mitocondrias podrían ser un nuevo método de profilaxis para las enfermedades o trastornos metabólicos, es necesario considerar que la transferencia mitocondrial no es del todo una solución positiva en el tratamiento de algunos padecimientos.

For years, it was considered that the most important function of mitochondria was to provide the cell with energy in the form of ATP or even to function as a buffer of the cytosolic calcium concentration. However, it has been shown that mitochondria are a key part of signaling cascades or either, they establish shared functions with intra- and extracellular structures, allowing to maintain homeostasis and cell function. In addition, there are several reports showing that healthy cells are capable of transferring mitochondria to the bloodstream or to damaged cells with the aim of providing protection or to improve their bioenergetic condition under specific conditions. The signaling mechanisms for the recognition of marker molecules are decisive to establish the transfer of mitochondria between cells through vesicular structures or tunnels (TNT), among other systems. Currently, it has been developed strategies for mitochondrial isolation, which in turn, are injected into the tissues allowing their functional recovery, opening the door to what has been called “mitochondrial medicine” or “mitocure”. Although these findings suggest that mitochondria could be a new prophylactic method for diseases or metabolic disorders, it is also necessary to analyze mitochondrial transfer may not always be positive for the organism in certain ailments., Durante años se consideró que la función más importante de las mitocondrias era la de proveer a la célula de energía en forma de ATP o incluso, fungir como amortiguadores de la concentración del calcio citosólico. Sin embargo, se ha demostrado que las mitocondrias tienen más atributos al ser una parte medular de las cascadas de señalización, y de compartir funciones con las estructuras intra y extracelulares que permiten mantener la homeostasis y la función celular. Además, hay reportes que muestran que las células sanas pueden transferir a las mitocondrias por el torrente circulatorio o directamente a las células dañadas con el objetivo de brindarles protección y mejorar su función bioenergética en condiciones específicas. Los mecanismos de señalización para el reconocimiento de moléculas marcadoras son determinantes para establecer la transferencia de las mitocondrias entre células y a través de las estructuras vesiculares o de los túneles (TNT), entre otros sistemas. Actualmente, se han desarrollado estrategias para el aislamiento de las mitocondrias, las cuales, a su vez, se inyectan en los tejidos permitiéndoles su recuperación funcional, a lo que se ha llamado la “medicina mitocondrial” o la “mitocuración”. Aunque estos hallazgos sugieren que las mitocondrias podrían ser un nuevo método de profilaxis para las enfermedades o trastornos metabólicos, es necesario considerar que la transferencia mitocondrial no es del todo una solución positiva en el tratamiento de algunos padecimientos.

Las enfermedades raras (ER), definidas en Europa como aquellas que afectan a menos de 1 por cada 2000 personas, son generalmente enfermedades crónicas, graves e invalidantes. Además, analizadas conjuntamente, llegan a afectar al 6.2% de la población. A pesar de su repercusión global, las empresas biotecnológicas y farmacéuticas no encuentran atractiva la investigación en ellas, de ahí que se llamen “enfermedades huérfanas”. Uno de los principales problemas que enfrentan en la actualidad es el retraso en el diagnóstico, lo que lleva en muchas ocasiones a un manejo inicial incorrecto que agrava aún más su curso clínico. Para poder avanzar en el conocimiento científico de estas enfermedades es imprescindible el intercambio de información entre centros especializados de diferentes países, con el fin de crear bases de datos comunes y accesibles para la comunidad científica. Así surge Solve-RD, la primera colaboración internacional en Europa para mejorar el diagnóstico de las ER. Las enfermedades mitocondriales (EM) son ER multisistémicas y clínicamente heterogéneas caracterizadas por disfunción mitocondrial, cuya genética se caracteriza por poseer características especiales. En los últimos años, se ha producido un cambio paradigmático en su enfoque diagnóstico, en el que el estudio genético ha pasado a ser una prueba esencial y asequible gracias al desarrollo de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). Dada su trascendencia y la falta de información recopilada en un mismo trabajo sobre ellas, este TFG pretende hacer una revisión bibliográfica para definir el estado de conocimiento actual sobre las EM., Grado en Medicina

Las enfermedades raras (ER), definidas en Europa como aquellas que afectan a menos de 1 por cada 2000 personas, son generalmente enfermedades crónicas, graves e invalidantes. Además, analizadas conjuntamente, llegan a afectar al 6.2% de la población. A pesar de su repercusión global, las empresas biotecnológicas y farmacéuticas no encuentran atractiva la investigación en ellas, de ahí que se llamen “enfermedades huérfanas”. Uno de los principales problemas que enfrentan en la actualidad es el retraso en el diagnóstico, lo que lleva en muchas ocasiones a un manejo inicial incorrecto que agrava aún más su curso clínico. Para poder avanzar en el conocimiento científico de estas enfermedades es imprescindible el intercambio de información entre centros especializados de diferentes países, con el fin de crear bases de datos comunes y accesibles para la comunidad científica. Así surge Solve-RD, la primera colaboración internacional en Europa para mejorar el diagnóstico de las ER. Las enfermedades mitocondriales (EM) son ER multisistémicas y clínicamente heterogéneas caracterizadas por disfunción mitocondrial, cuya genética se caracteriza por poseer características especiales. En los últimos años, se ha producido un cambio paradigmático en su enfoque diagnóstico, en el que el estudio genético ha pasado a ser una prueba esencial y asequible gracias al desarrollo de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). Dada su trascendencia y la falta de información recopilada en un mismo trabajo sobre ellas, este TFG pretende hacer una revisión bibliográfica para definir el estado de conocimiento actual sobre las EM., Grado en Medicina

Las enfermedades raras (ER), definidas en Europa como aquellas que afectan a menos de 1 por cada 2000 personas, son generalmente enfermedades crónicas, graves e invalidantes. Además, analizadas conjuntamente, llegan a afectar al 6.2% de la población. A pesar de su repercusión global, las empresas biotecnológicas y farmacéuticas no encuentran atractiva la investigación en ellas, de ahí que se llamen “enfermedades huérfanas”. Uno de los principales problemas que enfrentan en la actualidad es el retraso en el diagnóstico, lo que lleva en muchas ocasiones a un manejo inicial incorrecto que agrava aún más su curso clínico. Para poder avanzar en el conocimiento científico de estas enfermedades es imprescindible el intercambio de información entre centros especializados de diferentes países, con el fin de crear bases de datos comunes y accesibles para la comunidad científica. Así surge Solve-RD, la primera colaboración internacional en Europa para mejorar el diagnóstico de las ER. Las enfermedades mitocondriales (EM) son ER multisistémicas y clínicamente heterogéneas caracterizadas por disfunción mitocondrial, cuya genética se caracteriza por poseer características especiales. En los últimos años, se ha producido un cambio paradigmático en su enfoque diagnóstico, en el que el estudio genético ha pasado a ser una prueba esencial y asequible gracias al desarrollo de las técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). Dada su trascendencia y la falta de información recopilada en un mismo trabajo sobre ellas, este TFG pretende hacer una revisión bibliográfica para definir el estado de conocimiento actual sobre las EM., Grado en Medicina

Tobacco causes more than 8 million deaths a year worldwide. Nicotine is the active ingredient in tobacco. Although its harmful effects have been identified and constantly warned, including by the Adventist Church for over 170 years, even today thousands of people still have this deadly addiction. Mitochondria are essential organelles not only for energy production, but also for processes of apoptosis, autophagy, redox signaling, immune response and metabolite delivery. Mitochondrial homeostasis depends on a balance in mitochondrial dynamics (fusion and fission). Studies have shown that mitochondrial functions and morphological changes depend on a viable circadian clock. Changes in this molecular clock alter mitochondrial function. The aim of this study is to investigate the effects of nicotine exposure on the circadian cycle and mitochondrial dynamics, which can lead to relevant metabolic changes. Alterations in mitochondrial morphology have been implicated in several physiological and pathological processes, such as neurodegenerative diseases and cancer., O tabaco causa milhares de mortes todos os anos. A nicotina é a substância ativa do tabaco. Apesar de seus efeitos maléficos terem sido identificados e serem constantemente divulgados, inclusive pela igreja adventista por mais de 170 anos, ainda hoje milhares de pessoas ainda têm esse vício mortal. As mitocôndrias são organelas essenciais não apenas para a produção de energia, mas também para processos de apoptose, autofagia, sinalização redox, resposta imune e entrega de metabólitos. A homeostase mitocondrial depende de um equilíbrio na dinâmica mitocondrial (fusão e fissão). Estudos demonstraram que as funções mitocondriais e as alterações morfológicas dependem de um relógio circadiano viável. Mudanças neste relógio molecular alteram a função mitocondrial. O objetivo desse estudo é investigar os efeitos da exposição à nicotina no ciclo circadiano e na dinâmica mitocondrial, que podem levar a alterações metabólicas relevantes. Alterações na morfologia mitocondrial têm sido implicadas em vários processos fisiológicos e patológicos, como doenças neurodegenerativas e câncer.

Producción Científica, Drug side effects are one of the main reasons for treatment withdrawal during clinical trials. Reactive oxygen species formation is involved in many of the drug side effects, mainly by interacting with the components of the cellular respiration. Thus, the early detection of these effects in the drug discovery process is a key aspect for the optimization of pharmacological research. To this end, the superoxide formation of a series of drugs and compounds with antidepressant, antipsychotic, anticholinergic, narcotic, and analgesic properties was evaluated in isolated bovine heart membranes and on cell membrane microarrays from a collection of human tissues, together with specific inhibitors of the mitochondrial electron transport chain. Fluphenazine and PB28 promoted similar effects to those of rotenone, but with lower potency, indicating a direct action on mitochondrial complex I. Moreover, nefazodone, a drug withdrawn from the market due to its mitochondrial hepatotoxic effects, evoked the highest superoxide formation in human liver cell membranes, suggesting the potential of this technology to anticipate adverse effects in preclinical phases., Ministerio de Economía y Competitividad - (grant DIN2019-010902), Gobierno Vasco, Departamento de Desarrollo Económico, Sostenibilidad y Medio Ambiente - (grant Bikaintek: 48-AF-W2-2019-00007)

Tobacco causes more than 8 million deaths a year worldwide. Nicotine is the active ingredient in tobacco. Although its harmful effects have been identified and constantly warned, including by the Adventist Church for over 170 years, even today thousands of people still have this deadly addiction. Mitochondria are essential organelles not only for energy production, but also for processes of apoptosis, autophagy, redox signaling, immune response and metabolite delivery. Mitochondrial homeostasis depends on a balance in mitochondrial dynamics (fusion and fission). Studies have shown that mitochondrial functions and morphological changes depend on a viable circadian clock. Changes in this molecular clock alter mitochondrial function. The aim of this study is to investigate the effects of nicotine exposure on the circadian cycle and mitochondrial dynamics, which can lead to relevant metabolic changes. Alterations in mitochondrial morphology have been implicated in several physiological and pathological processes, such as neurodegenerative diseases and cancer., O tabaco causa milhares de mortes todos os anos. A nicotina é a substância ativa do tabaco. Apesar de seus efeitos maléficos terem sido identificados e serem constantemente divulgados, inclusive pela igreja adventista por mais de 170 anos, ainda hoje milhares de pessoas ainda têm esse vício mortal. As mitocôndrias são organelas essenciais não apenas para a produção de energia, mas também para processos de apoptose, autofagia, sinalização redox, resposta imune e entrega de metabólitos. A homeostase mitocondrial depende de um equilíbrio na dinâmica mitocondrial (fusão e fissão). Estudos demonstraram que as funções mitocondriais e as alterações morfológicas dependem de um relógio circadiano viável. Mudanças neste relógio molecular alteram a função mitocondrial. O objetivo desse estudo é investigar os efeitos da exposição à nicotina no ciclo circadiano e na dinâmica mitocondrial, que podem levar a alterações metabólicas relevantes. Alterações na morfologia mitocondrial têm sido implicadas em vários processos fisiológicos e patológicos, como doenças neurodegenerativas e câncer.

