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Myoblast fusion is essential for the formation of multinucleated muscle fibers and is promoted by transient changes in the plasma membrane lipid distribution. However, little is known about the lipid transporters regulating these dynamic changes. Here, we show that proliferating myoblasts exhibit an aminophospholipid flippase activity that is downregulated during differentiation. Deletion of the P4-ATPase flippase subunit CDC50A (also known as TMEM30A) results in loss of the aminophospholipid flippase activity and compromises actin remodeling, RAC1 GTPase membrane targeting and cell fusion. In contrast, deletion of the P4-ATPase ATP11A affects aminophospholipid uptake without having a strong impact on cell fusion. Our results demonstrate that myoblast fusion depends on CDC50A and may involve multiple CDC50A-dependent P4-ATPases that help to regulate actin remodeling.

Myoblast fusion is essential for the formation of multinucleated muscle fibers and is promoted by transient changes in the plasma membrane lipid distribution. However, little is known about the lipid transporters regulating these dynamic changes. Here, we show that proliferating myoblasts exhibit an aminophospholipid flippase activity that is downregulated during differentiation. Deletion of the P4-ATPase flippase subunit CDC50A (also known as TMEM30A) results in loss of the aminophospholipid flippase activity and compromises actin remodeling, RAC1 GTPase membrane targeting and cell fusion. In contrast, deletion of the P4-ATPase ATP11A affects aminophospholipid uptake without having a strong impact on cell fusion. Our results demonstrate that myoblast fusion depends on CDC50A and may involve multiple CDC50A-dependent P4-ATPases that help to regulate actin remodeling.

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Prozessen der Lipidanreicherung in der Gallenflüssigkeit. Leberzellen (Hepatozyten) sind polare Zellen, die für die Sekretion der Gallenflüssigkeit verantwortlich sind. Die Anbindung an den Blutkreislauf besteht über die basolaterale Membran. Durch die gegenüberliegende, sogenannte apikale Membran werden zwischen benachbarten Leberzellen tubuläre Stukturen (bile canaliculi, BC) gebildet, in die die Gallenflüssigkeit abgesondert wird. Daher wird diese Membran auch als Canalicularmembran (CM) bezeichnet. Die Gallenflüssigkeit besitzt hinsichtlich ihrer Lipidzusammensetzung eine bemerkenswerte Spezifität. Obwohl der Anteil von Phosphatidylcholin (PC) an den Phospholipiden der CM nur 35% beträgt, macht es 95% der Phospholipide der Gallenflüssigkeit aus. Mögliche Mechanismen, die zur Spezifität der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit führen, werden untersucht und diskutiert. Phospholipide werden aus der äußeren Lamelle der CM durch Gallensalze herausgelöst. Die Wechselwirkung von Gallensalzen mit Phospholipiden ist kopfgruppenunspezifisch. Eine Solubilisierung von Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) durch Gallensalze könnte durch die Wirkung einer Aminophospholipidtranslokase (APLT) verhindert werden, die diese Lipide aktiv auf die zytoplasmatische Seite der Membran pumpt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Versuche durchgeführt, um die Aktivität einer APLT in der CM nachzuweisen. Dabei wurde die Hepatomazelllinie HepG2 eingesetzt, die in der Lage ist, Canalicularvakuolen (BC) zu bilden. Zunächst wurde die Einwärtsbewegung einer Reihe fluoreszierender Lipidanaloga mit unterschiedlicher Affinität zur APLT charakterisiert. Dies geschah an der basolateralen Membran von HepG2 Zellen, wo eine APLT-Aktivität bereits bekannt ist. Die Aufnahme geeigneter APLT-Substrate konnte durch den APLT-Inhibitor Suramin reduziert werden. Ebenso wurde die Affinität eines Paares von PS-Analoga bestätigt, This thesis addresses the molecular processes which are important in the formation of bile fluid. The polar liver cells (hepatocytes) secrete the bile fluid at their apical (canalicular) membrane into tubular bile canaliculi (BC) which are formed between adjacent cells. The basolateral membrane of hepatocytes faces the blood vessel. Bile fluid possesses a remarkable specificity regarding its lipid composition. Even though phosphatidylcholine (PC) contributes to only 35% of the phospholipids in the canalicular membrane, it constitutes 95% of biliary phospholipids. In this thesis possible mechanism that might lead to the specificity in biliary lipid secretion are analysed and discussed. Phospholipids are secreted from the outer leaflet of the canalicular membrane into bile by the effect of bile salts. The interaction of bile salts with phospholipids was shown to be independent of the phospholipid headgroup. Solubilisation of phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) by bile salts could be prevented by the action of an aminophospholipid translocase (APLT) which actively pumps these lipids to the cytoplasmic leaflet of the membrane. Experiments to demonstrate a canalicular APLT activity were performed to proof this hypothesis. For this, the hepatoma cell line HepG2 which is able to polarise and to form a canalicular vacuole (BC) was utilised. A panel of fluorescent lipid analogues with different affinities to this transporter was used and first characterised at the basolateral membrane of HepG2 cells, where an APLT activity was already demonstrated. The rapid APLT mediated uptake of aminophospholipid analogues representing appropriate substrates of APLT was reduced by applying the inhibitor suramin. The affinity of a pair of PS analogues with diether NBD-PS as a poor APLT substrate and diacyl NBD-PS representing a suitable substrate was confirmed. In a next step the enrichment of the same phospholipid analogues in the BC was investigated. There was a str