[Resumo] A artrite reumatoide (AR) é unha doenza inflamatoria e crónica de carácter autoinmune que afecta aproximadamente ao 1% da poboación mundial e que ten como principal órgano diana as articulacións sinoviais. Entre as súas consecuencias máis directas, a AR pode dar lugar á perda de función articular, discapacidade, redución da calidade de vida e aumento da mortalidade, sumado a unha importante carga social. Nos últimos anos, numerosas investigacións evidenciaron o papel fundamental da mitocondria nas enfermedades autoinmunes, aínda que segue sen coñecerse con claridade a relación entre a disfunción mitocondrial e a resposta inmune/inflamatoria no seo da artrite reumatoide (AR). En relación, estudos previos realizados polo grupo de Envellecemento e Inflamación en sinoviocitos humanos, mostraron que a disfunción mitocondrial participa na activación da resposta inflamatoria característica da patoloxía artrítica; así mesmo, tamén se observou como o resveratrol, un composto natural con propiedades antiinflamatorias e antioxidantes, foi capaz de reducir a severidade da AR nun modelo animal experimental de artrite inducida por antíxeno (AIA). Seguindo esta liña, a finalidade deste Traballo de Fin de Máster é investigar a relación entre a disfunción mitocondrial e a activación da resposta inflamatoria en dous tipos celulares implicados na AR, prestando especial atención ao posible efecto antiinflamatorio dunha dieta antioxidante con resveratrol., [Resumen] La artritis reumatoide (AR) es una dolencia inflamatoria y crónica de carácter autoinmune que afecta aproximadamente al 1% de la población mundial y que tiene como principal órgano diana las articulaciones sinoviales. Entre las consecuencias más directas, la AR puede dar lugar a la pérdida de función articular, discapacidad, reducción de la calidad de vida y aumento de la mortalidad, sumado a una importante carga social. En los últimos años, numerosas investigaciones evidenciaron el papel fundamental de la mitocondria en las enfermedades autoinmunes, pero aún no se conoce con claridad cual es la relación entre la disfunción mitocondrial y la respuesta inmune/inflamatoria en el seno de la AR. En relación, estudios previos realizados por el grupo de Envejecimiento e Inflamación en sinoviocitos humanos, mostraron que la disfunción mitocondrial participa en la activación de la respuesta inflamatoria característica de la patología artrítica; así mismo, también se observó como la función del resveratrol, un compuesto natural con propiedades antiinflamatorias y antioxidantes, fue capaz de reducir la severidad de la AR en un modelo animal experimental de artritis inducida por antígeno (AIA). Siguiendo esta línea, la finalidad de este Trabajo de Fin de Máster es investigar la relación entre la disfunción mitocondrial y la activación de la respuesta inflamatoria en dos tipos celulares implicados en AR, presentando especial atención al posible efecto antiinflamatorio de una dieta antioxidante con resveratrol., [Abstract] Rheumatoid arthritis (AR) is a chronic inflammatory autoimmune disease that affects approximately 1% of the world's population, with the synovial joints as the main target organ. Among the most direct consequences, RA can lead to loss of joint function, disability, reduced quality of life and increased mortality, as well as a significant social burden. In recent years, much research has highlighted the central role of mitochondria in autoimmune diseases, but the relationship between mitochondrial dysfunction and the immune/inflammatory response in RA remains unclear. In this regard, previous studies carried out by the Ageing and Inflammation group in human synoviocytes showed that mitochondrial dysfunction is involved in the activation of the inflammatory response characteristic of arthritic pathology; likewise, it was also observed that the function of resveratrol, a natural compound with antiinflammatory and antioxidant properties, was able to reduce the severity of RA in an experimental animal model of antigen-induced arthritis (AIA). Following this line, the aim of this Master's thesis is to investigate the relationship between mitochondrial dysfunction and the activation of the inflammatory response in two cell types involved in RA, paying special attention to the possible anti-inflammatory effect of an antioxidant diet with resveratrol.

El término célula fue empleado por primera vez por Hooke en 1655 para describir sus investigaciones sobre la constitución de una lámina de corcho analizado a través de lentes de aumento. La teoría celular, sin embargo, solo fue formulada en 1839 por Schleiden y Schwann; en ella concluyeron que todo ser vivo está constituido por unidades fundamentales: las células. Así se desarrolló la citología (ciencia que estudia las células), importante ramo de la biología (Curtis et al., 2008).

El término célula fue empleado por primera vez por Hooke en 1655 para describir sus investigaciones sobre la constitución de una lámina de corcho analizado a través de lentes de aumento. La teoría celular, sin embargo, solo fue formulada en 1839 por Schleiden y Schwann; en ella concluyeron que todo ser vivo está constituido por unidades fundamentales: las células. Así se desarrolló la citología (ciencia que estudia las células), importante ramo de la biología (Curtis et al., 2008).

El término célula fue empleado por primera vez por Hooke en 1655 para describir sus investigaciones sobre la constitución de una lámina de corcho analizado a través de lentes de aumento. La teoría celular, sin embargo, solo fue formulada en 1839 por Schleiden y Schwann; en ella concluyeron que todo ser vivo está constituido por unidades fundamentales: las células. Así se desarrolló la citología (ciencia que estudia las células), importante ramo de la biología (Curtis et al., 2008).

El término célula fue empleado por primera vez por Hooke en 1655 para describir sus investigaciones sobre la constitución de una lámina de corcho analizado a través de lentes de aumento. La teoría celular, sin embargo, solo fue formulada en 1839 por Schleiden y Schwann; en ella concluyeron que todo ser vivo está constituido por unidades fundamentales: las células. Así se desarrolló la citología (ciencia que estudia las células), importante ramo de la biología (Curtis et al., 2008).

Producción Científica, The FASTK family of proteins have been recently reported to play a key role in the post-transcriptional regulation of mitochondrial gene expression, including mRNA stability and translation. Accumulated studies have provided evidence that the expression of some FASTK genes is altered in certain types of cancer, in agreement with the central role of mitochondria in cancer development. Here, we obtained a pan-cancer overview of the genomic and transcriptomic alterations of FASTK genes. FASTK, FASTKD1, FASTKD3 and FASTKD5 showed the highest rates of genetic alterations. FASTK and FASTKD3 alterations consisted mainly of amplifications that were seen in more than 8% of ovarian and lung cancers, respectively. FASTKD1 and FASTKD5 were the most frequently mutated FASTK genes, and the mutations were identified in 5–7% of uterine cancers, as well as in 4% of melanomas. Our results also showed that the mRNA levels of all FASTK members were strongly upregulated in esophageal, stomach, liver and lung cancers. Finally, the protein-protein interaction network for FASTK proteins uncovers the interaction of FASTK, FASTKD2, FASTKD4 and FASTKD5 with cancer signaling pathways. These results serve as a starting point for future research into the potential of the FASTK family members as diagnostic and therapeutic targets for certain types of cancer., Junta de Castilla y León (grants GRS 1971/A/19 and GRS 2201/A/2020), Junta de Castilla y León (grant VA172P20), Ministerio de Ciencia e Innovación (Severo Ochoa SVP-2014–068895)

It has been reported that dextrans diminish the intermembrane space of mitochondria, increase the number of contact sites between the inner and the outer mitochondrial membranes, decrease the outer membrane permeability to adenosine 5(')-diphosphate, and

[ES] La familia de proteínas Bcl-2 regula la apoptosis a través de una compleja red de interacciones. Las células tumorales suelen presentar mutaciones que afectan a su expresión o sus interacciones para mejorar la progresión tumoral. Además, alteraciones en su regulación también promueven la migración de células cancerígenas, la invasión y la metástasis. Para llevar a cabo sus funciones, las proteínas Bcl 2 interaccionan entre sí tanto en el citoplasma como en las membranas intracelulares. Los equilibrios de interacción de los dominios Bcl citosólicos se han investigado ampliamente y recientemente, se han propuesto como dianas terapéuticas. Sin embargo, el interactoma de los dominios transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domains) sigue siendo poco conocido. Por ello, un conocimiento profundo de la biología de las proteínas Bcl-2 es necesario para explotar eficientemente sus superficies de unión en el tratamiento del cáncer. Para llevar a cabo este objetivo, nos hemos centrado en tres áreas: 1. La comprensión detallada de la contribución del TMD de Mcl-1 a su interactoma en membrana y su función. 2. El descubrimiento de nuevos inhibidores de Mcl-1 que actúen sobre su TMD y que permitan desarrollar una clase de drogas anticancerígenas aún por explorar. 3. La caracterización molecular de mutaciones relacionadas con el cáncer descritas en los TMD de Bcl-2 y Bcl-xL y sus implicaciones en la supervivencia de las células tumorales. La proteína antiapoptótica Mcl-1 inhibe a los miembros proapoptóticos Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Aunque se ha estudiado en detalle su actividad promoviendo la supervivencia celular, el mecanismo molecular por el cuál previene la apoptosis mediada por Bok aún no está claro. Además, el conocimiento de las actividades de Mcl-1, descritas hasta ahora, se basa exclusivamente en las estructuras resueltas de las regiones solubles en agua y en estudios centrados en los dominios citosólicos. Por primera vez, hemos demostrado la relevancia del TMD, [CA] La família de proteïnes Bcl-2 regula l'apoptosi a través d'una complexa xarxa d'interaccions. Les cèl·lules tumorals solen presentar mutacions que afecten la seua expressió o les seues interaccions per a millorar la progressió tumoral. A més, alteracions en la seua regulació també promouen la migració de cèl·lules cancerígenes, la invasió i la metàstasi. Per a dur a terme les seues funcions, les proteïnes Bcl-2 interaccionen entre si tant en el citoplasma com en les membranes intracel·lulars. Els equilibris d'interacció dels dominis Bcl citosòlics s'han investigat àmpliament i recentment, s'han proposat com a dianes terapèutiques. No obstant això, l'interactoma dels dominis transmembrana (TMD, de l'anglés transmembrane domains) continua sent poc conegut. Per això, un coneixement profund de la biologia de les proteïnes Bcl-2 és necessari per a explotar eficientment les seues superfícies d'unió en el tractament del càncer. Per a dur a terme aquest objectiu, ens hem centrat en tres àrees: 1. La comprensió detallada de la contribució del TMD de Mcl-1 al seu interactoma en membrana i la seua funció. 2. El descobriment de nous inhibidors de Mcl-1 que actuen sobre el seu TMD i que permeten desenvolupar una classe de drogues anticanceroses encara per explorar. 3. La caracterització molecular de mutacions relacionades amb el càncer descrites en els TMD de Bcl-2 i Bcl-xL i les seues implicacions en la supervivència de les cèl·lules tumorals. La proteïna anti apoptòtica Mcl-1 inhibeix als membres pro apoptòtics Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Encara que s'ha estudiat detalladament la seua activitat promovent la supervivència cel·lular, el mecanisme molecular pel qual prevé l'apoptosi mediada per Bok encara no és clar. A més, el coneixement de les activitats de Mcl-1, descrites fins ara, es basa exclusivament en les estructures resoltes solubles en aigua i en estudis centrats en els dominis externs a la membrana. Per primera vegada, hem demostrat la rellevància del TMD de Mcl-1, [EN] The family of the Bcl-2 proteins modulates the apoptotic pathway by a complex network of interactions. Tumor cells frequently present mutations that affect Bcl-2 proteins expression or interactions to enhance cancer progression. Dysregulation of these proteins also promotes cancer cell migration, invasion, and metastasis. To execute their functions, Bcl-2 proteins interact in both the cytosol and intracellular membranes. Binding equilibria of Bcl extramembrane domains has been largely investigated and recently proposed as chemotherapeutic targets. However, the interactome of transmembrane domains (TMDs) remains poorly understood. In this scenario, a deep knowledge of the biology of Bcl-2 proteins is needed to exploit efficiently their binding surfaces for cancer treatment. To address this aim, our research focuses on three areas: 1. The detailed comprehension of the TMD contribution to both the Mcl-1 membrane interactome and protein functionality. 2. The discovery of new Mcl-1 inhibitors that target the transmembrane surface to develop a class of anticancer drugs currently unexplored. 3. The molecular characterization of cancer-related mutations within the Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and their implications for the survival of cancer cells. Antiapoptotic Mcl-1 protein inhibits the proapoptotic members Bak, Bax, Bok, and Noxa, among others. Although its prosurvival activity has been well studied, the molecular mechanism to prevent Bok-mediated apoptosis remains unclear. Furthermore, understanding of Mcl-1 activities described to date is only based on water-soluble structures and studies focused on extramembrane domains. For the first time, we uncover the relevance of the Mcl-1 TMD in the interaction equilibria of the protein. In the present work, we describe its specific capacity to self-associate and hetero-oligomerize with the Bok TMD. We also explain the influence of these interactions in the apoptotic pathway and highlight the clinical relevance of Mcl-1 TMD mutant

[ES] La familia de proteínas Bcl-2 regula la apoptosis a través de una compleja red de interacciones. Las células tumorales suelen presentar mutaciones que afectan a su expresión o sus interacciones para mejorar la progresión tumoral. Además, alteraciones en su regulación también promueven la migración de células cancerígenas, la invasión y la metástasis. Para llevar a cabo sus funciones, las proteínas Bcl 2 interaccionan entre sí tanto en el citoplasma como en las membranas intracelulares. Los equilibrios de interacción de los dominios Bcl citosólicos se han investigado ampliamente y recientemente, se han propuesto como dianas terapéuticas. Sin embargo, el interactoma de los dominios transmembrana (TMD, del inglés transmembrane domains) sigue siendo poco conocido. Por ello, un conocimiento profundo de la biología de las proteínas Bcl-2 es necesario para explotar eficientemente sus superficies de unión en el tratamiento del cáncer. Para llevar a cabo este objetivo, nos hemos centrado en tres áreas: 1. La comprensión detallada de la contribución del TMD de Mcl-1 a su interactoma en membrana y su función. 2. El descubrimiento de nuevos inhibidores de Mcl-1 que actúen sobre su TMD y que permitan desarrollar una clase de drogas anticancerígenas aún por explorar. 3. La caracterización molecular de mutaciones relacionadas con el cáncer descritas en los TMD de Bcl-2 y Bcl-xL y sus implicaciones en la supervivencia de las células tumorales. La proteína antiapoptótica Mcl-1 inhibe a los miembros proapoptóticos Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Aunque se ha estudiado en detalle su actividad promoviendo la supervivencia celular, el mecanismo molecular por el cuál previene la apoptosis mediada por Bok aún no está claro. Además, el conocimiento de las actividades de Mcl-1, descritas hasta ahora, se basa exclusivamente en las estructuras resueltas de las regiones solubles en agua y en estudios centrados en los dominios citosólicos. Por primera vez, hemos demostrado la relevancia del TMD, [CA] La família de proteïnes Bcl-2 regula l'apoptosi a través d'una complexa xarxa d'interaccions. Les cèl·lules tumorals solen presentar mutacions que afecten la seua expressió o les seues interaccions per a millorar la progressió tumoral. A més, alteracions en la seua regulació també promouen la migració de cèl·lules cancerígenes, la invasió i la metàstasi. Per a dur a terme les seues funcions, les proteïnes Bcl-2 interaccionen entre si tant en el citoplasma com en les membranes intracel·lulars. Els equilibris d'interacció dels dominis Bcl citosòlics s'han investigat àmpliament i recentment, s'han proposat com a dianes terapèutiques. No obstant això, l'interactoma dels dominis transmembrana (TMD, de l'anglés transmembrane domains) continua sent poc conegut. Per això, un coneixement profund de la biologia de les proteïnes Bcl-2 és necessari per a explotar eficientment les seues superfícies d'unió en el tractament del càncer. Per a dur a terme aquest objectiu, ens hem centrat en tres àrees: 1. La comprensió detallada de la contribució del TMD de Mcl-1 al seu interactoma en membrana i la seua funció. 2. El descobriment de nous inhibidors de Mcl-1 que actuen sobre el seu TMD i que permeten desenvolupar una classe de drogues anticanceroses encara per explorar. 3. La caracterització molecular de mutacions relacionades amb el càncer descrites en els TMD de Bcl-2 i Bcl-xL i les seues implicacions en la supervivència de les cèl·lules tumorals. La proteïna anti apoptòtica Mcl-1 inhibeix als membres pro apoptòtics Bak, Bax, Bok, Noxa, etc. Encara que s'ha estudiat detalladament la seua activitat promovent la supervivència cel·lular, el mecanisme molecular pel qual prevé l'apoptosi mediada per Bok encara no és clar. A més, el coneixement de les activitats de Mcl-1, descrites fins ara, es basa exclusivament en les estructures resoltes solubles en aigua i en estudis centrats en els dominis externs a la membrana. Per primera vegada, hem demostrat la rellevància del TMD de Mcl-1, [EN] The family of the Bcl-2 proteins modulates the apoptotic pathway by a complex network of interactions. Tumor cells frequently present mutations that affect Bcl-2 proteins expression or interactions to enhance cancer progression. Dysregulation of these proteins also promotes cancer cell migration, invasion, and metastasis. To execute their functions, Bcl-2 proteins interact in both the cytosol and intracellular membranes. Binding equilibria of Bcl extramembrane domains has been largely investigated and recently proposed as chemotherapeutic targets. However, the interactome of transmembrane domains (TMDs) remains poorly understood. In this scenario, a deep knowledge of the biology of Bcl-2 proteins is needed to exploit efficiently their binding surfaces for cancer treatment. To address this aim, our research focuses on three areas: 1. The detailed comprehension of the TMD contribution to both the Mcl-1 membrane interactome and protein functionality. 2. The discovery of new Mcl-1 inhibitors that target the transmembrane surface to develop a class of anticancer drugs currently unexplored. 3. The molecular characterization of cancer-related mutations within the Bcl-2 and Bcl-xL TMDs and their implications for the survival of cancer cells. Antiapoptotic Mcl-1 protein inhibits the proapoptotic members Bak, Bax, Bok, and Noxa, among others. Although its prosurvival activity has been well studied, the molecular mechanism to prevent Bok-mediated apoptosis remains unclear. Furthermore, understanding of Mcl-1 activities described to date is only based on water-soluble structures and studies focused on extramembrane domains. For the first time, we uncover the relevance of the Mcl-1 TMD in the interaction equilibria of the protein. In the present work, we describe its specific capacity to self-associate and hetero-oligomerize with the Bok TMD. We also explain the influence of these interactions in the apoptotic pathway and highlight the clinical relevance of Mcl-1 TMD mutant

Producción Científica, Mitochondrial [Ca2+] plays an important role in the regulation of mitochondrial function, controlling ATP production and apoptosis triggered by mitochondrial Ca2+ overload. This regulation depends on Ca2+ entry into the mitochondria during cell activation processes, which is thought to occur through the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU). Here, we have studied the mitochondrial Ca2+ dynamics in control and MCU-defective C. elegans worms in vivo, by using worms expressing mitochondrially-targeted YC3.60 yellow cameleon in pharynx muscle. Our data show that the small mitochondrial Ca2+ oscillations that occur during normal physiological activity of the pharynx were very similar in both control and MCU-defective worms, except for some kinetic differences that could mostly be explained by changes in neuronal stimulation of the pharynx. However, direct pharynx muscle stimulation with carbachol triggered a large and prolonged increase in mitochondrial [Ca2+] that was much larger in control worms than in MCU-defective worms. This suggests that MCU is necessary for the fast mitochondrial Ca2+ uptake induced by large cell stimulations. However, low-amplitude mitochondrial Ca2+ oscillations occurring under more physiological conditions are independent of the MCU and use a different Ca2+ pathway., Ministerio de Economía y Competitividad - (Proyecto BFU2017-83509-R), Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y Junta de Castilla y León - (Projecto VA011G18)

Producción Científica, Mitochondrial [Ca2+] plays an important role in the regulation of mitochondrial function, controlling ATP production and apoptosis triggered by mitochondrial Ca2+ overload. This regulation depends on Ca2+ entry into the mitochondria during cell activation processes, which is thought to occur through the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU). Here, we have studied the mitochondrial Ca2+ dynamics in control and MCU-defective C. elegans worms in vivo, by using worms expressing mitochondrially-targeted YC3.60 yellow cameleon in pharynx muscle. Our data show that the small mitochondrial Ca2+ oscillations that occur during normal physiological activity of the pharynx were very similar in both control and MCU-defective worms, except for some kinetic differences that could mostly be explained by changes in neuronal stimulation of the pharynx. However, direct pharynx muscle stimulation with carbachol triggered a large and prolonged increase in mitochondrial [Ca2+] that was much larger in control worms than in MCU-defective worms. This suggests that MCU is necessary for the fast mitochondrial Ca2+ uptake induced by large cell stimulations. However, low-amplitude mitochondrial Ca2+ oscillations occurring under more physiological conditions are independent of the MCU and use a different Ca2+ pathway., Ministerio de Economía y Competitividad - (Proyecto BFU2017-83509-R), Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) y Junta de Castilla y León - (Projecto VA011G18)