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Prozessen der Lipidanreicherung in der Gallenflüssigkeit. Leberzellen (Hepatozyten) sind polare Zellen, die für die Sekretion der Gallenflüssigkeit verantwortlich sind. Die Anbindung an den Blutkreislauf besteht über die basolaterale Membran. Durch die gegenüberliegende, sogenannte apikale Membran werden zwischen benachbarten Leberzellen tubuläre Stukturen (bile canaliculi, BC) gebildet, in die die Gallenflüssigkeit abgesondert wird. Daher wird diese Membran auch als Canalicularmembran (CM) bezeichnet. Die Gallenflüssigkeit besitzt hinsichtlich ihrer Lipidzusammensetzung eine bemerkenswerte Spezifität. Obwohl der Anteil von Phosphatidylcholin (PC) an den Phospholipiden der CM nur 35% beträgt, macht es 95% der Phospholipide der Gallenflüssigkeit aus. Mögliche Mechanismen, die zur Spezifität der Lipidsekretion in die Gallenflüssigkeit führen, werden untersucht und diskutiert. Phospholipide werden aus der äußeren Lamelle der CM durch Gallensalze herausgelöst. Die Wechselwirkung von Gallensalzen mit Phospholipiden ist kopfgruppenunspezifisch. Eine Solubilisierung von Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) durch Gallensalze könnte durch die Wirkung einer Aminophospholipidtranslokase (APLT) verhindert werden, die diese Lipide aktiv auf die zytoplasmatische Seite der Membran pumpt. Zur Überprüfung dieser Hypothese wurden Versuche durchgeführt, um die Aktivität einer APLT in der CM nachzuweisen. Dabei wurde die Hepatomazelllinie HepG2 eingesetzt, die in der Lage ist, Canalicularvakuolen (BC) zu bilden. Zunächst wurde die Einwärtsbewegung einer Reihe fluoreszierender Lipidanaloga mit unterschiedlicher Affinität zur APLT charakterisiert. Dies geschah an der basolateralen Membran von HepG2 Zellen, wo eine APLT-Aktivität bereits bekannt ist. Die Aufnahme geeigneter APLT-Substrate konnte durch den APLT-Inhibitor Suramin reduziert werden. Ebenso wurde die Affinität eines Paares von PS-Analoga bestätigt, This thesis addresses the molecular processes which are important in the formation of bile fluid. The polar liver cells (hepatocytes) secrete the bile fluid at their apical (canalicular) membrane into tubular bile canaliculi (BC) which are formed between adjacent cells. The basolateral membrane of hepatocytes faces the blood vessel. Bile fluid possesses a remarkable specificity regarding its lipid composition. Even though phosphatidylcholine (PC) contributes to only 35% of the phospholipids in the canalicular membrane, it constitutes 95% of biliary phospholipids. In this thesis possible mechanism that might lead to the specificity in biliary lipid secretion are analysed and discussed. Phospholipids are secreted from the outer leaflet of the canalicular membrane into bile by the effect of bile salts. The interaction of bile salts with phospholipids was shown to be independent of the phospholipid headgroup. Solubilisation of phosphatidylserine (PS) and phosphatidylethanolamine (PE) by bile salts could be prevented by the action of an aminophospholipid translocase (APLT) which actively pumps these lipids to the cytoplasmic leaflet of the membrane. Experiments to demonstrate a canalicular APLT activity were performed to proof this hypothesis. For this, the hepatoma cell line HepG2 which is able to polarise and to form a canalicular vacuole (BC) was utilised. A panel of fluorescent lipid analogues with different affinities to this transporter was used and first characterised at the basolateral membrane of HepG2 cells, where an APLT activity was already demonstrated. The rapid APLT mediated uptake of aminophospholipid analogues representing appropriate substrates of APLT was reduced by applying the inhibitor suramin. The affinity of a pair of PS analogues with diether NBD-PS as a poor APLT substrate and diacyl NBD-PS representing a suitable substrate was confirmed. In a next step the enrichment of the same phospholipid analogues in the BC was investigated. There was a str