[Resumen]: La osteoartritis (OA) es una de las enfermedades musculoesqueléticas más prevalentes a nivel mundial, sin embargo, su patogenia es compleja y a día de hoy no está clara. En los últimos años se ha puesto de manifiesto el papel de la mitocondria en la OA, así como el papel de los haplogrupos de ADNmt en su incidencia y progresión. La mitocondria es un orgánulo celular que desempeña una función esencial en el metabolismo de la glucosa y de los ácidos grasos. La concentración de glucosa tiene un efecto sobre el metabolismo celular y la OA ya que altas concentraciones se relacionan con una mayor producción de Especies Reactivas de Oxígeno (ERO). Se ha descrito que los condrocitos sanos son células altamente glucolíticas, aunque obtienen un 25% del ATP por la vía mitocondrial y tienen la flexibilidad metabólica necesaria para adaptarse a los cambios de metabolitos, lo que no ocurre en condrocitos OA. La utilización de un modelo celular in vitro se presenta como una herramienta útil para estudiar de forma simple el papel de la mitocondria en numerosas patologías complejas como la OA. Así, el objetivo de este proyecto es estudiar si la glucosa podría tener un papel modulador en la respuesta mitocondrial en un modelo celular in vitro basado en cíbridos transmitocondriales portadores de mitocondrias sanas y artrósicas. Para ello, se evaluará el estatus mitocondrial, por un lado, analizando el número de copias de ADNmt y la biogénesis mitocondrial y, por otro, analizando la red mitocondrial y los niveles de producción de ERO utilizando MitoTracker Red y MitoSOX respectivamente. Dada la importancia del metabolismo, también se analizarán las concentraciones de tres metabolitos esenciales: la glucosa, el ácido láctico y el piruvato y seguidamente se estudiará la capacidad glucolítica y la función mitocondrial utilizando un SeaHorse XFp Flux Analyzer. Todo ello, como respuesta a la incubación con diferentes concentraciones de glucosa.

La mitocondria es un orgánulo esencial para la función celular, incluyendo la generación celular de la energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la oxidación de metabolitos. La proteína de unión a RNA, FASTK (Fas activated serine/threonine kinase), tiene dos isoformas, una localizada en la mitocondria (mitoFASTK), y la otra isoforma en citosol y núcleo (cytoFASTK). Se ha demostrado que la isoforma mitoFASTK es necesaria para la biogénesis del mRNA ND6 mitocondrial, que codifica una subunidad esencial del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CI, NADH:ubiquinona oxidorreductasa). Este estudio investiga los mecanismos de acción de FASTK en la fagocitosis no opsónica. En nuestro laboratorio se ha observado que los macrófagos de los ratones FASTK KO muestran un aumento en la fagocitosis no opsónica de bacterias y una disminución del ~50 % de la actividad del CI en estas células. Durante el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, como método de estudio para explorar si la disminución de la actividad del CI explica el fenotipo fagocítico, se empleó el tratamiento con el inhibidor del CI, rotenona, en los macrófagos murinos WT, así como en la línea celular murina RAW 264.7. En paralelo se silenciaron con shRNAs en dicha línea celular, las dos subunidades del CI (NDUFS3 y NDUFS4). Se observó que, tanto el tratamiento farmacológico con rotenona como el silenciamiento de las subunidades NDUFS3 y NDUFS4, resultaba en un aumento en la fagocitosis bacteriana no opsónica. La reexpresión de mitoFASTK en los macrófagos silenciados en FASTK rescata el fenotipo (es decir, la fagocitosis vuelve a ser normal). Asimismo, la disminución de la actividad del CI en los macrófagos FASTK KO está asociada con un aumento en la fosforilación de AMPK, y su inhibición utilizando el compuesto C revierte el fenotipo fagocítico. Finalmente, se ha demostrado que los macrófagos FASTK KO muestran aumento en la producción de mitoROS respecto a los macrófagos, Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense, Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud

The human placenta requires cholesterol to synthesize the progesterone that maintains the relationship between the fetus and the mother, which allows it to successfully conclude pregnancy. The placenta incorporates cholesterol through the LDL obtained from the maternal blood stream by a mechanism of endocytosis. Endosomes formed by this process degrade the LDL, bind several proteins forming the late endosomes and releasing the cholesterol to syncytiotrophoblast mitochondria to transform it into pregnenolone and then, into progesterone. The soluble attachment proteins denominated SNARE participates in the transport of cholesterol in specific contact sites where the mitochondrial proteins responsible for steroidogenesis are located., La placenta humana requiere de colesterol para sintetizar la progesterona que mantiene la relación entre el feto y la madre, lo que le permite concluir de manera exitosa el embarazo. La placenta incorpora el colesterol principalmente a través de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se obtienen del torrente circulatorio materno por un mecanismo de endocitosis. A los endosomas que se generan en este proceso se les unen varias proteínas conformando los endosomas tardíos, que degradan las LDL y liberan el colesterol a las mitocondrias del sinciciotrofoblasto que lo transforman en pregnenolona y posteriormente en progesterona. Las proteínas de fusión de membranas denominados complejos SNARE participan en la liberación del colesterol en sitios de contacto específicos en donde se localizan las proteínas mitocondriales responsables de la esteroidogénesis.

La mitocondria es un orgánulo esencial para la función celular, incluyendo la generación celular de la energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la oxidación de metabolitos. La proteína de unión a RNA, FASTK (Fas activated serine/threonine kinase), tiene dos isoformas, una localizada en la mitocondria (mitoFASTK), y la otra isoforma en citosol y núcleo (cytoFASTK). Se ha demostrado que la isoforma mitoFASTK es necesaria para la biogénesis del mRNA ND6 mitocondrial, que codifica una subunidad esencial del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CI, NADH:ubiquinona oxidorreductasa). Este estudio investiga los mecanismos de acción de FASTK en la fagocitosis no opsónica. En nuestro laboratorio se ha observado que los macrófagos de los ratones FASTK KO muestran un aumento en la fagocitosis no opsónica de bacterias y una disminución del ~50 % de la actividad del CI en estas células. Durante el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, como método de estudio para explorar si la disminución de la actividad del CI explica el fenotipo fagocítico, se empleó el tratamiento con el inhibidor del CI, rotenona, en los macrófagos murinos WT, así como en la línea celular murina RAW 264.7. En paralelo se silenciaron con shRNAs en dicha línea celular, las dos subunidades del CI (NDUFS3 y NDUFS4). Se observó que, tanto el tratamiento farmacológico con rotenona como el silenciamiento de las subunidades NDUFS3 y NDUFS4, resultaba en un aumento en la fagocitosis bacteriana no opsónica. La reexpresión de mitoFASTK en los macrófagos silenciados en FASTK rescata el fenotipo (es decir, la fagocitosis vuelve a ser normal). Asimismo, la disminución de la actividad del CI en los macrófagos FASTK KO está asociada con un aumento en la fosforilación de AMPK, y su inhibición utilizando el compuesto C revierte el fenotipo fagocítico. Finalmente, se ha demostrado que los macrófagos FASTK KO muestran aumento en la producción de mitoROS respecto a los macrófagos, Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense, Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud

La mitocondria es un orgánulo esencial para la función celular, incluyendo la generación celular de la energía en forma de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la oxidación de metabolitos. La proteína de unión a RNA, FASTK (Fas activated serine/threonine kinase), tiene dos isoformas, una localizada en la mitocondria (mitoFASTK), y la otra isoforma en citosol y núcleo (cytoFASTK). Se ha demostrado que la isoforma mitoFASTK es necesaria para la biogénesis del mRNA ND6 mitocondrial, que codifica una subunidad esencial del complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial (CI, NADH:ubiquinona oxidorreductasa). Este estudio investiga los mecanismos de acción de FASTK en la fagocitosis no opsónica. En nuestro laboratorio se ha observado que los macrófagos de los ratones FASTK KO muestran un aumento en la fagocitosis no opsónica de bacterias y una disminución del ~50 % de la actividad del CI en estas células. Durante el trabajo realizado en esta Tesis Doctoral, como método de estudio para explorar si la disminución de la actividad del CI explica el fenotipo fagocítico, se empleó el tratamiento con el inhibidor del CI, rotenona, en los macrófagos murinos WT, así como en la línea celular murina RAW 264.7. En paralelo se silenciaron con shRNAs en dicha línea celular, las dos subunidades del CI (NDUFS3 y NDUFS4). Se observó que, tanto el tratamiento farmacológico con rotenona como el silenciamiento de las subunidades NDUFS3 y NDUFS4, resultaba en un aumento en la fagocitosis bacteriana no opsónica. La reexpresión de mitoFASTK en los macrófagos silenciados en FASTK rescata el fenotipo (es decir, la fagocitosis vuelve a ser normal). Asimismo, la disminución de la actividad del CI en los macrófagos FASTK KO está asociada con un aumento en la fosforilación de AMPK, y su inhibición utilizando el compuesto C revierte el fenotipo fagocítico. Finalmente, se ha demostrado que los macrófagos FASTK KO muestran aumento en la producción de mitoROS respecto a los macrófagos, Departamento de Anatomía Patológica, Microbiología, Medicina Preventiva y Salud Pública, Medicina Legal y Forense, Doctorado en Investigación en Ciencias de la Salud

The human placenta requires cholesterol to synthesize the progesterone that maintains the relationship between the fetus and the mother, which allows it to successfully conclude pregnancy. The placenta incorporates cholesterol through the LDL obtained from the maternal blood stream by a mechanism of endocytosis. Endosomes formed by this process degrade the LDL, bind several proteins forming the late endosomes and releasing the cholesterol to syncytiotrophoblast mitochondria to transform it into pregnenolone and then, into progesterone. The soluble attachment proteins denominated SNARE participates in the transport of cholesterol in specific contact sites where the mitochondrial proteins responsible for steroidogenesis are located., La placenta humana requiere de colesterol para sintetizar la progesterona que mantiene la relación entre el feto y la madre, lo que le permite concluir de manera exitosa el embarazo. La placenta incorpora el colesterol principalmente a través de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se obtienen del torrente circulatorio materno por un mecanismo de endocitosis. A los endosomas que se generan en este proceso se les unen varias proteínas conformando los endosomas tardíos, que degradan las LDL y liberan el colesterol a las mitocondrias del sinciciotrofoblasto que lo transforman en pregnenolona y posteriormente en progesterona. Las proteínas de fusión de membranas denominados complejos SNARE participan en la liberación del colesterol en sitios de contacto específicos en donde se localizan las proteínas mitocondriales responsables de la esteroidogénesis.

The human placenta requires cholesterol to synthesize the progesterone that maintains the relationship between the fetus and the mother, which allows it to successfully conclude pregnancy. The placenta incorporates cholesterol through the LDL obtained from the maternal blood stream by a mechanism of endocytosis. Endosomes formed by this process degrade the LDL, bind several proteins forming the late endosomes and releasing the cholesterol to syncytiotrophoblast mitochondria to transform it into pregnenolone and then, into progesterone. The soluble attachment proteins denominated SNARE participates in the transport of cholesterol in specific contact sites where the mitochondrial proteins responsible for steroidogenesis are located., La placenta humana requiere de colesterol para sintetizar la progesterona que mantiene la relación entre el feto y la madre, lo que le permite concluir de manera exitosa el embarazo. La placenta incorpora el colesterol principalmente a través de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) que se obtienen del torrente circulatorio materno por un mecanismo de endocitosis. A los endosomas que se generan en este proceso se les unen varias proteínas conformando los endosomas tardíos, que degradan las LDL y liberan el colesterol a las mitocondrias del sinciciotrofoblasto que lo transforman en pregnenolona y posteriormente en progesterona. Las proteínas de fusión de membranas denominados complejos SNARE participan en la liberación del colesterol en sitios de contacto específicos en donde se localizan las proteínas mitocondriales responsables de la esteroidogénesis.

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metabólica do sistema nervoso torna as mitocôndrias essenciais para células nervosas. Essas organelas têm como função o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das espécies reativas de oxigênio. Uma vez que ocorre desregulação nessas atividades, o funcionamento das mitocôndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energético principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativação de vias de morte celular, uma característica bastante associada às doenças neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as deleções no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metilação e hidroximetilação do DNA mitocondrial; sobre proteínas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzimática da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energético para as células; e sobre proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Além disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os parâmetros analisados. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal e na idade adulta foram tratados com veículo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das deleções do DNA mitocondrial e das proteínas envolvidas na via intrínseca da apoptose, enquanto induziu a redução de metilação e hidroximetilação, Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apop

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metabólica do sistema nervoso torna as mitocôndrias essenciais para células nervosas. Essas organelas têm como função o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das espécies reativas de oxigênio. Uma vez que ocorre desregulação nessas atividades, o funcionamento das mitocôndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energético principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativação de vias de morte celular, uma característica bastante associada às doenças neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as deleções no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metilação e hidroximetilação do DNA mitocondrial; sobre proteínas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzimática da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energético para as células; e sobre proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Além disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os parâmetros analisados. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal e na idade adulta foram tratados com veículo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das deleções do DNA mitocondrial e das proteínas envolvidas na via intrínseca da apoptose, enquanto induziu a redução de metilação e hidroximetilação, Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apop

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metabólica do sistema nervoso torna as mitocôndrias essenciais para células nervosas. Essas organelas têm como função o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das espécies reativas de oxigênio. Uma vez que ocorre desregulação nessas atividades, o funcionamento das mitocôndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energético principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativação de vias de morte celular, uma característica bastante associada às doenças neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as deleções no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metilação e hidroximetilação do DNA mitocondrial; sobre proteínas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzimática da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energético para as células; e sobre proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Além disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os parâmetros analisados. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal e na idade adulta foram tratados com veículo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das deleções do DNA mitocondrial e das proteínas envolvidas na via intrínseca da apoptose, enquanto induziu a redução de metilação e hidroximetilação, Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apop

[ES] La función contráctil de la fibra muscular cardíaca, y por tanto las posibles arritmias del miocardio presentan una gran dependencia con la regulación del calcio en el interior de la célula. En el citoplasma de este tipo de células (cardiomiocitos) se encuentra un orgánulo denominado mitocondria, caracterizado, por una parte, porque en él se produce la mayor parte de la síntesis de energía en forma de ATP y, por otra, por su importante rol en la regulación del calcio intracelular. No obstante, aún no se ha desarrollado ningún modelo matemático del potencial de acción y corrientes iónicas en cardiomiocitos que incorpore la dinámica mitocondrial. El modelo implementado por Ainhoa Asensio en su Trabajo Fin de Grado [Asensio Orts, 2017], en el año 2017, y publicado en [Asensio y Ferrero, 2017a] y en [Asensio y Ferrero, 2017b] fue uno de los primeros en el mundo en introducir las corrientes pertenecientes a la mitocondria en un modelo de potencial de acción de cardiomiocito de ventrículo de conejo. Al obtenerse resultados significativos en dicho modelo y con el fin de hacer un análisis más exhaustivo sobre la influencia de las mitocondrias en la regulación de calcio, se decidió seguir esa línea de investigación añadiendo más posibles estados de la célula referentes a mutaciones celulares, a la influencia de fármacos sobre corrientes iónicas, a la edad o incluso a enfermedades cardíacas. Sin embargo, para llevar a cabo estos nuevos estudios, resultaba esencial desarrollar un nuevo software que automatizase y sistematizase las simulaciones. Para este fin, en el presente Trabajo Final de Máster se ha diseñado e implementado un software de automatización y procesamiento de resultados, mediante el uso de la herramienta Matlab, que facilita la obtención de múltiples simulaciones de un modelo de potencial de acción bajo diferentes condiciones de aumento o bloqueo de corrientes iónicas y de frecuencia de estimulación. El resultado de la aplicación del software a un modelo d, [CA] La funció contràctil de la fibra muscular cardíaca, i per tant les possibles arrítmies del miocardi presenten una gran dependència amb la regulació del calci a l’interior de la cèl·lula. En el citoplasma d’aquest tipues de cèl·lules (miòcits) es troba un orgànul denominat mitocòndria, caracteritzat, d’una banda, perquè en ell es produeix la major part de la síntesi d’energia en forma d’ATP i, per l’altra pel seu important paper en la regulació del calci intracel·lular. No obstant açò, encara no s’ha desenvolupat cap model matemàtic de potencial d’acció i corrents iòniques en miòcits que incorpore la dinàmica mitocondrial. El model implementat per Ainhoa Asensio en el seu treball Fi de Grau [Asensio Orts, 2017], l’any 2017, i publicat en [Asensio i Ferrero, 2017a] i en [Asensio i Ferrero, 2017b] va ser un dels primers en el món en introduir les corrents pertanyents a la mitocòndria en un model de potencial d’acció de miòcit de ventricle de conill. En obtenir-se resultats significatius en aquest model i amb la finalitat de fer una análisi més exhaustiu sobre la influència de les mitocòndries en la regulació del calci, es va decidir seguir aqueixa línia d’investigació afegint més possibles estats de la cèl·lula referents a mutacions cel·lulars, a la inflèuncia de fàrmacs sobre corrents iòniques, a l’edat o fins i tot a malalties cardíaques. No obstant açò, per a dur a terme aquests nous estudis, resultava essencial desenvolupar un nou software que automatitzara i sistematitzara les simulacions. Per a aquest fi, en el present Treball Final de Màster s’ha dissenyat i implementat un software d’automatització i processament de resultats, mitjançant l´ús de de la ferramenta Matlab, que facilita l’obtenció de múltiples simulacions d’un model de potencial d’acció baix diferents condicions d’augment o bloqueig de corrents iòniques i de freqüència d’estimulació. El resultat de l’aplicació del software a un model de potencial d’acció i corrents iòniques és una matriu de qua, [EN] The contractile function of the cardiac muscle fiber, and therefore the possible myocardial arrhythmias, are highly dependent on the calcium regulation inside the cell. In the cytoplasm of this cells type (cardiomyocytes) there is an organelle called mitochondria, characterized, on the one hand, because it produces the most of the synthesis of energy in ATP form and, on the other, because of its important role in the intracellular calcium regulation. However, no mathematical model of action potential and ionic currents in cardiomyocytes incorporating mitochondrial dynamics has yet been developed. The implemented model by Ainhoa Asensio in its Final Degree Project [Asensio Orts, 2017], in the 2017 year, and published in [Asensio and Ferrero, 2017a] and in [Asensio and Ferrero, 2017b] was one of the first in the world introducing the currents belonging to the mitochondria in a rabbit ventricle cardiomyocyte action potential model. When significant results were obtained in the said model and in order to do a more exhaustive analysis about the influence of mitochondria in the calcium regulation, it was decided to follow this line of research adding more possible cell states related to cell mutations, to the drugs influence on ionic currents, age or even heart diseases. However, to carry out these new studies, it was essential to develop a new software to automate and systematize the simulations. For this purpose, in the present Master Final Project an automation software has been designed and implemented, through the use of the Matlab tool, which facilitates the obtaining of multiple simulations of an action potential model under different conditions of increasing or blocking of ionic currents and of stimulation frequency. The result of the software application to an action potential model and ionic currents is a four-dimensional matrix which provides the four calcium preclinical biomarkers values (calcium systolic level, calcium diastolic level, time to calcium pe

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metabólica do sistema nervoso torna as mitocôndrias essenciais para células nervosas. Essas organelas têm como função o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das espécies reativas de oxigênio. Uma vez que ocorre desregulação nessas atividades, o funcionamento das mitocôndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energético principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativação de vias de morte celular, uma característica bastante associada às doenças neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as deleções no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metilação e hidroximetilação do DNA mitocondrial; sobre proteínas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzimática da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energético para as células; e sobre proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Além disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os parâmetros analisados. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal e na idade adulta foram tratados com veículo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das deleções do DNA mitocondrial e das proteínas envolvidas na via intrínseca da apoptose, enquanto induziu a redução de metilação e hidroximetilação, Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apop

[ES] La función contráctil de la fibra muscular cardíaca, y por tanto las posibles arritmias del miocardio presentan una gran dependencia con la regulación del calcio en el interior de la célula. En el citoplasma de este tipo de células (cardiomiocitos) se encuentra un orgánulo denominado mitocondria, caracterizado, por una parte, porque en él se produce la mayor parte de la síntesis de energía en forma de ATP y, por otra, por su importante rol en la regulación del calcio intracelular. No obstante, aún no se ha desarrollado ningún modelo matemático del potencial de acción y corrientes iónicas en cardiomiocitos que incorpore la dinámica mitocondrial. El modelo implementado por Ainhoa Asensio en su Trabajo Fin de Grado [Asensio Orts, 2017], en el año 2017, y publicado en [Asensio y Ferrero, 2017a] y en [Asensio y Ferrero, 2017b] fue uno de los primeros en el mundo en introducir las corrientes pertenecientes a la mitocondria en un modelo de potencial de acción de cardiomiocito de ventrículo de conejo. Al obtenerse resultados significativos en dicho modelo y con el fin de hacer un análisis más exhaustivo sobre la influencia de las mitocondrias en la regulación de calcio, se decidió seguir esa línea de investigación añadiendo más posibles estados de la célula referentes a mutaciones celulares, a la influencia de fármacos sobre corrientes iónicas, a la edad o incluso a enfermedades cardíacas. Sin embargo, para llevar a cabo estos nuevos estudios, resultaba esencial desarrollar un nuevo software que automatizase y sistematizase las simulaciones. Para este fin, en el presente Trabajo Final de Máster se ha diseñado e implementado un software de automatización y procesamiento de resultados, mediante el uso de la herramienta Matlab, que facilita la obtención de múltiples simulaciones de un modelo de potencial de acción bajo diferentes condiciones de aumento o bloqueo de corrientes iónicas y de frecuencia de estimulación. El resultado de la aplicación del software a un modelo d, [CA] La funció contràctil de la fibra muscular cardíaca, i per tant les possibles arrítmies del miocardi presenten una gran dependència amb la regulació del calci a l’interior de la cèl·lula. En el citoplasma d’aquest tipues de cèl·lules (miòcits) es troba un orgànul denominat mitocòndria, caracteritzat, d’una banda, perquè en ell es produeix la major part de la síntesi d’energia en forma d’ATP i, per l’altra pel seu important paper en la regulació del calci intracel·lular. No obstant açò, encara no s’ha desenvolupat cap model matemàtic de potencial d’acció i corrents iòniques en miòcits que incorpore la dinàmica mitocondrial. El model implementat per Ainhoa Asensio en el seu treball Fi de Grau [Asensio Orts, 2017], l’any 2017, i publicat en [Asensio i Ferrero, 2017a] i en [Asensio i Ferrero, 2017b] va ser un dels primers en el món en introduir les corrents pertanyents a la mitocòndria en un model de potencial d’acció de miòcit de ventricle de conill. En obtenir-se resultats significatius en aquest model i amb la finalitat de fer una análisi més exhaustiu sobre la influència de les mitocòndries en la regulació del calci, es va decidir seguir aqueixa línia d’investigació afegint més possibles estats de la cèl·lula referents a mutacions cel·lulars, a la inflèuncia de fàrmacs sobre corrents iòniques, a l’edat o fins i tot a malalties cardíaques. No obstant açò, per a dur a terme aquests nous estudis, resultava essencial desenvolupar un nou software que automatitzara i sistematitzara les simulacions. Per a aquest fi, en el present Treball Final de Màster s’ha dissenyat i implementat un software d’automatització i processament de resultats, mitjançant l´ús de de la ferramenta Matlab, que facilita l’obtenció de múltiples simulacions d’un model de potencial d’acció baix diferents condicions d’augment o bloqueig de corrents iòniques i de freqüència d’estimulació. El resultat de l’aplicació del software a un model de potencial d’acció i corrents iòniques és una matriu de qua, [EN] The contractile function of the cardiac muscle fiber, and therefore the possible myocardial arrhythmias, are highly dependent on the calcium regulation inside the cell. In the cytoplasm of this cells type (cardiomyocytes) there is an organelle called mitochondria, characterized, on the one hand, because it produces the most of the synthesis of energy in ATP form and, on the other, because of its important role in the intracellular calcium regulation. However, no mathematical model of action potential and ionic currents in cardiomyocytes incorporating mitochondrial dynamics has yet been developed. The implemented model by Ainhoa Asensio in its Final Degree Project [Asensio Orts, 2017], in the 2017 year, and published in [Asensio and Ferrero, 2017a] and in [Asensio and Ferrero, 2017b] was one of the first in the world introducing the currents belonging to the mitochondria in a rabbit ventricle cardiomyocyte action potential model. When significant results were obtained in the said model and in order to do a more exhaustive analysis about the influence of mitochondria in the calcium regulation, it was decided to follow this line of research adding more possible cell states related to cell mutations, to the drugs influence on ionic currents, age or even heart diseases. However, to carry out these new studies, it was essential to develop a new software to automate and systematize the simulations. For this purpose, in the present Master Final Project an automation software has been designed and implemented, through the use of the Matlab tool, which facilitates the obtaining of multiple simulations of an action potential model under different conditions of increasing or blocking of ionic currents and of stimulation frequency. The result of the software application to an action potential model and ionic currents is a four-dimensional matrix which provides the four calcium preclinical biomarkers values (calcium systolic level, calcium diastolic level, time to calcium pe

[ES] La función contráctil de la fibra muscular cardíaca, y por tanto las posibles arritmias del miocardio presentan una gran dependencia con la regulación del calcio en el interior de la célula. En el citoplasma de este tipo de células (cardiomiocitos) se encuentra un orgánulo denominado mitocondria, caracterizado, por una parte, porque en él se produce la mayor parte de la síntesis de energía en forma de ATP y, por otra, por su importante rol en la regulación del calcio intracelular. No obstante, aún no se ha desarrollado ningún modelo matemático del potencial de acción y corrientes iónicas en cardiomiocitos que incorpore la dinámica mitocondrial. El modelo implementado por Ainhoa Asensio en su Trabajo Fin de Grado [Asensio Orts, 2017], en el año 2017, y publicado en [Asensio y Ferrero, 2017a] y en [Asensio y Ferrero, 2017b] fue uno de los primeros en el mundo en introducir las corrientes pertenecientes a la mitocondria en un modelo de potencial de acción de cardiomiocito de ventrículo de conejo. Al obtenerse resultados significativos en dicho modelo y con el fin de hacer un análisis más exhaustivo sobre la influencia de las mitocondrias en la regulación de calcio, se decidió seguir esa línea de investigación añadiendo más posibles estados de la célula referentes a mutaciones celulares, a la influencia de fármacos sobre corrientes iónicas, a la edad o incluso a enfermedades cardíacas. Sin embargo, para llevar a cabo estos nuevos estudios, resultaba esencial desarrollar un nuevo software que automatizase y sistematizase las simulaciones. Para este fin, en el presente Trabajo Final de Máster se ha diseñado e implementado un software de automatización y procesamiento de resultados, mediante el uso de la herramienta Matlab, que facilita la obtención de múltiples simulaciones de un modelo de potencial de acción bajo diferentes condiciones de aumento o bloqueo de corrientes iónicas y de frecuencia de estimulación. El resultado de la aplicación del software a un modelo d, [CA] La funció contràctil de la fibra muscular cardíaca, i per tant les possibles arrítmies del miocardi presenten una gran dependència amb la regulació del calci a l’interior de la cèl·lula. En el citoplasma d’aquest tipues de cèl·lules (miòcits) es troba un orgànul denominat mitocòndria, caracteritzat, d’una banda, perquè en ell es produeix la major part de la síntesi d’energia en forma d’ATP i, per l’altra pel seu important paper en la regulació del calci intracel·lular. No obstant açò, encara no s’ha desenvolupat cap model matemàtic de potencial d’acció i corrents iòniques en miòcits que incorpore la dinàmica mitocondrial. El model implementat per Ainhoa Asensio en el seu treball Fi de Grau [Asensio Orts, 2017], l’any 2017, i publicat en [Asensio i Ferrero, 2017a] i en [Asensio i Ferrero, 2017b] va ser un dels primers en el món en introduir les corrents pertanyents a la mitocòndria en un model de potencial d’acció de miòcit de ventricle de conill. En obtenir-se resultats significatius en aquest model i amb la finalitat de fer una análisi més exhaustiu sobre la influència de les mitocòndries en la regulació del calci, es va decidir seguir aqueixa línia d’investigació afegint més possibles estats de la cèl·lula referents a mutacions cel·lulars, a la inflèuncia de fàrmacs sobre corrents iòniques, a l’edat o fins i tot a malalties cardíaques. No obstant açò, per a dur a terme aquests nous estudis, resultava essencial desenvolupar un nou software que automatitzara i sistematitzara les simulacions. Per a aquest fi, en el present Treball Final de Màster s’ha dissenyat i implementat un software d’automatització i processament de resultats, mitjançant l´ús de de la ferramenta Matlab, que facilita l’obtenció de múltiples simulacions d’un model de potencial d’acció baix diferents condicions d’augment o bloqueig de corrents iòniques i de freqüència d’estimulació. El resultat de l’aplicació del software a un model de potencial d’acció i corrents iòniques és una matriu de qua, [EN] The contractile function of the cardiac muscle fiber, and therefore the possible myocardial arrhythmias, are highly dependent on the calcium regulation inside the cell. In the cytoplasm of this cells type (cardiomyocytes) there is an organelle called mitochondria, characterized, on the one hand, because it produces the most of the synthesis of energy in ATP form and, on the other, because of its important role in the intracellular calcium regulation. However, no mathematical model of action potential and ionic currents in cardiomyocytes incorporating mitochondrial dynamics has yet been developed. The implemented model by Ainhoa Asensio in its Final Degree Project [Asensio Orts, 2017], in the 2017 year, and published in [Asensio and Ferrero, 2017a] and in [Asensio and Ferrero, 2017b] was one of the first in the world introducing the currents belonging to the mitochondria in a rabbit ventricle cardiomyocyte action potential model. When significant results were obtained in the said model and in order to do a more exhaustive analysis about the influence of mitochondria in the calcium regulation, it was decided to follow this line of research adding more possible cell states related to cell mutations, to the drugs influence on ionic currents, age or even heart diseases. However, to carry out these new studies, it was essential to develop a new software to automate and systematize the simulations. For this purpose, in the present Master Final Project an automation software has been designed and implemented, through the use of the Matlab tool, which facilitates the obtaining of multiple simulations of an action potential model under different conditions of increasing or blocking of ionic currents and of stimulation frequency. The result of the software application to an action potential model and ionic currents is a four-dimensional matrix which provides the four calcium preclinical biomarkers values (calcium systolic level, calcium diastolic level, time to calcium pe

O acúmulo de ferro no cérebro tem sido observado tanto no envelhecimento normal quanto em muitas doenças neurodegenerativas. Nossos estudos anteriores mostraram que a sobrecarga de ferro cerebral resulta em déficits de memória persistentes, acompanhados por estresse oxidativo. A elevada taxa metabólica do sistema nervoso torna as mitocôndrias essenciais para células nervosas. Essas organelas têm como função o controle da homeostasia do ferro em seu interior e o gerenciamento das espécies reativas de oxigênio. Uma vez que ocorre desregulação nessas atividades, o funcionamento das mitocôndrias fica comprometido, resultando em falhas no aporte energético principalmente para as sinapses. O funcionamento inadequado de circuitos neurais pode culminar na ativação de vias de morte celular, uma característica bastante associada às doenças neurodegenerativas. No presente trabalho analisamos os efeitos da sobrecarga de ferro neonatal sobre as deleções no complexo I do DNA mitocondrial; sobre os mecanismos de metilação e hidroximetilação do DNA mitocondrial; sobre proteínas envolvidas no metabolismo de ferro mitocondrial (Ferritina mitocondrial e Mitoferrina 2), sobre a atividade enzimática da Succinato desidrogenase e Creatina quinase, envolvidas no aporte energético para as células; e sobre proteínas envolvidas nas vias apoptóticas, como a Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Citocromo c, APAF1 e PARP em hipocampos de ratos adultos. Além disso, investigamos os efeitos do canabidiol (CBD), principal componente não psicotrópico da Cannabis sativa, na reversão dos efeitos induzidos pelo ferro sobre todos os parâmetros analisados. Ratos machos receberam veículo ou ferro carbonila (30 mg/kg) do 12º ao 14º dia pós-natal e na idade adulta foram tratados com veículo ou CBD (10 mg/kg) durante 14 dias. O tratamento com ferro induziu o aumento das deleções do DNA mitocondrial e das proteínas envolvidas na via intrínseca da apoptose, enquanto induziu a redução de metilação e hidroximetilação, Brain iron accumulation has been observed both in normal aging and in many neurodegenerative diseases. In previous studies, we have described that brain iron overload results in persistent memory deficits, accompanied by oxidative stress. The high metabolic rate of the nervous system makes mitochondria essential for nerve cells. These organelles control iron homeostasis in its interior and the management of reactive oxygen species. When deregulation in these activities occurs, mitochondrial functioning is compromised, resulting in failures in the energy supply mainly for the synapses. Inadequate functioning of neural circuits may culminate in the activation of cell death pathways, a feature strongly associated with neurodegenerative diseases. In the present study we analyzed the effects of neonatal iron overload on complex I deletions in the mitochondrial DNA ; on methylation and hydroxymethylation of mitochondrial DNA; on mitochondrial proteins involved on iron homeostasis, on the enzymatic activity of Succinate Dehydrogenase and Creatine Kinase, enzymes involved in the cells energy supply; and on proteins involved in apoptotic pathways, such as Caspase 8, Caspase 9, Caspase 3, Cytochrome c, APAF1, and PARP in the hippocampus of adult rats. In addition, we investigated the effects of cannabidiol (CBD), the main non-psychotropic component of Cannabis sativa, in reversing iron-induced effects on all parameters analyzed. Male rats received vehicle or iron carbonyl (30 mg / kg) from the 12th to the 14th postnatal day and were treated with vehicle or CBD (10mg / kg) for 14 days in adulthood. Iron treatment induced increased deletions of mitochondrial DNA and expression of proteins involved in apoptosis, while induced reductions of methylation and hydroxymethylation, enzymatic activity and mitochondrial ferritin, an iron storage protein. CBD reversed iron-induced effects, recovering hydroxymethylation levels, mitochondrial ferritin, Succinate dehydrogenase activity, apop

Producción Científica, Tumor cells undergo a critical remodeling of intracellular Ca2+ homeostasis that contribute to important cancer hallmarks. Store-operated Ca2+ entry (SOCE), a Ca2+ entry pathway modulated by mitochondria, is dramatically enhanced in colon cancer cells. In addition, most cancer cells display the Warburg effect, a metabolic switch from mitochondrial metabolism to glycolysis that provides survival advantages. Accordingly, we investigated mitochondria control of store-operated currents (SOCs) in two cell lines previously selected for representing human normal colonic cells and colon cancer cells. We found that, in normal cells, mitochondria are important for SOCs activity but they are unable to prevent current inactivation. In contrast, in colon cancer cells, mitochondria are dispensable for SOCs activation but are able to prevent the slow, Ca2+-dependent inactivation of SOCs. This effect is associated to increased ability of tumor cell mitochondria to take up Ca2+ due to increased mitochondrial potential (ΔΨ) linked to the Warburg effect. Consistently with this view, selected non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) depolarize mitochondria, inhibit mitochondrial Ca2+ uptake and promote SOC inactivation, leading to inhibition of both SOCE and cancer cell proliferation. Thus, mitochondria sustain store-operated currents in colon cancer cells but not in normal colonic cells and this effect is counteracted by selected NSAIDs providing a mechanism for cancer chemoprevention., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (grant BFU2015-70131R), Junta de Castilla y León (grant VA145U13)

Producción Científica, Mitochondrial Ca2+ homeostasis is crucial for regulating vital functions such as respiration or apoptosis. Targeted aequorins are excellent probes to measure subcellular Ca2+. Ca2+ concentration in mitochondria ([Ca2+]M) is low at rest (about 10−7 M) and can increase to the micromolar or even approach the millimolar range, upon cell activation. Here we describe a new quantitative luminescent protocol to directly measure mitochondrial Ca2+ uptake, optimized for high throughput. The sensitivity of the method allows detection of changes in either the capacity or the affinity of mitochondrial Ca2+ transport., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (Project BFU2014-534698P), Instituto de Salud Carlos III (RD16/0011/0003)

Producción Científica, Mitochondrial Ca2+ homeostasis is crucial for regulating vital functions such as respiration or apoptosis. Targeted aequorins are excellent probes to measure subcellular Ca2+. Ca2+ concentration in mitochondria ([Ca2+]M) is low at rest (about 10−7 M) and can increase to the micromolar or even approach the millimolar range, upon cell activation. Here we describe a new quantitative luminescent protocol to directly measure mitochondrial Ca2+ uptake, optimized for high throughput. The sensitivity of the method allows detection of changes in either the capacity or the affinity of mitochondrial Ca2+ transport., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (Project BFU2014-534698P), Instituto de Salud Carlos III (RD16/0011/0003)

[ES] La regulación de calcio intracelular en cardiomiocitos tiene un rol esencial en la fisiología del corazón, debido a su relación directa con la capacidad contráctil de las fibras cardíacas y con su participación en mecanismos de arritmogénesis. Las mitocondrias presentes en los cardiomiocitos tienen una función crucial tanto en la producción de ATP como en la regulación de calcio en el interior de estas células. Sin embargo, actualmente solo unos pocos modelos computacionales de potencial de acción incluyen las mitocondrias. El presente trabajo de fin de grado se centra en el desarrollo de un modelo de potencial de acción que incluya a estos orgánulos, así como de una herramienta informática que permita la simulación computacional en Matlab®. El modelo implementado se adaptó del modelo de mitocondria de linfocitos B de Kim y otros (2012) a miocitos ventriculares de conejo, utilizando los datos experimentales obtenidos en la investigación de Lu y otros (2013). El modelado de las mitocondrias se introdujo en el modelo de potencial de acción de miocito ventricular de conejo de Shannon y otros (2004). Mediante el modelo computacional implementado se realizaron simulaciones en Matlab® en las que se compararon los resultados obtenidos mediante ambos modelos (el modelo inicial que no incluye las mitocondrias y el nuevo modelo que sí incluye las mitocondrias), así como simulaciones en las que se alteraron determinadas corrientes iónicas presentes en la célula con el objetivo de simular alteraciones debidas a intervenciones farmacológicas y/o mutaciones en la célula. Por último, se realizó un análisis de sensibilidad multifactorial de los resultados obtenidos en las diversas simulaciones para determinados biomarcadores de calcio con el objetivo de estudiar la influencia de las mitocondrias en la regulación intracelular de calcio., [EN] Intracellular calcium regulation in cardiomyocytes has an essential role in the heart physiology, due to its direct relationship with the contractile capacity of the cardiac fibers and its participation in arrithmogenesis mechanism. Cardiomyocyte mitochondria have a crucial function in ATP production and intracellular calcium regulation. However, actually only a few computational models include mitochondria. This thesis is focused on the development of an action potential model that includes these organelles, as well as a computational tool to simulate in Matlab®. The implemented model was adapted from the mitochondria model by Kim y otros (2012) to ventricular rabbit cardiomyocytes, using experimental data by Lu y otros (2013). The mitochondrial formulation was introduced in the action potential model of ventricular rabbit cardiomyocytes by Shannon et al. (2004). We conducted simulations in Matlab® using the implemented computational model. The results obtained using both models (the initial model without mitochondria and the new model with mitochondria) where compared, as well as the results of simulations where some ionic currents where altered to simulate pharmacological interventions and/or effect of mutations. Finally, we did a multifactorial analysis of the results obtained in the simulations for calcium biomarkers in order to study the influence of mitochondria in the intracellular calcium regulation.

Producción Científica, Mitochondrial Ca2+ homeostasis is crucial for regulating vital functions such as respiration or apoptosis. Targeted aequorins are excellent probes to measure subcellular Ca2+. Ca2+ concentration in mitochondria ([Ca2+]M) is low at rest (about 10−7 M) and can increase to the micromolar or even approach the millimolar range, upon cell activation. Here we describe a new quantitative luminescent protocol to directly measure mitochondrial Ca2+ uptake, optimized for high throughput. The sensitivity of the method allows detection of changes in either the capacity or the affinity of mitochondrial Ca2+ transport., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (Project BFU2014-534698P), Instituto de Salud Carlos III (RD16/0011/0003)

[ES] La regulación de calcio intracelular en cardiomiocitos tiene un rol esencial en la fisiología del corazón, debido a su relación directa con la capacidad contráctil de las fibras cardíacas y con su participación en mecanismos de arritmogénesis. Las mitocondrias presentes en los cardiomiocitos tienen una función crucial tanto en la producción de ATP como en la regulación de calcio en el interior de estas células. Sin embargo, actualmente solo unos pocos modelos computacionales de potencial de acción incluyen las mitocondrias. El presente trabajo de fin de grado se centra en el desarrollo de un modelo de potencial de acción que incluya a estos orgánulos, así como de una herramienta informática que permita la simulación computacional en Matlab®. El modelo implementado se adaptó del modelo de mitocondria de linfocitos B de Kim y otros (2012) a miocitos ventriculares de conejo, utilizando los datos experimentales obtenidos en la investigación de Lu y otros (2013). El modelado de las mitocondrias se introdujo en el modelo de potencial de acción de miocito ventricular de conejo de Shannon y otros (2004). Mediante el modelo computacional implementado se realizaron simulaciones en Matlab® en las que se compararon los resultados obtenidos mediante ambos modelos (el modelo inicial que no incluye las mitocondrias y el nuevo modelo que sí incluye las mitocondrias), así como simulaciones en las que se alteraron determinadas corrientes iónicas presentes en la célula con el objetivo de simular alteraciones debidas a intervenciones farmacológicas y/o mutaciones en la célula. Por último, se realizó un análisis de sensibilidad multifactorial de los resultados obtenidos en las diversas simulaciones para determinados biomarcadores de calcio con el objetivo de estudiar la influencia de las mitocondrias en la regulación intracelular de calcio., [EN] Intracellular calcium regulation in cardiomyocytes has an essential role in the heart physiology, due to its direct relationship with the contractile capacity of the cardiac fibers and its participation in arrithmogenesis mechanism. Cardiomyocyte mitochondria have a crucial function in ATP production and intracellular calcium regulation. However, actually only a few computational models include mitochondria. This thesis is focused on the development of an action potential model that includes these organelles, as well as a computational tool to simulate in Matlab®. The implemented model was adapted from the mitochondria model by Kim y otros (2012) to ventricular rabbit cardiomyocytes, using experimental data by Lu y otros (2013). The mitochondrial formulation was introduced in the action potential model of ventricular rabbit cardiomyocytes by Shannon et al. (2004). We conducted simulations in Matlab® using the implemented computational model. The results obtained using both models (the initial model without mitochondria and the new model with mitochondria) where compared, as well as the results of simulations where some ionic currents where altered to simulate pharmacological interventions and/or effect of mutations. Finally, we did a multifactorial analysis of the results obtained in the simulations for calcium biomarkers in order to study the influence of mitochondria in the intracellular calcium regulation.

[ES] La regulación de calcio intracelular en cardiomiocitos tiene un rol esencial en la fisiología del corazón, debido a su relación directa con la capacidad contráctil de las fibras cardíacas y con su participación en mecanismos de arritmogénesis. Las mitocondrias presentes en los cardiomiocitos tienen una función crucial tanto en la producción de ATP como en la regulación de calcio en el interior de estas células. Sin embargo, actualmente solo unos pocos modelos computacionales de potencial de acción incluyen las mitocondrias. El presente trabajo de fin de grado se centra en el desarrollo de un modelo de potencial de acción que incluya a estos orgánulos, así como de una herramienta informática que permita la simulación computacional en Matlab®. El modelo implementado se adaptó del modelo de mitocondria de linfocitos B de Kim y otros (2012) a miocitos ventriculares de conejo, utilizando los datos experimentales obtenidos en la investigación de Lu y otros (2013). El modelado de las mitocondrias se introdujo en el modelo de potencial de acción de miocito ventricular de conejo de Shannon y otros (2004). Mediante el modelo computacional implementado se realizaron simulaciones en Matlab® en las que se compararon los resultados obtenidos mediante ambos modelos (el modelo inicial que no incluye las mitocondrias y el nuevo modelo que sí incluye las mitocondrias), así como simulaciones en las que se alteraron determinadas corrientes iónicas presentes en la célula con el objetivo de simular alteraciones debidas a intervenciones farmacológicas y/o mutaciones en la célula. Por último, se realizó un análisis de sensibilidad multifactorial de los resultados obtenidos en las diversas simulaciones para determinados biomarcadores de calcio con el objetivo de estudiar la influencia de las mitocondrias en la regulación intracelular de calcio., [EN] Intracellular calcium regulation in cardiomyocytes has an essential role in the heart physiology, due to its direct relationship with the contractile capacity of the cardiac fibers and its participation in arrithmogenesis mechanism. Cardiomyocyte mitochondria have a crucial function in ATP production and intracellular calcium regulation. However, actually only a few computational models include mitochondria. This thesis is focused on the development of an action potential model that includes these organelles, as well as a computational tool to simulate in Matlab®. The implemented model was adapted from the mitochondria model by Kim y otros (2012) to ventricular rabbit cardiomyocytes, using experimental data by Lu y otros (2013). The mitochondrial formulation was introduced in the action potential model of ventricular rabbit cardiomyocytes by Shannon et al. (2004). We conducted simulations in Matlab® using the implemented computational model. The results obtained using both models (the initial model without mitochondria and the new model with mitochondria) where compared, as well as the results of simulations where some ionic currents where altered to simulate pharmacological interventions and/or effect of mutations. Finally, we did a multifactorial analysis of the results obtained in the simulations for calcium biomarkers in order to study the influence of mitochondria in the intracellular calcium regulation.

Producción Científica, Mitochondrial Ca2+ homeostasis is crucial for regulating vital functions such as respiration or apoptosis. Targeted aequorins are excellent probes to measure subcellular Ca2+. Ca2+ concentration in mitochondria ([Ca2+]M) is low at rest (about 10−7 M) and can increase to the micromolar or even approach the millimolar range, upon cell activation. Here we describe a new quantitative luminescent protocol to directly measure mitochondrial Ca2+ uptake, optimized for high throughput. The sensitivity of the method allows detection of changes in either the capacity or the affinity of mitochondrial Ca2+ transport., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (Project BFU2014-534698P), Instituto de Salud Carlos III (RD16/0011/0003)

Producción Científica, Aging is associated to cognitive decline and susceptibility to neuron death, two processes related recently to subcellular Ca2+ homeostasis. Memory storage relies on mushroom spines stability that depends on store-operated Ca2 + entry (SOCE). In addition, Ca2+ transfer from endoplasmic reticulum (ER) to mitochondria sustains energy production but mitochondrial Ca2+ overload promotes apoptosis. We have addressed whether SOCE and ER-mitochondria Ca2+ transfer are influenced by culture time in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. We found that short-term cultured neurons show large SOCE, low Ca2+ store content and no functional coupling between ER and mitochondria. In contrast, in long-term cultures reflecting aging neurons, SOCE is essentially lost, Stim1 and Orai1 are downregulated, Ca2+ stores become overloaded, Ca2+ release is enhanced, expression of the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) increases and most Ca2 + released from the ER is transferred to mitochondria. These results suggest that neuronal aging is associated to increased ER-mitochondrial cross talking and loss of SOCE. This subcellular Ca2+ remodeling might contribute to cognitive decline and susceptibility to neuron cell death in the elderly., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (grants BFU2012-37146 and BFU2015-70131R), Junta de Castilla y León (grants VA145U13 and BIO/VA33/13)

Producción Científica, The Fas-activated serine/threonine kinase (FASTK) family of proteins has recently emerged as a central regulator of mitochondrial gene expression through the function of an unusual RNA-binding domain named RAP (for RNA-binding domain abundant in Apicomplexans), shared by all six members of the family. Here we describe the role of one of the less characterized members, FASTKD3, in mitochondrial RNA metabolism. First, we show that, in contrast to FASTK, FASTKD2, and FASTKD5, FASTKD3 does not localize in mitochondrial RNA granules, which are sites of processing and maturation of mtRNAs and ribosome biogenesis. Second, we generated FASTKD3 homozygous knock-out cell lines by homologous recombination and observed that the absence of FASTKD3 resulted in increased steady-state levels and half-lives of a subset of mature mitochondrial mRNAs: ND2, ND3, CYTB, COX2, and ATP8/6. No aberrant processing of RNA precursors was observed. Rescue experiments demonstrated that RAP domain is required for FASTKD3 function in mRNA stability. Besides, we describe that FASTKD3 is required for efficient COX1 mRNA translation without altering mRNA levels, which results in a decrease in the steady-state levels of COX1 protein. This finding is associated with reduced mitochondrial complex IV assembly and activity. Our observations suggest that the function of this family of proteins goes beyond RNA processing and ribosome assembly and includes RNA stability and translation regulation within mitochondria., Junta de Castilla y León (grants BIO/ VA20/15 and BIO/VA21/15), Swiss National Science Foundation (grant 310030B_160257/1)

La captación de calcio mitocondrial esta regulada por diferentes proteínas entre las que se encuentran las formadoras del complejo del uniportador de calcio mitocondrial, MCU, MICU1 y MICU2. MCU es la proteína formadora del poro del canal mientras que MICU1 y MICU2 son proteínas reguladoras. En esta tesis se ha estudiado el papel específico de estas dos proteínas reguladoras mediante la generación de clones estables con estas proteínas silenciadas. Estos clones han sido utilizados para estudiar la dinámica de calcio celular con Aequorina, una fotoproteína sensible a calcio. De este modo se han realizado medidas de calcio en mitocondria, retículo endoplásmico y citosol que han permitido encontrar la función especifica de MICU1 y MICU2 en la captación de calcio mitocondrial. MICU1 actúa como sensor de calcio cuando la concentración de calcio citosólico es baja y como activador del canal cuando la concentración del ion es alta. En cambio MICU2 actual como inhibidor del canal cuando la concentración de calcio en el citosol es baja., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología

Producción Científica, Aging is associated to cognitive decline and susceptibility to neuron death, two processes related recently to subcellular Ca2+ homeostasis. Memory storage relies on mushroom spines stability that depends on store-operated Ca2 + entry (SOCE). In addition, Ca2+ transfer from endoplasmic reticulum (ER) to mitochondria sustains energy production but mitochondrial Ca2+ overload promotes apoptosis. We have addressed whether SOCE and ER-mitochondria Ca2+ transfer are influenced by culture time in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. We found that short-term cultured neurons show large SOCE, low Ca2+ store content and no functional coupling between ER and mitochondria. In contrast, in long-term cultures reflecting aging neurons, SOCE is essentially lost, Stim1 and Orai1 are downregulated, Ca2+ stores become overloaded, Ca2+ release is enhanced, expression of the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) increases and most Ca2 + released from the ER is transferred to mitochondria. These results suggest that neuronal aging is associated to increased ER-mitochondrial cross talking and loss of SOCE. This subcellular Ca2+ remodeling might contribute to cognitive decline and susceptibility to neuron cell death in the elderly., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (grants BFU2012-37146 and BFU2015-70131R), Junta de Castilla y León (grants VA145U13 and BIO/VA33/13)

Producción Científica, The Fas-activated serine/threonine kinase (FASTK) family of proteins has recently emerged as a central regulator of mitochondrial gene expression through the function of an unusual RNA-binding domain named RAP (for RNA-binding domain abundant in Apicomplexans), shared by all six members of the family. Here we describe the role of one of the less characterized members, FASTKD3, in mitochondrial RNA metabolism. First, we show that, in contrast to FASTK, FASTKD2, and FASTKD5, FASTKD3 does not localize in mitochondrial RNA granules, which are sites of processing and maturation of mtRNAs and ribosome biogenesis. Second, we generated FASTKD3 homozygous knock-out cell lines by homologous recombination and observed that the absence of FASTKD3 resulted in increased steady-state levels and half-lives of a subset of mature mitochondrial mRNAs: ND2, ND3, CYTB, COX2, and ATP8/6. No aberrant processing of RNA precursors was observed. Rescue experiments demonstrated that RAP domain is required for FASTKD3 function in mRNA stability. Besides, we describe that FASTKD3 is required for efficient COX1 mRNA translation without altering mRNA levels, which results in a decrease in the steady-state levels of COX1 protein. This finding is associated with reduced mitochondrial complex IV assembly and activity. Our observations suggest that the function of this family of proteins goes beyond RNA processing and ribosome assembly and includes RNA stability and translation regulation within mitochondria., Junta de Castilla y León (grants BIO/ VA20/15 and BIO/VA21/15), Swiss National Science Foundation (grant 310030B_160257/1)

La captación de calcio mitocondrial esta regulada por diferentes proteínas entre las que se encuentran las formadoras del complejo del uniportador de calcio mitocondrial, MCU, MICU1 y MICU2. MCU es la proteína formadora del poro del canal mientras que MICU1 y MICU2 son proteínas reguladoras. En esta tesis se ha estudiado el papel específico de estas dos proteínas reguladoras mediante la generación de clones estables con estas proteínas silenciadas. Estos clones han sido utilizados para estudiar la dinámica de calcio celular con Aequorina, una fotoproteína sensible a calcio. De este modo se han realizado medidas de calcio en mitocondria, retículo endoplásmico y citosol que han permitido encontrar la función especifica de MICU1 y MICU2 en la captación de calcio mitocondrial. MICU1 actúa como sensor de calcio cuando la concentración de calcio citosólico es baja y como activador del canal cuando la concentración del ion es alta. En cambio MICU2 actual como inhibidor del canal cuando la concentración de calcio en el citosol es baja., Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Fisiología

Producción Científica, Aging is associated to cognitive decline and susceptibility to neuron death, two processes related recently to subcellular Ca2+ homeostasis. Memory storage relies on mushroom spines stability that depends on store-operated Ca2 + entry (SOCE). In addition, Ca2+ transfer from endoplasmic reticulum (ER) to mitochondria sustains energy production but mitochondrial Ca2+ overload promotes apoptosis. We have addressed whether SOCE and ER-mitochondria Ca2+ transfer are influenced by culture time in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging. We found that short-term cultured neurons show large SOCE, low Ca2+ store content and no functional coupling between ER and mitochondria. In contrast, in long-term cultures reflecting aging neurons, SOCE is essentially lost, Stim1 and Orai1 are downregulated, Ca2+ stores become overloaded, Ca2+ release is enhanced, expression of the mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) increases and most Ca2 + released from the ER is transferred to mitochondria. These results suggest that neuronal aging is associated to increased ER-mitochondrial cross talking and loss of SOCE. This subcellular Ca2+ remodeling might contribute to cognitive decline and susceptibility to neuron cell death in the elderly., Ministerio de Economía, Industria y Competitividad (grants BFU2012-37146 and BFU2015-70131R), Junta de Castilla y León (grants VA145U13 and BIO/VA33/13)